Экстракция и визуализация белковых агрегатов после лечения кишечной палочки протеотоксическим стрессором
Summary
Этот протокол описывает экстракцию и визуализацию агрегированных и растворимых белков из кишечной палочки после лечения протеотоксическим противомикробным средством. Следование этой процедуре позволяет качественно сравнивать образование белковой агрегированности in vivo в различных бактериальных штаммах и/или между обработками.
Abstract
Воздействие на живые организмы экологических и клеточных стрессов часто вызывает нарушения гомеостаза белка и может привести к агрегации белка. Накопление белковых агрегатов в бактериальных клетках может привести к значительным изменениям в клеточном фенотипической поведения, включая снижение темпов роста, стрессоустойчивости и вирулентности. Существует несколько экспериментальных процедур для изучения этих фенотипов, опосредованных стрессорами. В данной работе описан оптимизированный анализ для экстракции и визуализации агрегированных и растворимых белков из различных штаммов кишечной палочки после обработки серебристо-рутениемсодержащим антимикробным средством. Известно, что это соединение генерирует активные формы кислорода и вызывает широко распространенную агрегацию белка.
Метод сочетает в себе центрифугирование на основе разделения белковых агрегатов и растворимых белков из обработанных и необработанных клеток с последующим разделением и визуализацией путем электрофореза додецилсульфат-полиакриламидного геля натрия (SDS-PAGE) и окрашивания Coomassie. Такой подход прост, быстр и позволяет качественно сравнить образование белкового агрегата у разных штаммов E. coli. Методика имеет широкий спектр применения, включая возможность исследования влияния других протеотоксических противомикробных препаратов на агрегацию белка in vivo в широком спектре бактерий. Более того, протокол может быть использован для выявления генов, способствующих повышению устойчивости к протеотоксическим веществам. Гелевые полосы могут быть использованы для последующей идентификации белков, которые особенно склонны к агрегации.
Introduction
Бактерии неизбежно подвергаются воздействию множества экологических стрессов, включая низкий рН (например, в желудке млекопитающих)1,2,активные формы кислорода и хлора (ROS / RCS) (например, во время окислительного всплеска в фагоцитах)3,4,5, повышенные температуры (например, в горячих источниках или во время теплового шока)6,7и несколько мощных противомикробных препаратов (например, AGXX, используемый в этом протоколе)8. Белки особенно уязвимы к любому из этих стрессоров, и воздействие может спровоцировать несложение белка, которое затем сеет агрегацию. Все организмы используют защитные системы, которые позволяют им справляться с неправильным свораскиванием белка9. Однако сильный стресс может перегрузить механизм контроля качества белка и нарушить вторичную и /или третичную структуру белков, что в конечном итоге инактивирует белки. Как следствие, белковые агрегаты могут серьезно ухудшить критические клеточные функции, необходимые для роста и выживания бактерий, стрессоустойчивости и вирулентности10. Поэтому исследования, посвященные агрегации белка и ее последствиям у бактерий, является актуальной темой из-за ее потенциального влияния на борьбу с инфекционными заболеваниями.
Тепловое развертывание и агрегация белка часто обратимы7. Напротив, другие протеотоксические стрессы, такие как окислительный стресс, могут вызывать необратимые модификации белка путем окисления определенных аминокислотных боковых цепей, что приводит к разложению белка и, в конечном итоге, агрегации белка4. Стресс-индуцированное образование нерастворимых белковых агрегатов широко изучено в контексте молекулярных шаперонов и их защитных функций у дрожжей и бактерий11,12,13. Было опубликовано несколько протоколов, которые используют различные биохимические методы для выделения и анализа нерастворимых белковых агрегатов14,15,16,17. Существующие протоколы в основном использовались для изучения агрегации бактериального белка при тепловом шоке и/или идентификации молекулярных шаперонов. Хотя эти протоколы, безусловно, были продвижением в этой области, в экспериментальных процедурах есть некоторые серьезные неудобства, поскольку они требуют (i) большого объема бактериальной культуры до 10 л14,17, (ii) сложных процессов физического разрушения, включая использование разрушителей клеток, френч-пресса и / или ультразвуковойобработка 14,15,17или (iii) трудоемкие повторяющиеся этапы промывки и инкубации15,16,17.
В данной работе описывается модифицированный протокол, направленный на устранение ограничений предыдущих подходов и позволяющий анализировать количество белковых агрегатов, образующихся в двух различных штаммах кишечной палочки после обработки протеотоксичным антимикробным поверхностным покрытием. Покрытие состоит из металл-серебра (Ag) и рутения (Ru)-кондиционированного аскорбиновой кислотой, а его антимикробная активность достигается за счет генерации активных форм кислорода8,18. Приведено подробное описание получения бактериальной культуры после обработки антимикробным соединением и сравнение состояния агрегации белка при воздействии двух штаммов E. coli с различными профилями восприимчивости к повышению концентрации противомикробного препарата. Описанный способ является недорогим, быстрым и воспроизводимым и может быть использован для изучения агрегации белка в присутствии других протеотоксических соединений. Кроме того, протокол может быть модифицирован для анализа влияния, которое конкретные делеции генов оказывают на агрегацию белка у множества различных бактерий.
Protocol
Representative Results
Discussion
Данный протокол описывает оптимизированную методологию анализа образования белковых агрегатов после обработки различных штаммов E. coli протеотоксическим противомикробным средством. Протокол допускает одновременную экстракцию нерастворимых и растворимых белковых фракций из об…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана стартовыми фондами Школы биологических наук Университета штата Иллинойс, грантом Инициативы нового факультета Университета штата Иллинойс и грантом NIAID R15AI164585 (для J.-U. D.). G.M.A. был поддержан Программой поддержки исследований бакалавриата Университета штата Иллинойс (G.M.A.). K.P.H. была поддержана стипендией RISE, предоставленной Германской службой академических обменов (DAAD). Авторы благодарят д-ра Уве Ландау и д-ра Карстена Мейера из Largentech Vertriebs GmbH за предоставление порошка AGXX. Рисунки 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4и Рисунок 5 были сгенерированы с помощью Biorender.
Materials
| Chemicals/Reagents | |||
| Acetone | Fisher Scientific | 67-64-1 | |
| 30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1 | Bio-Rad | 1610156 | |
| Ammonium persulfate | Millipore Sigma | A3678-100G | |
| Benzonase nuclease | Sigma | E1014-5KU | |
| Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa | GoldBio | P008-500 | |
| β-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-100ML | |
| Bromophenol blue | GoldBio | B-092-25 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | MP Biomedicals LLC | 821616 | |
| D-Glucose | Millipore Sigma | G8270-1KG | |
| D-Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | SLBT9686 | |
| Glacial Acetic acid | Millipore Sigma | ARK2183-1L | |
| Glycerol, 99% | Sigma-Aldrich | G5516-1L | |
| Glycine | GoldBio | G-630-1 | |
| Hydrochloric acid, ACS reagent | Sigma-Aldrich | 320331-2.5L | |
| Isopropanol (2-Propanol) | Sigma | 402893-2.5L | |
| LB broth (Miller) | Millipore Sigma | L3522-1KG | |
| LB broth with agar (Miller) | Millipore Sigma | L2897-1KG | |
| Lysozyme | GoldBio | L-040-25 | |
| 10x MOPS Buffer | Teknova | M2101 | |
| Nonidet P-40 | Thomas Scientific | 9036-19-5 | |
| Potassium phosphate, dibasic | Sigma-Aldrich | P3786-1KG | |
| Potassium phosphate, monobasic | Acros Organics | 7778-77-0 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Millipore Sigma | T9281-50ML | |
| Thiamine | Sigma-Aldrich | T4625-100G | |
| 100% Trichloroacetic acid | Millipore Sigma | T6399-100G | |
| Tris base | GoldBio | T-400-1 | |
| Material/Equipment | |||
| Centrifuge tubes (15 mL) | Alkali Scientific | JABG-1019 | |
| Erlenmeyer flask (125 mL) | Carolina | 726686 | |
| Erlenmeyer flask (500 mL) | Carolina | 726694 | |
| Freezer: -80 °C | Fisher Scientific | ||
| Glass beads (0.5 mm) | BioSpec Products | 1107-9105 | |
| Microcentrifuge | Hermle | Z216MK | |
| Microcentriguge tubes (1.7 mL) | VWR International | 87003-294 | |
| Microcentriguge tubes (2.0 mL) | Axygen Maxiclear Microtubes | MCT-200-C | |
| Plastic cuvettes | Fischer Scientific | 14-377-012 | |
| Power supply | ThermoFisher Scientific | EC105 | |
| Rocker | Alkali Scientific | RS7235 | |
| Shaking incubator (37 °C) | Benchmark Scientific | ||
| Small glass plate | Bio-Rad | 1653311 | |
| Spacer plates (1 mm) | Bio-Rad | 1653308 | |
| Spectrophotometer | Thermoscientific | 3339053 | |
| Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes | Beckman-Coulter | ||
| Vertical gel electrophoresis chamber | Bio-Rad | 1658004 | |
| Vortexer | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 | |
| Thermomixer | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
| 10 well comb | Bio-Rad | 1653359 |
Referências
- Dahl, J. -. U., et al. HdeB functions as an acid-protective chaperone in bacteria. Journal of Biological Chemistry. 290 (1), 65-75 (2015).
- Foit, L., George, J. S., Zhang, B. W., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. Chaperone activation by unfolding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 1254-1262 (2013).
- Sultana, S., Foti, A., Dahl, J. -. U. Bacterial defense systems against the neutrophilic oxidant hypochlorous acid. Infection and Immunity. 88 (7), 00964 (2020).
- Dahl, J. -. U., Gray, M. J., Jakob, U. Protein quality control under oxidative stress conditions. Journal of Molecular Biology. 427 (7), 1549-1563 (2015).
- Groitl, B., Dahl, J. -. U., Schroeder, J. W., Jakob, U. Pseudomonas aeruginosa defense systems against microbicidal oxidants. Molecular Microbiology. 106 (3), 335-350 (2017).
- Casadevall, A. Thermal restriction as an antimicrobial function of fever. PLoS Pathogens. 12 (5), 1005577 (2016).
- Richter, K., Haslbeck, M., Buchner, J. The heat shock response: life on the verge of death. Molecular Cell. 40 (2), 253-266 (2010).
- Van Loi, V., Busche, T., Preuß, T., Kalinowski, J., Bernhardt, J. The AGXX ® antimicrobial coating causes a thiol-specific oxidative stress response and protein S-bacillithiolation in Staphylococcus aureus. Frontiers in Microbiology. 9, 3037 (2018).
- Anfinsen, C. B., Scheraga, H. A. Experimental and theoretical aspects of protein folding. Advances in Protein Chemistry. 29, 205-300 (1975).
- Schramm, F. D., Schroeder, K., Jonas, K. Protein aggregation in bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 44 (1), 54-72 (2020).
- Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol. Molecular Microbiology. 40 (2), 397-413 (2001).
- Gray, M. J., et al. Polyphosphate is a primordial chaperone. Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).
- Weids, A. J., Ibstedt, S., Tamás, M. J., Grant, C. M. Distinct stress conditions result in aggregation of proteins with similar properties. Scientific Reports. 6, 24554 (2016).
- Mogk, A., et al. Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB. EMBO Journal. 18 (24), 6934-6949 (1999).
- Fay, A., Glickman, M. S. An essential nonredundant role for mycobacterial DnaK in native protein folding. PLoS Genetics. 10 (7), 1004516 (2014).
- Schramm, F. D., Heinrich, K., Thüring, M., Bernhardt, J., Jonas, K. An essential regulatory function of the DnaK chaperone dictates the decision between proliferation and maintenance in Caulobacter crescentus. PLoS Genetics. 13 (12), 1007148 (2017).
- Maisonneuve, E., Fraysse, L., Moinier, D., Dukan, S. Existence of abnormal protein aggregates in healthy Escherichia coli cells. Journal of Bacteriology. 190 (3), 887-893 (2008).
- Heiss, A., Freisinger, B., Held-Föhn, E. Enhanced antibacterial activity of silver-ruthenium coated hollow microparticles. Biointerphases. 12 (5), (2017).
- Papnayotou, I., Sun, B., Roth, A. F., Davis, N. G. Protein aggregation induced during glass bead lysis of yeast. Yeast. 27 (10), 801-816 (2010).
- Chuang, S. E., Blattner, F. R. Characterization of twenty-six new heat shock genes of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 175 (16), 5242-5252 (1993).
- Imlay, J. A. The molecular mechanisms and physiological consequences of oxidative stress: Lessons from a model bacterium. Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 443-454 (2013).
- Mühlhofer, M., et al. The heat shock response in yeast maintains protein homeostasis by chaperoning and replenishing proteins. Cell Reports. 29 (13), 4593-4607 (2019).
- Chandrangsu, P., Rensing, C., Helmann, J. D. Metal homeostasis and resistance in bacteria. Nature Reviews Microbiology. 15, 338-350 (2017).
- Stevens, M., et al. HSP60/10 chaperonin systems are inhibited by a variety of approved drugs, natural products, and known bioactive molecules. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 29 (9), 1106-1112 (2019).
- Schramm, F. D., Schroeder, K., Alvelid, J., Testa, I., Jonas, K. Growth-driven displacement of protein aggregates along the cell length ensures partitioning to both daughter cells in Caulobacter crescentus. Molecular Microbiology. 111 (6), 1430-1448 (2019).
