Extraktion und Visualisierung von Proteinaggregaten nach Behandlung von Escherichia coli mit einem proteotoxischen Stressor
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Extraktion und Visualisierung von aggregierten und löslichen Proteinen aus Escherichia coli nach Behandlung mit einem proteotoxischen antimikrobiellen Mittel. Nach diesem Verfahren kann ein qualitativer Vergleich der Proteinaggregatbildung in vivo in verschiedenen Bakterienstämmen und/oder zwischen Behandlungen ermöglicht werden.
Abstract
Die Exposition lebender Organismen gegenüber Umwelt- und Zellstress verursacht häufig Störungen in der Proteinöostase und kann zu einer Proteinaggregation führen. Die Ansammlung von Proteinaggregaten in Bakterienzellen kann zu signifikanten Veränderungen des zellulären phänotypischen Verhaltens führen, einschließlich einer Verringerung der Wachstumsraten, der Stressresistenz und der Virulenz. Für die Untersuchung dieser stressorvermittelten Phänotypen existieren mehrere experimentelle Verfahren. Dieser Artikel beschreibt einen optimierten Assay für die Extraktion und Visualisierung von aggregierten und löslichen Proteinen aus verschiedenen Escherichia coli-Stämmen nach Behandlung mit einem silber-rutheniumhaltigen antimikrobiellen Mittel. Es ist bekannt, dass diese Verbindung reaktive Sauerstoffspezies erzeugt und eine weit verbreitete Proteinaggregation verursacht.
Die Methode kombiniert eine zentrifugationsbasierte Trennung von Proteinaggregaten und löslichen Proteinen aus behandelten und unbehandelten Zellen mit anschließender Trennung und Visualisierung durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Coomassie-Färbung. Dieser Ansatz ist einfach, schnell und ermöglicht einen qualitativen Vergleich der Proteinaggregatbildung in verschiedenen E. coli-Stämmen. Die Methodik hat eine breite Palette von Anwendungen, einschließlich der Möglichkeit, den Einfluss anderer proteotoxischer antimikrobieller Mittel auf die In-vivo-Proteinaggregation in einer Vielzahl von Bakterien zu untersuchen. Darüber hinaus kann das Protokoll verwendet werden, um Gene zu identifizieren, die zu einer erhöhten Resistenz gegen proteotoxische Substanzen beitragen. Gelbänder können zur anschließenden Identifizierung von Proteinen verwendet werden, die besonders anfällig für Aggregation sind.
Introduction
Bakterien sind unweigerlich einer Vielzahl von Umweltbelastungen ausgesetzt, darunter ein niedriger pH-Wert (z. B. im Säugetiermagen)1,2, reaktive Sauerstoff- und Chlorspezies (ROS / RCS) (z. B. während des oxidativen Bursts in Phagozyten)3,4,5, erhöhte Temperaturen (z. B. in heißen Quellen oder während des Hitzeschocks)6,7und mehrere starke antimikrobielle Mittel (z. B. AGXX, die in diesem Protokoll verwendet werden)8. Proteine sind besonders anfällig für einen dieser Stressoren, und die Exposition kann zu einer Proteinentfaltung führen, die dann die Aggregation aussaatiert. Alle Organismen verwenden Schutzsysteme, die es ihnen ermöglichen, mit Proteinfehlfaltungen fertig zu werden9. Starker Stress kann jedoch die Proteinqualitätskontrollmaschinerie überfordern und die sekundäre und / oder tertiäre Struktur von Proteinen stören, was letztendlich Proteine inaktiviert. Infolgedessen können Proteinaggregate kritische Zellfunktionen, die für das Wachstum und Überleben von Bakterien, die Stressresistenz und die Virulenz erforderlich sind, stark beeinträchtigen10. Daher ist die Forschung, die sich auf die Proteinaggregation und ihre Folgen in Bakterien konzentriert, aufgrund ihrer möglichen Auswirkungen auf die Kontrolle von Infektionskrankheiten ein relevantes Thema.
Hitzeinduzierte Proteinentfaltung und -aggregation sind oft reversibel7. Im Gegensatz dazu können andere proteotoxische Belastungen, wie oxidativer Stress, irreversible Proteinmodifikationen durch die Oxidation spezifischer Aminosäure-Seitenketten verursachen, was zu einer Proteinentfaltung und schließlich zu einer Proteinaggregation führt4. Die stressinduzierte Bildung unlöslicher Proteinaggregate wurde ausführlich im Zusammenhang mit molekularen Chaperonen und deren Schutzfunktionen in Hefen und Bakterien untersucht11,12,13. Es wurden mehrere Protokolle veröffentlicht, die eine Vielzahl von biochemischen Techniken zur Isolierung und Analyse von unlöslichen Proteinaggregatenverwenden 14,15,16,17. Die bestehenden Protokolle wurden hauptsächlich verwendet, um die bakterielle Proteinaggregation bei Hitzeschock und / oder die Identifizierung molekularer Chaperone zu untersuchen. Während diese Protokolle sicherlich ein Fortschritt auf dem Gebiet waren, gibt es einige große Unannehmlichkeiten in den experimentellen Verfahren, da sie (i) ein großes Bakterienkulturvolumen von bis zu 10 L14,17, (ii) komplizierte physikalische Störungsprozesse, einschließlich der Verwendung von Zelldisruptoren, französischer Presse und / oder Beschallung14,15,17oder (iii) zeitaufwendige wiederholte Wasch- und Inkubationsschritte15,16,17.
Dieser Artikel beschreibt ein modifiziertes Protokoll, das darauf abzielt, die Grenzen der vorherigen Ansätze anzugehen und die Analyse der Menge an Proteinaggregaten ermöglicht, die in zwei verschiedenen Escherichia coli-Stämmen nach der Behandlung mit einer proteotoxischen antimikrobiellen Oberflächenbeschichtung gebildet werden. Die Beschichtung besteht aus Metall-Silber (Ag) und Ruthenium (Ru)-konditioniert mit Ascorbinsäure, und ihre antimikrobielle Aktivität wird durch die Erzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies8,18erreicht. Hierin finden Sie eine detaillierte Beschreibung der Herstellung der Bakterienkultur nach Behandlung mit der antimikrobiellen Verbindung und einen Vergleich des Proteinaggregationsstatus bei Exposition von zwei E. coli-Stämmen mit unterschiedlichen Anfälligkeitsprofilen für eine zunehmende Konzentration des antimikrobiellen Wirkstoffs. Die beschriebene Methode ist kostengünstig, schnell und reproduzierbar und kann verwendet werden, um die Proteinaggregation in Gegenwart anderer proteotoxischer Verbindungen zu untersuchen. Darüber hinaus kann das Protokoll modifiziert werden, um die Auswirkungen spezifischer Gendreichungen auf die Proteinaggregation in einer Vielzahl verschiedener Bakterien zu analysieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Methodik zur Analyse der Proteinaggregatbildung nach Behandlung verschiedener E. coli-Stämme mit einem proteotoxischen antimikrobiellen Mittel. Das Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Extraktion von unlöslichen und löslichen Proteinfraktionen aus behandelten und unbehandelten E. coli-Zellen. Im Vergleich zu bestehenden Protokollen zur Proteinaggregatisolierung aus den Zellen14,15,<sup…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Startfonds der Illinois State University School of Biological Sciences, den Illinois State University New Faculty Initiative Grant und den NIAID-Zuschuss R15AI164585 (an J.-U. D.). G.M.A. wurde vom Illinois State University Undergraduate Research Support Program (zu G.M.A.) unterstützt. K. P. H. wurde durch ein RISE-Stipendium des Deutschen Akademischen Austauschdienstes (DAAD) unterstützt. Die Autoren danken Dr. Uwe Landau und Dr. Carsten Meyer von der Largentech Vertriebs GmbH für die Bereitstellung des AGXX-Pulvers. Die Abbildungen 1, Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4und Abbildung 5 wurden mit Biorender generiert.
Materials
| Chemicals/Reagents | |||
| Acetone | Fisher Scientific | 67-64-1 | |
| 30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1 | Bio-Rad | 1610156 | |
| Ammonium persulfate | Millipore Sigma | A3678-100G | |
| Benzonase nuclease | Sigma | E1014-5KU | |
| Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa | GoldBio | P008-500 | |
| β-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-100ML | |
| Bromophenol blue | GoldBio | B-092-25 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | MP Biomedicals LLC | 821616 | |
| D-Glucose | Millipore Sigma | G8270-1KG | |
| D-Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | SLBT9686 | |
| Glacial Acetic acid | Millipore Sigma | ARK2183-1L | |
| Glycerol, 99% | Sigma-Aldrich | G5516-1L | |
| Glycine | GoldBio | G-630-1 | |
| Hydrochloric acid, ACS reagent | Sigma-Aldrich | 320331-2.5L | |
| Isopropanol (2-Propanol) | Sigma | 402893-2.5L | |
| LB broth (Miller) | Millipore Sigma | L3522-1KG | |
| LB broth with agar (Miller) | Millipore Sigma | L2897-1KG | |
| Lysozyme | GoldBio | L-040-25 | |
| 10x MOPS Buffer | Teknova | M2101 | |
| Nonidet P-40 | Thomas Scientific | 9036-19-5 | |
| Potassium phosphate, dibasic | Sigma-Aldrich | P3786-1KG | |
| Potassium phosphate, monobasic | Acros Organics | 7778-77-0 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Millipore Sigma | T9281-50ML | |
| Thiamine | Sigma-Aldrich | T4625-100G | |
| 100% Trichloroacetic acid | Millipore Sigma | T6399-100G | |
| Tris base | GoldBio | T-400-1 | |
| Material/Equipment | |||
| Centrifuge tubes (15 mL) | Alkali Scientific | JABG-1019 | |
| Erlenmeyer flask (125 mL) | Carolina | 726686 | |
| Erlenmeyer flask (500 mL) | Carolina | 726694 | |
| Freezer: -80 °C | Fisher Scientific | ||
| Glass beads (0.5 mm) | BioSpec Products | 1107-9105 | |
| Microcentrifuge | Hermle | Z216MK | |
| Microcentriguge tubes (1.7 mL) | VWR International | 87003-294 | |
| Microcentriguge tubes (2.0 mL) | Axygen Maxiclear Microtubes | MCT-200-C | |
| Plastic cuvettes | Fischer Scientific | 14-377-012 | |
| Power supply | ThermoFisher Scientific | EC105 | |
| Rocker | Alkali Scientific | RS7235 | |
| Shaking incubator (37 °C) | Benchmark Scientific | ||
| Small glass plate | Bio-Rad | 1653311 | |
| Spacer plates (1 mm) | Bio-Rad | 1653308 | |
| Spectrophotometer | Thermoscientific | 3339053 | |
| Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes | Beckman-Coulter | ||
| Vertical gel electrophoresis chamber | Bio-Rad | 1658004 | |
| Vortexer | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 | |
| Thermomixer | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
| 10 well comb | Bio-Rad | 1653359 |
Referências
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