Detta protokoll beskriver extraktion och visualisering av aggregerade och lösliga proteiner från Escherichia coli efter behandling med en proteotoxisk antimikrobiell. Enligt detta förfarande möjliggör en kvalitativ jämförelse av proteinaggregatbildning in vivo i olika bakteriestammar och/eller mellan behandlingar.
Exponeringen av levande organismer för miljömässiga och cellulära påfrestningar orsakar ofta störningar i proteinhomeostas och kan leda till proteinaggregering. Ackumulering av proteinaggregat i bakterieceller kan leda till betydande förändringar i det cellulära fenotypiska beteendet, inklusive en minskning av tillväxthastigheter, stressresistens och virulens. Flera experimentella förfaranden finns för undersökning av dessa stressor-medierade fenotyper. Detta dokument beskriver en optimerad analys för extraktion och visualisering av aggregerade och lösliga proteiner från olika Escherichia coli stammar efter behandling med en silver-ruthenium-innehållande antimikrobiell. Denna förening är känd för att generera reaktiva syrearter och orsakar utbredd proteinaggregering.
Metoden kombinerar en centrifugeringsbaserad separation av proteinaggregat och lösliga proteiner från behandlade och obehandlade celler med efterföljande separation och visualisering genom natriumdidcylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) och Coomassie färgning. Detta tillvägagångssätt är enkelt, snabbt och möjliggör en kvalitativ jämförelse av proteinaggregatbildning i olika E. coli-stammar. Metoden har ett brett spektrum av tillämpningar, inklusive möjligheten att undersöka effekten av andra proteotoxiska antimikrobiella medel på in vivo-proteinaggregering i ett brett spektrum av bakterier. Dessutom kan protokollet användas för att identifiera gener som bidrar till ökad resistens mot proteotoxiska ämnen. Gelband kan användas för efterföljande identifiering av proteiner som är särskilt benägna att aggregering.
Bakterier utsätts oundvikligen för en myriad av miljöbelastningar, inklusive lågt pH-kort (t.ex. i däggdjursmagen)1,2,reaktivt syre och klorarter (ROS/RCS) (t.ex. under oxidativ bristning i fagocyter)3,4,5, förhöjda temperaturer (t.ex. i varma källor eller under värmechock)6,7och potenta antimikrobiella medel (t.ex. AGXX som används i detta protokoll)8. Proteiner är särskilt sårbara för någon av dessa stressfaktorer, och exponering kan prova protein som inte/felveckas som sedan frön aggregering. Alla organismer använder skyddssystem som gör det möjligt för dem att klara av protein felvecka9. Allvarlig stress kan dock överväldiga proteinkvalitetskontrollmaskineriet och störa proteinstrukturen och/eller tertiärstrukturen hos proteiner, vilket i slutändan inaktiverar proteiner. Som en följd av detta kan proteinaggregat allvarligt försämra kritiska cellulära funktioner som krävs för bakterietillväxt och överlevnad, stressresistens och virulens10. Därför är forskning med fokus på proteinaggregering och dess konsekvenser i bakterier ett relevant ämne på grund av dess potentiella inverkan på infektionssjukdomsbekämpning.
Värmeinducerat protein som utvecklas och aggregering är ofta reversibla7. Däremot kan andra proteotoxiska påfrestningar, såsom oxidativ stress, orsaka irreversibla proteinmodifieringar genom oxidation av specifika aminosyra sidokedjor som resulterar i protein un-/felfolding och så småningom proteinaggregering4. Stressinducerad bildning av olösliga proteinaggregat har studerats utförligt i samband med molekylära förkläde och deras skyddande funktioner i jäst och bakterier11,12,13. Flera protokoll har publicerats som använder en mängd biokemiska tekniker för isolering och analys av olösliga proteinaggregat14,15,16,17. De befintliga protokollen har huvudsakligen använts för att studera bakteriell proteinaggregering vid värmechock och/eller identifiering av molekylära förkläde. Även om dessa protokoll verkligen har varit ett framsteg på fältet, finns det några stora olägenheter i de experimentella förfarandena eftersom de kräver (i) en stor bakteriekulturell volym på upp till 10 L14,17, (ii) komplicerade fysiska störningsprocesser, inklusive användning av cellstörare, fransk press och / eller ultraljudsbehandling14,15,17eller iii) tidskrävande upprepade tvätt- och inkubationssteg15,16,17.
Detta dokument beskriver ett modifierat protokoll som syftar till att ta itu med begränsningarna i tidigare metoder och möjliggör analys av mängden proteinaggregat som bildas i två olika Escherichia coli-stammar efter behandling med en proteotoxisk antimikrobiell ytbeläggning. Beläggningen består av metall-silver (Ag) och ruthenium (Ru)-konditionerad med askorbinsyra, och dess antimikrobiella aktivitet uppnås genom generering av reaktiva syrearter8,18. Häri är en detaljerad beskrivning av beredningen av bakteriekulturen efter behandling med den antimikrobiella föreningen och en jämförelse av proteinaggregeringsstatus vid exponering av två E. coli-stammar med distinkta känslighetsprofiler för att öka koncentrationen av antimikrobiell. Den beskrivna metoden är billig, snabb och reproducerbar och kan användas för att studera proteinaggregering i närvaro av andra proteotoxiska föreningar. Dessutom kan protokollet modifieras för att analysera den inverkan som specifika genborttagningar har på proteinaggregering i en mängd olika bakterier.
Detta protokoll beskriver en optimerad metodik för analys av proteinaggregatbildning efter behandling av olika E. coli stammar med en proteotoxic antimikrobiell. Protokollet tillåter samtidig extraktion av olösliga och lösliga proteinfraktioner från behandlade och obehandlade E. coli-celler. Jämfört med befintliga protokoll för proteinaggregatisolering fråncellerna 14,15,16,<sup class="xref"…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Illinois State University School of Biological Sciences startfonder, Illinois State University New Faculty Initiative Grant och NIAID-bidraget R15AI164585 (till J.-U. D.). G.M.A. stöddes av Illinois State University Undergraduate Research Support Program (till G.M.A.). K. P. H. stöttades av ett RISE-stipendium från den tyska akademiska växlingstjänsten (DAAD). Författarna tackar Dr. Uwe Landau och Dr. Carsten Meyer från Largentech Vertriebs GmbH för att tillhandahålla AGXX pulver. Figur 1, Figur 2, Figur 3, Figur 4och Figur 5 genererades med Biorender.
Chemicals/Reagents | |||
Acetone | Fisher Scientific | 67-64-1 | |
30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1 | Bio-Rad | 1610156 | |
Ammonium persulfate | Millipore Sigma | A3678-100G | |
Benzonase nuclease | Sigma | E1014-5KU | |
Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa | GoldBio | P008-500 | |
β-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-100ML | |
Bromophenol blue | GoldBio | B-092-25 | |
Coomassie Brilliant Blue R-250 | MP Biomedicals LLC | 821616 | |
D-Glucose | Millipore Sigma | G8270-1KG | |
D-Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | SLBT9686 | |
Glacial Acetic acid | Millipore Sigma | ARK2183-1L | |
Glycerol, 99% | Sigma-Aldrich | G5516-1L | |
Glycine | GoldBio | G-630-1 | |
Hydrochloric acid, ACS reagent | Sigma-Aldrich | 320331-2.5L | |
Isopropanol (2-Propanol) | Sigma | 402893-2.5L | |
LB broth (Miller) | Millipore Sigma | L3522-1KG | |
LB broth with agar (Miller) | Millipore Sigma | L2897-1KG | |
Lysozyme | GoldBio | L-040-25 | |
10x MOPS Buffer | Teknova | M2101 | |
Nonidet P-40 | Thomas Scientific | 9036-19-5 | |
Potassium phosphate, dibasic | Sigma-Aldrich | P3786-1KG | |
Potassium phosphate, monobasic | Acros Organics | 7778-77-0 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Millipore Sigma | T9281-50ML | |
Thiamine | Sigma-Aldrich | T4625-100G | |
100% Trichloroacetic acid | Millipore Sigma | T6399-100G | |
Tris base | GoldBio | T-400-1 | |
Material/Equipment | |||
Centrifuge tubes (15 mL) | Alkali Scientific | JABG-1019 | |
Erlenmeyer flask (125 mL) | Carolina | 726686 | |
Erlenmeyer flask (500 mL) | Carolina | 726694 | |
Freezer: -80 °C | Fisher Scientific | ||
Glass beads (0.5 mm) | BioSpec Products | 1107-9105 | |
Microcentrifuge | Hermle | Z216MK | |
Microcentriguge tubes (1.7 mL) | VWR International | 87003-294 | |
Microcentriguge tubes (2.0 mL) | Axygen Maxiclear Microtubes | MCT-200-C | |
Plastic cuvettes | Fischer Scientific | 14-377-012 | |
Power supply | ThermoFisher Scientific | EC105 | |
Rocker | Alkali Scientific | RS7235 | |
Shaking incubator (37 °C) | Benchmark Scientific | ||
Small glass plate | Bio-Rad | 1653311 | |
Spacer plates (1 mm) | Bio-Rad | 1653308 | |
Spectrophotometer | Thermoscientific | 3339053 | |
Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes | Beckman-Coulter | ||
Vertical gel electrophoresis chamber | Bio-Rad | 1658004 | |
Vortexer | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 | |
Thermomixer | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
10 well comb | Bio-Rad | 1653359 |