タンパク質毒性ストストレスマによる 大腸菌 治療後のタンパク質凝集体の抽出と可視化
Summary
このプロトコルは、タンパク質毒性抗菌剤による処理後の 大腸菌 からの凝集および可溶性タンパク質の抽出と可視化を記述する。この手順に従うと、異なる細菌株および/または治療間 のインビボで のタンパク質凝集形成の定性的比較が可能となる。
Abstract
環境や細胞のストレスに生物を曝露すると、しばしばタンパク質の恒常性の混乱を引き起こし、タンパク質凝集を引き起こす可能性があります。細菌細胞のタンパク質凝集体の蓄積は、増殖速度の低下、耐ストレス性、および毒性を含む細胞の現象行動の有意な変化につながる可能性があります。これらのストレータ媒介性型の検討にはいくつかの実験手順が存在する。この論文では、銀ルテニウム含有抗菌剤による処理後の、異なる 大腸菌 株からの凝集および可溶性タンパク質の抽出と可視化に対する最適化アッセイについて述べている。この化合物は、活性酸素種を生成することが知られており、広範囲にわたるタンパク質凝集を引き起こす。
この方法は、処理細胞および未処理細胞からのタンパク質凝集体と可溶性タンパク質の遠心分離と、その後の分離および可視化を、ドデシル硫酸-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)およびクママシー染色と組み合わせたものです。このアプローチは、単純で高速であり、異なる 大腸菌 株におけるタンパク質凝集体形成の定性的比較を可能にする。この方法論は、幅広い細菌における 生体内 タンパク質凝集に対する他のタンパク質毒性抗菌薬の影響を調べる可能性を含む、幅広い用途を有する。さらに、プロトコールは、タンパク質毒性物質に対する耐性の増大に寄与する遺伝子を同定するために使用することができる。ゲルバンドは、特に凝集しやすいタンパク質のその後の同定に使用できます。
Introduction
細菌は必然的に無数の環境ストレスにさらされ、 低pH(例えば哺乳類の胃の中)1、2、活性酸素および塩素種(ROS/RCS)(例えば、食細胞中の酸化バースト中)3、4、5、高温(例えば、温泉または熱ショック中)6、7、およびいくつかの強力な抗菌剤(例えば、このプロトコルで使用されるAGXX)タンパク質はこれらのストレッサーのいずれかに対して特に脆弱であり、暴露はタンパク質を引き起こす可能性があります。すべての生物は、タンパク質の誤折9に対処できる保護システムを採用しています。しかし、重度のストレスはタンパク質の品質管理機械を圧倒し、タンパク質の二次および/または三次構造を破壊し、最終的にタンパク質を不活性化させる可能性があります。その結果、タンパク質凝集体は、細菌の増殖および生存、ストレス耐性、および毒性10に必要な重要な細胞機能を著しく損なう可能性がある。したがって、タンパク質の凝集と細菌の影響に焦点を当てた研究は、感染症のコントロールに及ぼす潜在的な影響のために関連するトピックです。
熱誘起タンパク質の展開と凝集は、しばしば可逆的である7.対照的に、酸化ストレスなどの他のタンパク質毒性ストレスは、特定のアミノ酸側鎖の酸化によって不可逆的なタンパク質修飾を引き起こし、タンパク質の非改ざんを生じ、最終的にはタンパク質凝集4を引き起こす可能性がある。ストレス誘発不溶性タンパク質凝集体の形成は、酵母および細菌11、12、13におけるシャペロン分子およびその保護機能のコンテキストにおいて広く研究されている。不溶性タンパク質凝集体14、15、16、17の分離および分析のために様々な生化学的技術を利用するいくつかのプロトコルが発表されている。既存のプロトコルは、主に熱ショックや分子シャペロンの同定時に細菌タンパク質凝集を研究するために使用されてきました。これらのプロトコルは確かにこの分野への進歩でしたが、(i)細胞破壊器、フランスのプレス、および/または超音波処理14、15、17、または(iii)時間を消費する反復を含む複雑な物理的破壊プロセスの大きな細菌培養量を必要とするため、実験的手順には大きな不便があります。 洗浄およびインキュベーションステップ15、16、17。
本論文では、これまでのアプローチの限界に対処し、タンパク質毒性抗菌表面コーティングによる処理後に2種類のエシェリヒア・コリ株で形成されるタンパク質凝集体の量を分析することを目的とした改変プロトコルについて述べている。コーティングは、アスコルビン酸で金属銀(Ag)とルテニウム(Ru)を条件とし、その抗菌活性は活性酸素種8、18の生成によって達成される。本明細書において、抗菌性化合物による処理後の細菌培養物の調製の詳細な説明と、抗菌性の濃度を増加させるに対して明確な感受性プロファイルを有する2つの大腸菌株の曝露時のタンパク質凝集状態の比較である。記載された方法は、安価で、速く、かつ再現性が高く、他のタンパク質毒性化合物の存在下でタンパク質凝集を研究するために使用することができる。さらに、プロトコルを変更して、特定の遺伝子欠失がさまざまな異なる細菌のタンパク質凝集に与える影響を分析することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、タンパク質毒性抗菌性を有する異なる大腸菌株の処理後のタンパク質凝集体形成の分析のための最適化された方法論を記述する。このプロトコルは、処理された未処理の大腸菌細胞からの不溶性および可溶性タンパク質画分の同時抽出を可能にする。細胞14、15、16、20からのタンパク質凝集分離のための既存のプロトコルと比較して、この方法はいく…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、イリノイ州立大学生物科学部のスタートアップ資金、イリノイ州立大学新学部イニシアチブ助成金、NIAID助成金R15AI164585(J.-Uに対して支援されました。D.).G.M A.はイリノイ州立大学学部研究支援プログラム(G.M.A.)の支援を受けています。K. P. H. は、ドイツ学術交流サービス (DAAD) が提供する RISE フェローシップによって支援されました。著者らは、AGXX粉末を提供してくれたラージテック・ヴェルトリエブス社のウーヴェ・ランダウ博士とカーステン・マイヤー博士に感謝している。図1、図2、図3、図4、図5は、Biorenderで生成された。
Materials
| Chemicals/Reagents | |||
| Acetone | Fisher Scientific | 67-64-1 | |
| 30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1 | Bio-Rad | 1610156 | |
| Ammonium persulfate | Millipore Sigma | A3678-100G | |
| Benzonase nuclease | Sigma | E1014-5KU | |
| Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa | GoldBio | P008-500 | |
| β-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-100ML | |
| Bromophenol blue | GoldBio | B-092-25 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | MP Biomedicals LLC | 821616 | |
| D-Glucose | Millipore Sigma | G8270-1KG | |
| D-Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | SLBT9686 | |
| Glacial Acetic acid | Millipore Sigma | ARK2183-1L | |
| Glycerol, 99% | Sigma-Aldrich | G5516-1L | |
| Glycine | GoldBio | G-630-1 | |
| Hydrochloric acid, ACS reagent | Sigma-Aldrich | 320331-2.5L | |
| Isopropanol (2-Propanol) | Sigma | 402893-2.5L | |
| LB broth (Miller) | Millipore Sigma | L3522-1KG | |
| LB broth with agar (Miller) | Millipore Sigma | L2897-1KG | |
| Lysozyme | GoldBio | L-040-25 | |
| 10x MOPS Buffer | Teknova | M2101 | |
| Nonidet P-40 | Thomas Scientific | 9036-19-5 | |
| Potassium phosphate, dibasic | Sigma-Aldrich | P3786-1KG | |
| Potassium phosphate, monobasic | Acros Organics | 7778-77-0 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Millipore Sigma | T9281-50ML | |
| Thiamine | Sigma-Aldrich | T4625-100G | |
| 100% Trichloroacetic acid | Millipore Sigma | T6399-100G | |
| Tris base | GoldBio | T-400-1 | |
| Material/Equipment | |||
| Centrifuge tubes (15 mL) | Alkali Scientific | JABG-1019 | |
| Erlenmeyer flask (125 mL) | Carolina | 726686 | |
| Erlenmeyer flask (500 mL) | Carolina | 726694 | |
| Freezer: -80 °C | Fisher Scientific | ||
| Glass beads (0.5 mm) | BioSpec Products | 1107-9105 | |
| Microcentrifuge | Hermle | Z216MK | |
| Microcentriguge tubes (1.7 mL) | VWR International | 87003-294 | |
| Microcentriguge tubes (2.0 mL) | Axygen Maxiclear Microtubes | MCT-200-C | |
| Plastic cuvettes | Fischer Scientific | 14-377-012 | |
| Power supply | ThermoFisher Scientific | EC105 | |
| Rocker | Alkali Scientific | RS7235 | |
| Shaking incubator (37 °C) | Benchmark Scientific | ||
| Small glass plate | Bio-Rad | 1653311 | |
| Spacer plates (1 mm) | Bio-Rad | 1653308 | |
| Spectrophotometer | Thermoscientific | 3339053 | |
| Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes | Beckman-Coulter | ||
| Vertical gel electrophoresis chamber | Bio-Rad | 1658004 | |
| Vortexer | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 | |
| Thermomixer | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
| 10 well comb | Bio-Rad | 1653359 |
Referências
- Dahl, J. -. U., et al. HdeB functions as an acid-protective chaperone in bacteria. Journal of Biological Chemistry. 290 (1), 65-75 (2015).
- Foit, L., George, J. S., Zhang, B. W., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. Chaperone activation by unfolding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 1254-1262 (2013).
- Sultana, S., Foti, A., Dahl, J. -. U. Bacterial defense systems against the neutrophilic oxidant hypochlorous acid. Infection and Immunity. 88 (7), 00964 (2020).
- Dahl, J. -. U., Gray, M. J., Jakob, U. Protein quality control under oxidative stress conditions. Journal of Molecular Biology. 427 (7), 1549-1563 (2015).
- Groitl, B., Dahl, J. -. U., Schroeder, J. W., Jakob, U. Pseudomonas aeruginosa defense systems against microbicidal oxidants. Molecular Microbiology. 106 (3), 335-350 (2017).
- Casadevall, A. Thermal restriction as an antimicrobial function of fever. PLoS Pathogens. 12 (5), 1005577 (2016).
- Richter, K., Haslbeck, M., Buchner, J. The heat shock response: life on the verge of death. Molecular Cell. 40 (2), 253-266 (2010).
- Van Loi, V., Busche, T., Preuß, T., Kalinowski, J., Bernhardt, J. The AGXX ® antimicrobial coating causes a thiol-specific oxidative stress response and protein S-bacillithiolation in Staphylococcus aureus. Frontiers in Microbiology. 9, 3037 (2018).
- Anfinsen, C. B., Scheraga, H. A. Experimental and theoretical aspects of protein folding. Advances in Protein Chemistry. 29, 205-300 (1975).
- Schramm, F. D., Schroeder, K., Jonas, K. Protein aggregation in bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 44 (1), 54-72 (2020).
- Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol. Molecular Microbiology. 40 (2), 397-413 (2001).
- Gray, M. J., et al. Polyphosphate is a primordial chaperone. Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).
- Weids, A. J., Ibstedt, S., Tamás, M. J., Grant, C. M. Distinct stress conditions result in aggregation of proteins with similar properties. Scientific Reports. 6, 24554 (2016).
- Mogk, A., et al. Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB. EMBO Journal. 18 (24), 6934-6949 (1999).
- Fay, A., Glickman, M. S. An essential nonredundant role for mycobacterial DnaK in native protein folding. PLoS Genetics. 10 (7), 1004516 (2014).
- Schramm, F. D., Heinrich, K., Thüring, M., Bernhardt, J., Jonas, K. An essential regulatory function of the DnaK chaperone dictates the decision between proliferation and maintenance in Caulobacter crescentus. PLoS Genetics. 13 (12), 1007148 (2017).
- Maisonneuve, E., Fraysse, L., Moinier, D., Dukan, S. Existence of abnormal protein aggregates in healthy Escherichia coli cells. Journal of Bacteriology. 190 (3), 887-893 (2008).
- Heiss, A., Freisinger, B., Held-Föhn, E. Enhanced antibacterial activity of silver-ruthenium coated hollow microparticles. Biointerphases. 12 (5), (2017).
- Papnayotou, I., Sun, B., Roth, A. F., Davis, N. G. Protein aggregation induced during glass bead lysis of yeast. Yeast. 27 (10), 801-816 (2010).
- Chuang, S. E., Blattner, F. R. Characterization of twenty-six new heat shock genes of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 175 (16), 5242-5252 (1993).
- Imlay, J. A. The molecular mechanisms and physiological consequences of oxidative stress: Lessons from a model bacterium. Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 443-454 (2013).
- Mühlhofer, M., et al. The heat shock response in yeast maintains protein homeostasis by chaperoning and replenishing proteins. Cell Reports. 29 (13), 4593-4607 (2019).
- Chandrangsu, P., Rensing, C., Helmann, J. D. Metal homeostasis and resistance in bacteria. Nature Reviews Microbiology. 15, 338-350 (2017).
- Stevens, M., et al. HSP60/10 chaperonin systems are inhibited by a variety of approved drugs, natural products, and known bioactive molecules. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 29 (9), 1106-1112 (2019).
- Schramm, F. D., Schroeder, K., Alvelid, J., Testa, I., Jonas, K. Growth-driven displacement of protein aggregates along the cell length ensures partitioning to both daughter cells in Caulobacter crescentus. Molecular Microbiology. 111 (6), 1430-1448 (2019).
