Extração e Visualização de Agregados proteicos após tratamento de Escherichia coli com um Estressor Proteotóxico
Summary
Este protocolo descreve a extração e visualização de proteínas agregadas e solúveis de Escherichia coli após o tratamento com um antimicrobiano proteotóxico. Após este procedimento permite uma comparação qualitativa da formação de agregado de proteínas in vivo em diferentes cepas bacterianas e/ou entre os tratamentos.
Abstract
A exposição de organismos vivos a estresses ambientais e celulares muitas vezes causa interrupções na homeostase proteica e pode resultar em agregação de proteínas. O acúmulo de agregados proteicos em células bacterianas pode levar a alterações significativas no comportamento fenotípico celular, incluindo uma redução nas taxas de crescimento, resistência ao estresse e virulência. Existem vários procedimentos experimentais para o exame desses fenótipos mediados pelo estressor. Este artigo descreve um ensaio otimizado para a extração e visualização de proteínas agregadas e solúveis de diferentes cepas de Escherichia coli após o tratamento com um antimicrobiano contendo prata-rutênio. Este composto é conhecido por gerar espécies reativas de oxigênio e causa agregação generalizada de proteínas.
O método combina uma separação baseada em centrifugação de agregados proteicos e proteínas solúveis de células tratadas e não tratadas com posterior separação e visualização por eletroforese de gel de sulfato-poliacrilamida de sódio (SDS-PAGE) e coloração coomassie. Esta abordagem é simples, rápida e permite uma comparação qualitativa da formação de proteína agregada em diferentes cepas de E. coli. A metodologia possui uma ampla gama de aplicações, incluindo a possibilidade de investigar o impacto de outros antimicrobianos proteotóicos na agregação de proteínas in vivo em uma ampla gama de bactérias. Além disso, o protocolo pode ser usado para identificar genes que contribuem para o aumento da resistência às substâncias proteotoxias. Bandas de gel podem ser usadas para a identificação subsequente de proteínas particularmente propensas à agregação.
Introduction
As bactérias são inevitavelmente expostas a uma miríade de estresses ambientais, incluindo pH baixo (por exemplo, no estômago dos mamíferos)1,2, oxigênio reativo e espécies de cloro (ROS/RCS) (por exemplo, durante a explosão oxidativa em fagocitos)3,4,5, temperaturas elevadas (por exemplo, em fontes termais ou durante o choque térmico)6,7, e vários antimicrobianos potentes (por exemplo, AGXX usados neste protocolo)8. As proteínas são particularmente vulneráveis a qualquer um desses estressores, e a exposição pode provocar a não-/misfolding de proteínas que, em seguida, a agregação de sementes. Todos os organismos empregam sistemas de proteção que lhes permitem lidar com o erro de proteína9. No entanto, o estresse severo pode sobrecarregar o maquinário de controle de qualidade proteica e interromper a estrutura secundária e/ou terciária das proteínas, o que acaba inativando proteínas. Como consequência, os agregados proteicos podem prejudicar severamente as funções celulares críticas necessárias para o crescimento e sobrevivência bacteriana, resistência ao estresse e virulência10. Portanto, pesquisas com foco na agregação de proteínas e suas consequências nas bactérias são um tema relevante devido ao seu potencial impacto no controle de doenças infecciosas.
O desdobramento e a agregação de proteínas induzidas pelo calor são muitas vezes reversíveis7. Em contraste, outras tensões proteotoxiais, como o estresse oxidativo, podem causar modificações proteicas irreversíveis através da oxidação de cadeias laterais específicas de aminoácidos resultando em proteínas não-/misfolding e, eventualmente, agregação deproteínas 4. A formação induzida pelo estresse de agregados proteicos insolúveis tem sido extensivamente estudada no contexto de acompanhantes moleculares e suas funções protetoras na levedura e bactérias11,12,13. Vários protocolos foram publicados que utilizam uma variedade de técnicas bioquímicas para o isolamento e análise dos agregados de proteínas insolúveis14,15,16,17. Os protocolos existentes têm sido usados principalmente para estudar a agregação de proteínas bacterianas mediante choque térmico e/ou identificação de acompanhantes moleculares. Embora esses protocolos tenham sido certamente um avanço para o campo, há alguns grandes inconvenientes nos procedimentos experimentais porque exigem (i) um grande volume de cultura bacteriana de até 10 L14,17, (ii) complicados processos de interrupção física, incluindo o uso de disruptores celulares, imprensa francesa e/ou sonicação14,15,17, ou (iii) demorado repetidos lalavís e incubação etapas15,16,17.
Este artigo descreve um protocolo modificado que visa abordar as limitações das abordagens anteriores e permite a análise da quantidade de agregados proteicos formados em duas cepas diferentes de Escherichia coli após o tratamento com um revestimento de superfície antimicrobiana proteotoxic. O revestimento é composto de metal-prata (Ag) e rutênio (Ru)-condicionado com ácido ascórbico, e sua atividade antimicrobiana é alcançada pela geração de espécies reativas de oxigênio8,18. Aqui está uma descrição detalhada da preparação da cultura bacteriana após o tratamento com o composto antimicrobiano e uma comparação do estado de agregação de proteínas após a exposição de duas cepas de E. coli com perfis distintos de suscetibilidade ao aumento da concentração do antimicrobiano. O método descrito é barato, rápido e reprodutível e pode ser usado para estudar a agregação de proteínas na presença de outros compostos proteotóxicos. Além disso, o protocolo pode ser modificado para analisar o impacto que exclusões genéticas específicas têm na agregação de proteínas em uma variedade de bactérias diferentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve uma metodologia otimizada para a análise da formação de agregado de proteínas após o tratamento de diferentes cepas de E. coli com um antimicrobiano proteotóxico. O protocolo permite a extração simultânea de frações proteicas insolúveis e solúveis de células E. coli tratadas e não tratadas. Em comparação com os protocolos existentes para o isolamento agregado de proteínas das células14,15,<su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelos fundos de startup da Illinois State University School of Biological Sciences, Illinois State University New Faculty Initiative Grant, e o NIAID grant R15AI164585 (para J.-U. D.). G.M.A. foi apoiado pelo Programa de Apoio à Pesquisa de Graduação da Universidade Estadual de Illinois (para G.M.A.). K. P. H. foi apoiado por uma bolsa rise fornecida pelo Serviço Alemão de Intercâmbio Acadêmico (DAAD). Os autores agradecem ao Dr. Uwe Landau e ao Dr. Carsten Meyer da Largentech Vertriebs GmbH por fornecerem o pó AGXX. Foram geradas as Figuras 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4e Figura 5 com Biorender.
Materials
| Chemicals/Reagents | |||
| Acetone | Fisher Scientific | 67-64-1 | |
| 30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1 | Bio-Rad | 1610156 | |
| Ammonium persulfate | Millipore Sigma | A3678-100G | |
| Benzonase nuclease | Sigma | E1014-5KU | |
| Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa | GoldBio | P008-500 | |
| β-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-100ML | |
| Bromophenol blue | GoldBio | B-092-25 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | MP Biomedicals LLC | 821616 | |
| D-Glucose | Millipore Sigma | G8270-1KG | |
| D-Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | SLBT9686 | |
| Glacial Acetic acid | Millipore Sigma | ARK2183-1L | |
| Glycerol, 99% | Sigma-Aldrich | G5516-1L | |
| Glycine | GoldBio | G-630-1 | |
| Hydrochloric acid, ACS reagent | Sigma-Aldrich | 320331-2.5L | |
| Isopropanol (2-Propanol) | Sigma | 402893-2.5L | |
| LB broth (Miller) | Millipore Sigma | L3522-1KG | |
| LB broth with agar (Miller) | Millipore Sigma | L2897-1KG | |
| Lysozyme | GoldBio | L-040-25 | |
| 10x MOPS Buffer | Teknova | M2101 | |
| Nonidet P-40 | Thomas Scientific | 9036-19-5 | |
| Potassium phosphate, dibasic | Sigma-Aldrich | P3786-1KG | |
| Potassium phosphate, monobasic | Acros Organics | 7778-77-0 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Millipore Sigma | T9281-50ML | |
| Thiamine | Sigma-Aldrich | T4625-100G | |
| 100% Trichloroacetic acid | Millipore Sigma | T6399-100G | |
| Tris base | GoldBio | T-400-1 | |
| Material/Equipment | |||
| Centrifuge tubes (15 mL) | Alkali Scientific | JABG-1019 | |
| Erlenmeyer flask (125 mL) | Carolina | 726686 | |
| Erlenmeyer flask (500 mL) | Carolina | 726694 | |
| Freezer: -80 °C | Fisher Scientific | ||
| Glass beads (0.5 mm) | BioSpec Products | 1107-9105 | |
| Microcentrifuge | Hermle | Z216MK | |
| Microcentriguge tubes (1.7 mL) | VWR International | 87003-294 | |
| Microcentriguge tubes (2.0 mL) | Axygen Maxiclear Microtubes | MCT-200-C | |
| Plastic cuvettes | Fischer Scientific | 14-377-012 | |
| Power supply | ThermoFisher Scientific | EC105 | |
| Rocker | Alkali Scientific | RS7235 | |
| Shaking incubator (37 °C) | Benchmark Scientific | ||
| Small glass plate | Bio-Rad | 1653311 | |
| Spacer plates (1 mm) | Bio-Rad | 1653308 | |
| Spectrophotometer | Thermoscientific | 3339053 | |
| Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes | Beckman-Coulter | ||
| Vertical gel electrophoresis chamber | Bio-Rad | 1658004 | |
| Vortexer | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 | |
| Thermomixer | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
| 10 well comb | Bio-Rad | 1653359 |
Referências
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