Bakterier er uunngåelig utsatt for et utall miljøspenninger, inkludert lav pH (f.eks. i pattedyrets mage)^1,2, reaktive oksygen- og klorarter (ROS/RCS) (f.eks. under oksidativt utbrudd i fagocytter)^3,4,5, forhøyede temperaturer (f.eks. i varme kilder eller under varmesjokk)^6,7og flere potente antimikrobielle midler (f.eks. AGXX brukt i denne protokollen)⁸. Proteiner er spesielt sårbare for noen av disse stressorene, og eksponering kan provosere protein un-/misfolding som deretter frø aggregering. Alle organismer bruker beskyttende systemer som gjør at de kan takle proteinfeilfolding⁹. Imidlertid kan alvorlig stress overvelde proteinkvalitetskontrollmaskineriet og forstyrre den sekundære og / eller tertiære strukturen av proteiner, som til slutt inaktiverer proteiner. Som en konsekvens kan proteinaggregater sterkt svekke kritiske cellulære funksjoner som kreves for bakteriell vekst og overlevelse, stressmotstand og virulens¹⁰. Derfor er forskning med fokus på proteinaggregering og dens konsekvenser i bakterier et relevant tema på grunn av dens potensielle innvirkning på smittsom sykdomskontroll.

Varmeindusert protein utfolder seg og aggregering er ofte reversibel⁷. I motsetning kan andre protetoksiske påkjenninger, som oksidativt stress, forårsake irreversible proteinmodifikasjoner gjennom oksidasjon av spesifikke aminosyresidekjeder som resulterer i protein un-/misfolding og til slutt proteinaggregering⁴. Stressindusert dannelse av uoppløselige proteinaggregater har blitt grundig studert i sammenheng med molekylære anstander og deres beskyttende funksjoner i gjær og bakterier^11,12,13. Flere protokoller har blitt publisert som bruker en rekke biokjemiske teknikker for isolering og analyse av uoppløselige proteinaggregater^14,15,16,17. De eksisterende protokollene har hovedsakelig blitt brukt til å studere bakteriell proteinaggregering ved varmesjokk og/eller identifisering av molekylære anstander. Selv om disse protokollene absolutt har vært et fremskritt for feltet, er det noen store ulemper i de eksperimentelle prosedyrene fordi de krever (i) et stort bakteriekulturvolum på opptil 10 L^14,17, (ii) kompliserte fysiske forstyrrelsesprosesser, inkludert bruk av celleforstyrrelser, fransk presse og / eller sonikering^14,15,17eller (iii) tidkrevende gjentatt vaske- og inkubasjonstrinn^15,16,17.

Dette dokumentet beskriver en modifisert protokoll som tar sikte på å adressere begrensningene i de tidligere tilnærmingene og tillater analyse av mengden proteinaggregater dannet i to forskjellige Escherichia coli-stammer etter behandling med et protetoksisk antimikrobielt overflatebelegg. Belegget består av metall-sølv (Ag) og ruthenium (Ru)-betinget med askorbinsyre, og dens antimikrobielle aktivitet oppnås ved generering av reaktive oksygenarter^8,18. Herein er en detaljert beskrivelse av fremstillingen av bakteriekulturen etter behandling med den antimikrobielle forbindelsen og en sammenligning av proteinaggregeringsstatus ved eksponering av to E. coli-stammer med tydelige følsomhetsprofiler for å øke konsentrasjonen av antimikrobielle. Den beskrevne metoden er billig, rask og reproduserbar og kan brukes til å studere proteinaggregering i nærvær av andre protetoksiske forbindelser. I tillegg kan protokollen modifiseres for å analysere hvilken innvirkning spesifikke genslettinger har på proteinaggregering i en rekke forskjellige bakterier.