用蛋白毒性应激器治疗大 肠杆菌 后蛋白质聚合物的提取和可视化
Summary
本协议描述了用蛋白质毒性抗菌素治疗后从 大肠杆 菌中提取和可溶性蛋白质的提取和可视化。遵循此程序，可以对不同细菌菌株和/或治疗之间的 体内 蛋白质聚合形成进行定性比较。
Abstract
生物体暴露于环境和细胞压力中通常会导致蛋白质平衡的破坏，并可能导致蛋白质聚集。细菌细胞中蛋白质聚合物的积累可导致细胞表型行为发生重大变化，包括生长速率、抗应力和毒性降低。对这些压力源介质表型的检查存在几个实验程序。本文描述了一种优化的检测方法，用于使用含银抗菌素治疗后，从不同的 大肠杆 菌菌株中提取和可溶性蛋白质的提取和可视化。众所周知，这种化合物会产生活性氧物种，并导致广泛的蛋白质聚集。
该方法结合了从治疗和未经处理的细胞中分离出的蛋白质聚合物和可溶性蛋白质的离心分离，以及随后通过硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和库马西染色进行分离和可视化。这种方法简单、快速，允许对不同 大肠杆菌 株中的蛋白质聚合形成进行定性比较。该方法具有广泛的应用，包括研究其他蛋白质抗菌素对多种细菌 体内 蛋白质聚合的影响的可能性。此外，该协议可用于识别有助于增强对蛋白毒物质抵抗力的基因。凝胶带可用于后续识别特别容易聚集的蛋白质。
Introduction
细菌不可避免地会受到无数的环境压力，包括低pH值（例如， 在哺乳动物胃）1，2，活性氧和氯物种（ROS/RCS）（例如，在噬菌细胞氧化爆裂期间）3，4，5，温度升高（如在温泉或热休克期间）6，7，和几个有效的抗菌剂（例如，AGXX用于本协议）8。蛋白质特别容易受到这些压力源的影响，暴露会引发蛋白质的无/误折叠，然后播种聚合。所有生物体都采用保护系统，使它们能够处理蛋白质误折叠9。然而，严重的压力会压倒蛋白质质量控制机制，破坏蛋白质的二级和/或三级结构，最终使蛋白质失活。因此，蛋白质聚合物会严重损害细菌生长和生存、抗压和毒性所需的关键细胞功能。因此，关注蛋白质聚合及其在细菌中的后果的研究是一个相关的课题，因为它对传染病控制的潜在影响。
热诱导蛋白的展开和聚合通常是可逆的7。相比之下，其他蛋白质毒性应激，如氧化应激，可以通过氧化特定的氨基酸侧链导致蛋白质脱/误折叠，并最终导致蛋白质聚合4，从而导致不可逆转的蛋白质改变。压力诱导的不溶性蛋白质聚合物的形成，在分子伴奏及其在酵母和细菌11、12、13中的保护作用的背景下得到了广泛的研究。已经发布了几种协议，利用各种生化技术对不溶性蛋白质聚合物14、15、16、17进行分离和分析。现有协议主要用于研究热休克和/或分子伴郎鉴定后的细菌蛋白聚合。虽然这些协议肯定是该领域的一个进步，但在实验程序中存在一些重大不便，因为它们需要（i）高达 10 L14、17、（ii）复杂的物理干扰过程，包括使用细胞干扰器、法国印刷机和/或声波14、15、17或（iii）耗时的重复 洗涤和孵化步骤15，16，17。
本文描述了一个经过修改的协议，旨在解决以前方法的局限性，并允许分析在治疗后与蛋白毒抗菌表面涂层在两种不同的Escherichia大肠杆菌菌株中形成的蛋白质聚合量。涂层由金属银（Ag）和鲁西尼（鲁）组成，以抗坏血酸为条件，其抗菌活性是通过产生活性氧物种8、18来实现的。以下是细菌培养物与抗菌化合物治疗后的准备的详细描述，以及两种大肠杆菌菌株暴露后蛋白质聚集状态的比较，这些菌株具有明显的易感性，可增加抗菌素的浓度。所述方法价格低廉、速度快且可重复，可用于研究其他蛋白质化合物中的蛋白质聚合。此外，可以修改协议，以分析特定基因缺失对各种不同细菌中的蛋白质聚合的影响。
Protocol
Representative Results
Discussion
本协议描述了一种优化的方法，用于分析蛋白质聚合形成后，处理不同的大肠杆菌菌株与蛋白质毒性抗菌剂。该协议允许同时从经过治疗和未经治疗的大肠杆菌细胞中提取不溶性和可溶性蛋白质分数。与现有的蛋白质聚合分离方案相比，从细胞14，15，16，20，这种方法有几个优点：（?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了伊利诺伊州立大学生物科学学院启动基金、伊利诺伊州立大学新学院倡议赠款和NIAID赠款R15AI164585（J.-U.）的支持。D.).G.M.A.得到了伊利诺伊州立大学本科研究支持计划（对G.M.A.）的支持。K. P. H. 得到了德国学术交流服务局 （DAAD） 提供的 RISE 研究金的支持。作者感谢来自大科技维特里布斯有限公司的乌韦·兰道博士和卡斯滕·迈耶博士提供了AGXX粉末。图1、图2、图3、图4和图5是用生物扳机生成的。
Materials
| Chemicals/Reagents | |||
| Acetone | Fisher Scientific | 67-64-1 | |
| 30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1 | Bio-Rad | 1610156 | |
| Ammonium persulfate | Millipore Sigma | A3678-100G | |
| Benzonase nuclease | Sigma | E1014-5KU | |
| Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa | GoldBio | P008-500 | |
| β-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-100ML | |
| Bromophenol blue | GoldBio | B-092-25 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | MP Biomedicals LLC | 821616 | |
| D-Glucose | Millipore Sigma | G8270-1KG | |
| D-Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | SLBT9686 | |
| Glacial Acetic acid | Millipore Sigma | ARK2183-1L | |
| Glycerol, 99% | Sigma-Aldrich | G5516-1L | |
| Glycine | GoldBio | G-630-1 | |
| Hydrochloric acid, ACS reagent | Sigma-Aldrich | 320331-2.5L | |
| Isopropanol (2-Propanol) | Sigma | 402893-2.5L | |
| LB broth (Miller) | Millipore Sigma | L3522-1KG | |
| LB broth with agar (Miller) | Millipore Sigma | L2897-1KG | |
| Lysozyme | GoldBio | L-040-25 | |
| 10x MOPS Buffer | Teknova | M2101 | |
| Nonidet P-40 | Thomas Scientific | 9036-19-5 | |
| Potassium phosphate, dibasic | Sigma-Aldrich | P3786-1KG | |
| Potassium phosphate, monobasic | Acros Organics | 7778-77-0 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Millipore Sigma | T9281-50ML | |
| Thiamine | Sigma-Aldrich | T4625-100G | |
| 100% Trichloroacetic acid | Millipore Sigma | T6399-100G | |
| Tris base | GoldBio | T-400-1 | |
| Material/Equipment | |||
| Centrifuge tubes (15 mL) | Alkali Scientific | JABG-1019 | |
| Erlenmeyer flask (125 mL) | Carolina | 726686 | |
| Erlenmeyer flask (500 mL) | Carolina | 726694 | |
| Freezer: -80 °C | Fisher Scientific | ||
| Glass beads (0.5 mm) | BioSpec Products | 1107-9105 | |
| Microcentrifuge | Hermle | Z216MK | |
| Microcentriguge tubes (1.7 mL) | VWR International | 87003-294 | |
| Microcentriguge tubes (2.0 mL) | Axygen Maxiclear Microtubes | MCT-200-C | |
| Plastic cuvettes | Fischer Scientific | 14-377-012 | |
| Power supply | ThermoFisher Scientific | EC105 | |
| Rocker | Alkali Scientific | RS7235 | |
| Shaking incubator (37 °C) | Benchmark Scientific | ||
| Small glass plate | Bio-Rad | 1653311 | |
| Spacer plates (1 mm) | Bio-Rad | 1653308 | |
| Spectrophotometer | Thermoscientific | 3339053 | |
| Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes | Beckman-Coulter | ||
| Vertical gel electrophoresis chamber | Bio-Rad | 1658004 | |
| Vortexer | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 | |
| Thermomixer | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
| 10 well comb | Bio-Rad | 1653359 |
Referências
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