Extracción y visualización de agregados proteicos después del tratamiento de Escherichia coli con un estresor proteotóxico
Summary
Este protocolo describe la extracción y visualización de proteínas agregadas y solubles de Escherichia coli después del tratamiento con un antimicrobiano proteotóxico. Seguir este procedimiento permite una comparación cualitativa de la formación de agregados proteicos in vivo en diferentes cepas bacterianas y/o entre tratamientos.
Abstract
La exposición de los organismos vivos a tensiones ambientales y celulares a menudo causa interrupciones en la homeostasis de las proteínas y puede resultar en la agregación de proteínas. La acumulación de agregados de proteínas en las células bacterianas puede conducir a alteraciones significativas en el comportamiento fenotípico celular, incluida una reducción en las tasas de crecimiento, resistencia al estrés y virulencia. Existen varios procedimientos experimentales para el examen de estos fenotipos mediados por factores estresantes. Este artículo describe un ensayo optimizado para la extracción y visualización de proteínas agregadas y solubles de diferentes cepas de Escherichia coli después del tratamiento con un antimicrobiano que contiene plata-rutenio. Se sabe que este compuesto genera especies reactivas de oxígeno y causa una agregación generalizada de proteínas.
El método combina una separación basada en centrifugación de agregados de proteínas y proteínas solubles de células tratadas y no tratadas con la posterior separación y visualización por electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) y tinción de Coomassie. Este enfoque es simple, rápido y permite una comparación cualitativa de la formación de agregados proteicos en diferentes cepas de E. coli. La metodología tiene una amplia gama de aplicaciones, incluida la posibilidad de investigar el impacto de otros antimicrobianos proteotóxicos en la agregación de proteínas in vivo en una amplia gama de bacterias. Además, el protocolo se puede utilizar para identificar genes que contribuyen a aumentar la resistencia a las sustancias proteotóxicas. Las bandas de gel se pueden utilizar para la identificación posterior de proteínas que son particularmente propensas a la agregación.
Introduction
Las bacterias están inevitablemente expuestas a una miríada de tensiones ambientales, incluyendo pH bajo (por ejemplo, en el estómago de los mamíferos)1,2, especies reactivas de oxígeno y cloro (ROS / RCS) (por ejemplo, durante el estallido oxidativo en los fagocitos)3,4,5, temperaturas elevadas (por ejemplo, en aguas termales o durante el choque térmico)6,7, y varios antimicrobianos potentes (por ejemplo, AGXX utilizado en este protocolo)8. Las proteínas son particularmente vulnerables a cualquiera de estos factores estresantes, y la exposición puede provocar el desplegamiento de proteínas que luego se agregan las semillas. Todos los organismos emplean sistemas de protección que les permiten hacer frente al mal plegamiento de proteínas9. Sin embargo, el estrés severo puede abrumar la maquinaria de control de calidad de proteínas e interrumpir la estructura secundaria y / o terciaria de las proteínas, que en última instancia inactiva las proteínas. Como consecuencia, los agregados de proteínas pueden afectar gravemente las funciones celulares críticas requeridas para el crecimiento y la supervivencia bacteriana, la resistencia al estrés y la virulencia10. Por lo tanto, la investigación centrada en la agregación de proteínas y sus consecuencias en las bacterias es un tema relevante debido a su impacto potencial en el control de enfermedades infecciosas.
El despliegue y la agregación de proteínas inducidas por el calor son a menudo reversibles7. Por el contrario, otras tensiones proteotóxicas, como el estrés oxidativo, pueden causar modificaciones irreversibles de las proteínas a través de la oxidación de cadenas laterales de aminoácidos específicos, lo que resulta en el desplegamiento / mal de la proteína y, eventualmente, la agregación deproteínas 4. La formación inducida por estrés de agregados de proteínas insolubles ha sido ampliamente estudiada en el contexto de chaperonas moleculares y sus funciones protectoras en levaduras y bacterias11,12,13. Se han publicado varios protocolos que utilizan una variedad de técnicas bioquímicas para el aislamiento y análisis de agregados de proteínas insolubles14,15,16,17. Los protocolos existentes se han utilizado principalmente para estudiar la agregación de proteínas bacterianas tras el choque térmico y/o la identificación de chaperonas moleculares. Si bien estos protocolos ciertamente han sido un avance en el campo, hay algunos inconvenientes importantes en los procedimientos experimentales porque requieren (i) un gran volumen de cultivo bacteriano de hasta 10 L14,17, (ii) procesos complicados de interrupción física, incluido el uso de disruptores celulares, prensa francesa y / o sonicación14,15,17o (iii) procesos repetidos que consumen mucho tiempo pasos de lavado e incubación15,16,17.
Este artículo describe un protocolo modificado que tiene como objetivo abordar las limitaciones de los enfoques anteriores y permite el análisis de la cantidad de agregados de proteínas formados en dos cepas diferentes de Escherichia coli después del tratamiento con un recubrimiento superficial antimicrobiano proteotóxico. El recubrimiento está compuesto por metal-plata (Ag) y rutenio (Ru)-acondicionado con ácido ascórbico, y su actividad antimicrobiana se logra mediante la generación de especies reactivas de oxígeno8,18. Aquí hay una descripción detallada de la preparación del cultivo bacteriano después del tratamiento con el compuesto antimicrobiano y una comparación del estado de agregación de proteínas tras la exposición de dos cepas de E. coli con perfiles de susceptibilidad distintos a la concentración creciente del antimicrobiano. El método descrito es barato, rápido y reproducible y se puede utilizar para estudiar la agregación de proteínas en presencia de otros compuestos proteotóxicos. Además, el protocolo se puede modificar para analizar el impacto que las deleciones genéticas específicas tienen en la agregación de proteínas en una variedad de bacterias diferentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe una metodología optimizada para el análisis de la formación de agregados proteicos después del tratamiento de diferentes cepas de E. coli con un antimicrobiano proteotóxico. El protocolo permite la extracción simultánea de fracciones de proteínas insolubles y solubles de células de E. coli tratadas y no tratadas. En comparación con los protocolos existentes para el aislamiento de agregados de proteínas de las células14,<su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por los fondos de inicio de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Estatal de Illinois, la Subvención de la Iniciativa de Nueva Facultad de la Universidad Estatal de Illinois y la subvención del NIAID R15AI164585 (a J.-U. D.). G.M.A. fue apoyado por el Programa de Apoyo a la Investigación de Pregrado de la Universidad Estatal de Illinois (a G.M.A.). K. P. H. fue apoyado por una beca RISE proporcionada por el Servicio Alemán de Intercambio Académico (DAAD). Los autores agradecen al Dr. Uwe Landau y al Dr. Carsten Meyer de Largentech Vertriebs GmbH por proporcionar el polvo AGXX. Las Figuras 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4y Figura 5 se generaron con Biorender.
Materials
| Chemicals/Reagents | |||
| Acetone | Fisher Scientific | 67-64-1 | |
| 30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1 | Bio-Rad | 1610156 | |
| Ammonium persulfate | Millipore Sigma | A3678-100G | |
| Benzonase nuclease | Sigma | E1014-5KU | |
| Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa | GoldBio | P008-500 | |
| β-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-100ML | |
| Bromophenol blue | GoldBio | B-092-25 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | MP Biomedicals LLC | 821616 | |
| D-Glucose | Millipore Sigma | G8270-1KG | |
| D-Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | SLBT9686 | |
| Glacial Acetic acid | Millipore Sigma | ARK2183-1L | |
| Glycerol, 99% | Sigma-Aldrich | G5516-1L | |
| Glycine | GoldBio | G-630-1 | |
| Hydrochloric acid, ACS reagent | Sigma-Aldrich | 320331-2.5L | |
| Isopropanol (2-Propanol) | Sigma | 402893-2.5L | |
| LB broth (Miller) | Millipore Sigma | L3522-1KG | |
| LB broth with agar (Miller) | Millipore Sigma | L2897-1KG | |
| Lysozyme | GoldBio | L-040-25 | |
| 10x MOPS Buffer | Teknova | M2101 | |
| Nonidet P-40 | Thomas Scientific | 9036-19-5 | |
| Potassium phosphate, dibasic | Sigma-Aldrich | P3786-1KG | |
| Potassium phosphate, monobasic | Acros Organics | 7778-77-0 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Millipore Sigma | T9281-50ML | |
| Thiamine | Sigma-Aldrich | T4625-100G | |
| 100% Trichloroacetic acid | Millipore Sigma | T6399-100G | |
| Tris base | GoldBio | T-400-1 | |
| Material/Equipment | |||
| Centrifuge tubes (15 mL) | Alkali Scientific | JABG-1019 | |
| Erlenmeyer flask (125 mL) | Carolina | 726686 | |
| Erlenmeyer flask (500 mL) | Carolina | 726694 | |
| Freezer: -80 °C | Fisher Scientific | ||
| Glass beads (0.5 mm) | BioSpec Products | 1107-9105 | |
| Microcentrifuge | Hermle | Z216MK | |
| Microcentriguge tubes (1.7 mL) | VWR International | 87003-294 | |
| Microcentriguge tubes (2.0 mL) | Axygen Maxiclear Microtubes | MCT-200-C | |
| Plastic cuvettes | Fischer Scientific | 14-377-012 | |
| Power supply | ThermoFisher Scientific | EC105 | |
| Rocker | Alkali Scientific | RS7235 | |
| Shaking incubator (37 °C) | Benchmark Scientific | ||
| Small glass plate | Bio-Rad | 1653311 | |
| Spacer plates (1 mm) | Bio-Rad | 1653308 | |
| Spectrophotometer | Thermoscientific | 3339053 | |
| Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes | Beckman-Coulter | ||
| Vertical gel electrophoresis chamber | Bio-Rad | 1658004 | |
| Vortexer | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 | |
| Thermomixer | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
| 10 well comb | Bio-Rad | 1653359 |
Referências
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