프로테오독성 스트레스로 대장균 치료 후 단백질 골재의 추출 및 시각화
Summary
이 프로토콜은 프로테오독성 항균제로 치료 한 후 대장균에서 집계 및 수용성 단백질의 추출 및 시각화를 설명합니다. 이 절차에 따라 다른 세균성 균주 및 /또는 치료 사이에 생체 내에서 단백질 골집 형성의 질적 비교를 할 수 있습니다.
Abstract
환경 및 세포 스트레스에 살아있는 유기체의 노출은 수시로 단백질 항상성에 있는 중단을 일으키는 원인이 되고 단백질 응집귀귀착될 수 있습니다. 세균성 세포에 있는 단백질 응집체의 축적은 성장 비율, 응력 저항 및 독성에 있는 감소를 포함하여 세포 표현성 행동에 있는 중요한 변경으로 이끌어 낼 수 있습니다. 이러한 스트레스 매개 표현형의 검사를 위한 몇몇 실험적인 절차가 존재합니다. 이 논문은 은 루테늄 함유 항균제로 치료 후 다른 대장균 균주에서 골재 및 수용성 단백질의 추출 및 시각화에 최적화된 분석서를 설명합니다. 이 화합물은 반응성 산소 종을 생성하고 광범위한 단백질 응집을 일으키는 것으로 알려져 있습니다.
이 방법은 치료 및 처리되지 않은 세포로부터 단백질 골재 및 용해성 단백질의 원심분리 계 분리를 나트륨 도데실 황산염-폴리아크라이아미드 젤 전기포진(SDS-PAGE) 및 쿠마시 염색에 의한 후속 분리 및 시각화와 결합한다. 이 접근법은 간단하고 빠르며, 다른 대장균 균주에서 단백질 골체 형성의 질적 비교를 허용합니다. 방법론은 광범위한 박테리아에서 생체 내 단백질 응집에 대한 다른 프로테오독성 항균제의 영향을 조사할 수 있는 가능성을 포함하여 광범위한 응용 분야가 있습니다. 더욱이, 프로토콜은 프로테오독성 물질에 대한 저항증가에 기여하는 유전자를 식별하는 데 사용될 수 있다. 젤 밴드는 특히 응집되기 쉬운 단백질의 후속 식별에 사용할 수 있습니다.
Introduction
박테리아는 필연적으로 환경 스트레스의 무수한에 노출, 낮은 pH(예를 들어, 포유류 위장)1,2,반응성 산소 및 염소 종(ROS/RCS) (예를 들어, 식신구의 산화 파열 중)3,4,5,높은 온도(예를 들어, 온천 또는 열 충격 시)6,7,및 몇 가지 강력한 항균(예를 들어, 이프로토콜)및 몇 가지 강력한 항균(예를 들어, 이 규약) 및 몇 가지 강력한 항균(예를 들어, 이 에 사용됨) 단백질은 이러한 스트레스에 특히 취약하며, 노출은 단백질을 분리/오도하여 다음 씨앗 응집을 유발할 수 있습니다. 모든 유기체는 단백질 잘못 접는9에대처할 수 있는 보호 시스템을 사용합니다. 그러나, 가혹한 긴장은 단백질 질 관리 기계를 압도하고 궁극적으로 단백질을 비활성화하는 단백질의 이차 및/또는 삼차 구조를 방해할 수 있습니다. 결과적으로, 단백질 응집체는 세균성 성장 및 생존, 스트레스 저항 및 독성10에필요한 중요한 세포 기능을 심각하게 손상시킬 수 있다. 따라서, 단백질 집계및 박테리아에 있는 그것의 결과에 집중하는 연구는 전염병 통제에 그것의 잠재적인 충격 때문에 관련 주제입니다.
열 유도 단백질 전개 및 응집은 종종 가역7. 대조적으로, 산화 스트레스와 같은 다른 프로테오독성 응력은 특정 아미노산 사이드 체인의 산화를 통해 돌이킬 수 없는 단백질 변형을 유발하여 단백질을 비/오폴딩시키고, 결국 단백질 응집4를초래할 수 있다. 응력 유발 단백질 골재의 형성은 효모 및 박테리아11,12,13에서분자 보호자 및 보호 기능의 맥락에서 광범위하게 연구되고있다. 여러 프로토콜은 용해성 단백질 골재의 격리 및 분석을 위한 다양한 생화학적 기술을 활용하는 것으로14,15,16,17을공표되었다. 기존 프로토콜은 주로 열 충격 및/또는 분자 보호자의 식별시 세균성 단백질 응집체를 연구하는 데 사용되었습니다. 이러한 프로토콜은 확실히 필드에 발전되었지만, 세포 파괴기, 프랑스 언론 및/또는 초음파처리14,15,17또는 (iii) 시간 반복의 사용을 포함하여 (i) 최대 10 L14,17, (ii) 복잡한 물리적 중단 과정의 큰 세균 배양 부피를 필요로하기 때문에 실험 적 절차에 몇 가지 주요 불편이 있다. 세탁 및 인큐베이션 단계15,16,17.
본 논문은 이전 접근법의 한계를 해결하는 것을 목표로 하는 수정된 프로토콜을 설명하고 프로테오독성 항균 표면 코팅으로 치료 후 두 가지 다른 대장균 균주에서 형성된 단백질 골재의 양을 분석할 수 있게 한다. 코팅은 금속-은(Ag)과 루테늄(Ru)으로 구성되며, 아스코르브산으로 조절되며, 그 항균 활성은 반응성 산소 종8,18의생성에 의해 달성된다. 본명 에서 항균 화합물을 가진 치료 후 세균 배양의 제조에 대한 상세한 설명과 뚜렷한 감수성 프로파일을 가진 두 개의 대장균 균주의 노출 시 단백질 응집 상태의 비교가 항균제의 농도를 증가시키는 것이다. 설명된 방법은 저렴하고 빠르며 재현가능하며 다른 프로테오독성 화합물이 있는 상태에서 단백질 응집을 연구하는 데 사용될 수 있다. 또한, 프로토콜은 다양한 상이한 박테리아에서 특정 유전자 삭제가 단백질 응집에 미치는 영향을 분석하도록 수정될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 프로테오독성 항균제로 상이한 대장균 균주를 치료한 후 단백질 골체 형성을 분석하기 위한 최적화된 방법론을 설명한다. 이 프로토콜은 치료 및 치료되지 않은 대장균 세포로부터 불용성 및 용해성 단백질 분획을 동시에 추출할 수 있게 합니다. 세포로부터의 단백질 골재 절연을 위한 기존 프로토콜에 비해14,15,<sup…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 일리노이 주립 대학 생물 과학 스타트업 기금, 일리노이 주립 대학 뉴 교수 이니셔티브 그랜트, NIAID 보조금 R15AI164585 (J.U. D.). G.M.A.는 일리노이 주립 대학 학부 연구 지원 프로그램 (G.M.A.에 의해 지원되었다. K. P. H.는 독일 학술 교류 서비스(DAAD)에서 제공하는 RISE 펠로우십의 지원을 받았습니다. 저자는 AGXX 분말을 제공 에 대한 라지네텍 버트리브 GmbH에서 박사 우웨 란다우와 박사 카스텐 마이어 에게 감사드립니다. 그림 1, 도 2, 그림 3, 그림 4,그림 5는 바이오렌더로 생성되었다.
Materials
| Chemicals/Reagents | |||
| Acetone | Fisher Scientific | 67-64-1 | |
| 30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1 | Bio-Rad | 1610156 | |
| Ammonium persulfate | Millipore Sigma | A3678-100G | |
| Benzonase nuclease | Sigma | E1014-5KU | |
| Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa | GoldBio | P008-500 | |
| β-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-100ML | |
| Bromophenol blue | GoldBio | B-092-25 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | MP Biomedicals LLC | 821616 | |
| D-Glucose | Millipore Sigma | G8270-1KG | |
| D-Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | SLBT9686 | |
| Glacial Acetic acid | Millipore Sigma | ARK2183-1L | |
| Glycerol, 99% | Sigma-Aldrich | G5516-1L | |
| Glycine | GoldBio | G-630-1 | |
| Hydrochloric acid, ACS reagent | Sigma-Aldrich | 320331-2.5L | |
| Isopropanol (2-Propanol) | Sigma | 402893-2.5L | |
| LB broth (Miller) | Millipore Sigma | L3522-1KG | |
| LB broth with agar (Miller) | Millipore Sigma | L2897-1KG | |
| Lysozyme | GoldBio | L-040-25 | |
| 10x MOPS Buffer | Teknova | M2101 | |
| Nonidet P-40 | Thomas Scientific | 9036-19-5 | |
| Potassium phosphate, dibasic | Sigma-Aldrich | P3786-1KG | |
| Potassium phosphate, monobasic | Acros Organics | 7778-77-0 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Millipore Sigma | T9281-50ML | |
| Thiamine | Sigma-Aldrich | T4625-100G | |
| 100% Trichloroacetic acid | Millipore Sigma | T6399-100G | |
| Tris base | GoldBio | T-400-1 | |
| Material/Equipment | |||
| Centrifuge tubes (15 mL) | Alkali Scientific | JABG-1019 | |
| Erlenmeyer flask (125 mL) | Carolina | 726686 | |
| Erlenmeyer flask (500 mL) | Carolina | 726694 | |
| Freezer: -80 °C | Fisher Scientific | ||
| Glass beads (0.5 mm) | BioSpec Products | 1107-9105 | |
| Microcentrifuge | Hermle | Z216MK | |
| Microcentriguge tubes (1.7 mL) | VWR International | 87003-294 | |
| Microcentriguge tubes (2.0 mL) | Axygen Maxiclear Microtubes | MCT-200-C | |
| Plastic cuvettes | Fischer Scientific | 14-377-012 | |
| Power supply | ThermoFisher Scientific | EC105 | |
| Rocker | Alkali Scientific | RS7235 | |
| Shaking incubator (37 °C) | Benchmark Scientific | ||
| Small glass plate | Bio-Rad | 1653311 | |
| Spacer plates (1 mm) | Bio-Rad | 1653308 | |
| Spectrophotometer | Thermoscientific | 3339053 | |
| Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes | Beckman-Coulter | ||
| Vertical gel electrophoresis chamber | Bio-Rad | 1658004 | |
| Vortexer | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 | |
| Thermomixer | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
| 10 well comb | Bio-Rad | 1653359 |
Referências
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