מיצוי והדמיה של אגרגטים חלבון לאחר טיפול של Escherichia coli עם מתח פרוטאוטוקסי
Summary
פרוטוקול זה מתאר את החילוץ והדמיון של חלבונים מצטברים ומסיסים מ Escherichia coli לאחר טיפול עם מיקרוביאלית פרוטאוטוקסית. בעקבות הליך זה מאפשרת השוואה איכותית של היווצרות צבירה של חלבון ב- vivo בזני חיידקים שונים ו/או בין טיפולים.
Abstract
החשיפה של אורגניזמים חיים ללחצים סביבתיים ותאיים גורמת לעתים קרובות לשיבושים בהומאוסטזיס של חלבונים ויכולה לגרום לצבירה של חלבונים. הצטברות של אגרגטים חלבון בתאי חיידקים יכול להוביל לשינויים משמעותיים בהתנהגות פנוטיפית הסלולר, כולל ירידה בשיעורי הצמיחה, עמידות ללחץ, וארס. קיימים מספר הליכים ניסיוניים לבדיקת פנוטיפים אלה בתיווך הלחץ. מאמר זה מתאר בדיקה ממוטבת להפקה והדמיה של חלבונים מצטברים ומסיסים מזני קולי שונים של אשריצ’יה לאחר טיפול במיקרוביאלית המכילה כסף-רותניום. תרכובת זו ידועה לייצר מינים חמצן תגובתי וגורם צבירת חלבון נרחבת.
השיטה משלבת הפרדה מבוססת צנטריפוגה של אגרגטים של חלבונים וחלבונים מסיסים מתאים מטופלים ולא מטופלים עם הפרדה והדמיה לאחר מכן על ידי נתרן דודזיל סולפט-פוליאקרילמיד ג’ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) וכתמים קומאסי. גישה זו פשוטה, מהירה, ומאפשרת השוואה איכותית של היווצרות צבירה של חלבונים בזני E. coli שונים. למתודולוגיה מגוון רחב של יישומים, כולל האפשרות לחקור את ההשפעה של מיקרוביאלים פרוטאוטוקסיים אחרים על צבירת חלבון ויו במגוון רחב של חיידקים. יתר על כן, הפרוטוקול יכול לשמש כדי לזהות גנים התורמים עמידות מוגברת לחומרים פרוטאוטוקסיים. רצועות ג’ל יכולות לשמש לזיהוי מאוחר יותר של חלבונים הנוטים במיוחד לצבירה.
Introduction
חיידקים חשופים באופן בלתי נמנע לאינספור לחצים סביבתיים, כולל רמת כוח נמוכה (למשל, בקיבה היונקית)1,2, מינים תגובתיים של חמצן וכלור (ROS/RCS) (למשל, במהלך התפרצות חמצונית בפגוציטים)3,4,5, טמפרטורות גבוהות (למשל, במעיינות חמים או במהלך הלם חום)6,7, וכמה מיקרוביאלים חזקים (למשל, AGXX המשמש בפרוטוקול זה)8. חלבונים פגיעים במיוחד לכל אחד מגורשי הלחץ האלה, וחשיפה יכולה לעורר חלבון un-/misfolding כי אז צבירת זרעים. כל האורגניזמים משתמשים במערכות הגנה המאפשרות להם להתמודד עם תקלות חלבון9. עם זאת, מתח חמור יכול להציף את מכונות בקרת איכות החלבון ולשבש את המבנה המשני ו /או שלישוני של חלבונים, אשר בסופו של דבר מנטרל חלבונים. כתוצאה מכך, אגרגטים של חלבונים עלולים לפגוע קשות בתפקודים תאיים קריטיים הנדרשים לצמיחה והישרדות חיידקים, עמידות ללחץ וארס10. לכן, מחקר המתמקד בצבירה של חלבונים והשלכותיו בחיידקים הוא נושא רלוונטי בשל השפעתו הפוטנציאלית על בקרת מחלות זיהומיות.
חלבון המושרה בחום מתפתח וצבירה הם לעתים קרובות הפיכים7. לעומת זאת, לחצים פרוטאוטוקסיים אחרים, כגון עקה חמצונית, יכולים לגרום לשינויים בלתי הפיכים בחלבון באמצעות חמצון של שרשראות צד ספציפיות של חומצות אמינו וכתוצאה מכך חלבון un-/misfolding, ובסופו של דבר, צבירת חלבון4. היווצרות הנגרמת על ידי מתח של אגרגטים חלבון מסיס נחקר בהרחבה בהקשר של מלווים מולקולריים ותפקודי המגן שלהם שמרים וחיידקים11,12,13. כמה פרוטוקולים פורסמו המשתמשים במגוון טכניקות ביוכימיות לבידוד וניתוח של אגרגטים חלבון מסיסים14,15,16,17. הפרוטוקולים הקיימים שימשו בעיקר לחקר צבירת חלבונים חיידקיים על הלם חום ו / או זיהוי של מלווים מולקולריים. בעוד פרוטוקולים אלה בהחלט היו התקדמות לתחום, יש כמה אי נוחות גדולה בהליכים הניסיוניים כי הם דורשים (i) נפח תרבית חיידקים גדולה של עד 10 L14,17, (ii) תהליכי שיבוש פיזיים מסובכים, כולל שימוש משבשי תאים, עיתונות צרפתית, ו / או sonication14,15,17, או (iii) זמן רב חוזר שטיפה ודגרה שלבים15,16,17.
מאמר זה מתאר פרוטוקול שונה שמטרתו לטפל במגבלות הגישות הקודמות ומאפשר ניתוח של כמות אגרגלי החלבון שנוצרו בשני זני קולי שונים של Escherichia לאחר טיפול בציפוי משטח מיקרוביאלי פרוטאוטוקסי. הציפוי מורכב מתכת כסף (Ag) ורותניום (Ru) מותנה בחומצה אסקורבית, ופעילותו מיקרוביאלית מושגת על ידי הדור של מיני חמצן תגובתי8,18. להלן תיאור מפורט של הכנת תרבית החיידקים לאחר הטיפול בתרכובת האנטי מיקרוביאלית והשוואה של מצב צבירת החלבון עם חשיפה של שני זני E. coli עם פרופילי רגישות ברורים להגברת הריכוז של מיקרוביאלית. השיטה המתוארת היא זולה, מהירה וניתן לשחזור וניתן להשתמש בה כדי לחקור צבירת חלבונים בנוכחות תרכובות פרוטאוטוקסיות אחרות. בנוסף, ניתן לשנות את הפרוטוקול כדי לנתח את ההשפעה שיש למחיקות גנים ספציפיות על צבירת חלבונים במגוון חיידקים שונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה ממוטבת לניתוח היווצרות צבירה של חלבונים לאחר טיפול בזני E. coli שונים עם מיקרוביאלית פרוטאוטוקסית. הפרוטוקול מאפשר מיצוי סימולטני של שברי חלבון בלתי מסיסים ותאי E. coli מטופלים ולא מטופלים. בהשוואה לפרוטוקולים הקיימים לבידוד צבירה של חלבונים מתאים<sup class="x…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרנות הסטארט-אפ של בית הספר למדעי הביולוגיה של אוניברסיטת אילינוי, מענק יוזמת הפקולטה החדשה של אוניברסיטת אילינוי, ומענק NIAID R15AI164585 (ל- J.-U. D.). G.M.A. נתמך על ידי תוכנית התמיכה במחקר לתואר ראשון באוניברסיטת אילינוי (ל- G.M.A.). K. P. H. נתמך על ידי מלגת RISE שסופקה על ידי שירות חילופי האקדמיה הגרמנית (DAAD). המחברים מודים לד”ר אוו לנדאו וד”ר קרסטן מאייר מ-Largentech Vertriebs GmbH על אספקת אבקת AGXX. איור 3 , איור 4 ואיור 5 נוצרו עם Biorender.
Materials
| Chemicals/Reagents | |||
| Acetone | Fisher Scientific | 67-64-1 | |
| 30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1 | Bio-Rad | 1610156 | |
| Ammonium persulfate | Millipore Sigma | A3678-100G | |
| Benzonase nuclease | Sigma | E1014-5KU | |
| Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa | GoldBio | P008-500 | |
| β-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-100ML | |
| Bromophenol blue | GoldBio | B-092-25 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | MP Biomedicals LLC | 821616 | |
| D-Glucose | Millipore Sigma | G8270-1KG | |
| D-Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | SLBT9686 | |
| Glacial Acetic acid | Millipore Sigma | ARK2183-1L | |
| Glycerol, 99% | Sigma-Aldrich | G5516-1L | |
| Glycine | GoldBio | G-630-1 | |
| Hydrochloric acid, ACS reagent | Sigma-Aldrich | 320331-2.5L | |
| Isopropanol (2-Propanol) | Sigma | 402893-2.5L | |
| LB broth (Miller) | Millipore Sigma | L3522-1KG | |
| LB broth with agar (Miller) | Millipore Sigma | L2897-1KG | |
| Lysozyme | GoldBio | L-040-25 | |
| 10x MOPS Buffer | Teknova | M2101 | |
| Nonidet P-40 | Thomas Scientific | 9036-19-5 | |
| Potassium phosphate, dibasic | Sigma-Aldrich | P3786-1KG | |
| Potassium phosphate, monobasic | Acros Organics | 7778-77-0 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Millipore Sigma | T9281-50ML | |
| Thiamine | Sigma-Aldrich | T4625-100G | |
| 100% Trichloroacetic acid | Millipore Sigma | T6399-100G | |
| Tris base | GoldBio | T-400-1 | |
| Material/Equipment | |||
| Centrifuge tubes (15 mL) | Alkali Scientific | JABG-1019 | |
| Erlenmeyer flask (125 mL) | Carolina | 726686 | |
| Erlenmeyer flask (500 mL) | Carolina | 726694 | |
| Freezer: -80 °C | Fisher Scientific | ||
| Glass beads (0.5 mm) | BioSpec Products | 1107-9105 | |
| Microcentrifuge | Hermle | Z216MK | |
| Microcentriguge tubes (1.7 mL) | VWR International | 87003-294 | |
| Microcentriguge tubes (2.0 mL) | Axygen Maxiclear Microtubes | MCT-200-C | |
| Plastic cuvettes | Fischer Scientific | 14-377-012 | |
| Power supply | ThermoFisher Scientific | EC105 | |
| Rocker | Alkali Scientific | RS7235 | |
| Shaking incubator (37 °C) | Benchmark Scientific | ||
| Small glass plate | Bio-Rad | 1653311 | |
| Spacer plates (1 mm) | Bio-Rad | 1653308 | |
| Spectrophotometer | Thermoscientific | 3339053 | |
| Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes | Beckman-Coulter | ||
| Vertical gel electrophoresis chamber | Bio-Rad | 1658004 | |
| Vortexer | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 | |
| Thermomixer | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
| 10 well comb | Bio-Rad | 1653359 |
Referências
- Dahl, J. -. U., et al. HdeB functions as an acid-protective chaperone in bacteria. Journal of Biological Chemistry. 290 (1), 65-75 (2015).
- Foit, L., George, J. S., Zhang, B. W., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. Chaperone activation by unfolding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 1254-1262 (2013).
- Sultana, S., Foti, A., Dahl, J. -. U. Bacterial defense systems against the neutrophilic oxidant hypochlorous acid. Infection and Immunity. 88 (7), 00964 (2020).
- Dahl, J. -. U., Gray, M. J., Jakob, U. Protein quality control under oxidative stress conditions. Journal of Molecular Biology. 427 (7), 1549-1563 (2015).
- Groitl, B., Dahl, J. -. U., Schroeder, J. W., Jakob, U. Pseudomonas aeruginosa defense systems against microbicidal oxidants. Molecular Microbiology. 106 (3), 335-350 (2017).
- Casadevall, A. Thermal restriction as an antimicrobial function of fever. PLoS Pathogens. 12 (5), 1005577 (2016).
- Richter, K., Haslbeck, M., Buchner, J. The heat shock response: life on the verge of death. Molecular Cell. 40 (2), 253-266 (2010).
- Van Loi, V., Busche, T., Preuß, T., Kalinowski, J., Bernhardt, J. The AGXX ® antimicrobial coating causes a thiol-specific oxidative stress response and protein S-bacillithiolation in Staphylococcus aureus. Frontiers in Microbiology. 9, 3037 (2018).
- Anfinsen, C. B., Scheraga, H. A. Experimental and theoretical aspects of protein folding. Advances in Protein Chemistry. 29, 205-300 (1975).
- Schramm, F. D., Schroeder, K., Jonas, K. Protein aggregation in bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 44 (1), 54-72 (2020).
- Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol. Molecular Microbiology. 40 (2), 397-413 (2001).
- Gray, M. J., et al. Polyphosphate is a primordial chaperone. Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).
- Weids, A. J., Ibstedt, S., Tamás, M. J., Grant, C. M. Distinct stress conditions result in aggregation of proteins with similar properties. Scientific Reports. 6, 24554 (2016).
- Mogk, A., et al. Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB. EMBO Journal. 18 (24), 6934-6949 (1999).
- Fay, A., Glickman, M. S. An essential nonredundant role for mycobacterial DnaK in native protein folding. PLoS Genetics. 10 (7), 1004516 (2014).
- Schramm, F. D., Heinrich, K., Thüring, M., Bernhardt, J., Jonas, K. An essential regulatory function of the DnaK chaperone dictates the decision between proliferation and maintenance in Caulobacter crescentus. PLoS Genetics. 13 (12), 1007148 (2017).
- Maisonneuve, E., Fraysse, L., Moinier, D., Dukan, S. Existence of abnormal protein aggregates in healthy Escherichia coli cells. Journal of Bacteriology. 190 (3), 887-893 (2008).
- Heiss, A., Freisinger, B., Held-Föhn, E. Enhanced antibacterial activity of silver-ruthenium coated hollow microparticles. Biointerphases. 12 (5), (2017).
- Papnayotou, I., Sun, B., Roth, A. F., Davis, N. G. Protein aggregation induced during glass bead lysis of yeast. Yeast. 27 (10), 801-816 (2010).
- Chuang, S. E., Blattner, F. R. Characterization of twenty-six new heat shock genes of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 175 (16), 5242-5252 (1993).
- Imlay, J. A. The molecular mechanisms and physiological consequences of oxidative stress: Lessons from a model bacterium. Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 443-454 (2013).
- Mühlhofer, M., et al. The heat shock response in yeast maintains protein homeostasis by chaperoning and replenishing proteins. Cell Reports. 29 (13), 4593-4607 (2019).
- Chandrangsu, P., Rensing, C., Helmann, J. D. Metal homeostasis and resistance in bacteria. Nature Reviews Microbiology. 15, 338-350 (2017).
- Stevens, M., et al. HSP60/10 chaperonin systems are inhibited by a variety of approved drugs, natural products, and known bioactive molecules. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 29 (9), 1106-1112 (2019).
- Schramm, F. D., Schroeder, K., Alvelid, J., Testa, I., Jonas, K. Growth-driven displacement of protein aggregates along the cell length ensures partitioning to both daughter cells in Caulobacter crescentus. Molecular Microbiology. 111 (6), 1430-1448 (2019).
