प्रोटोटॉक्सिक स्ट्रेसर के साथ एस्चेरिचिया कोलाई के उपचार के बाद प्रोटीन समुच्चय का निष्कर्षण और दृश्य
Summary
यह प्रोटोकॉल एक प्रोटोटॉक्सिक एंटीमाइक्रोबियल के साथ उपचार के बाद एस्चेरिचिया कोलाई से एकत्रित और घुलनशील प्रोटीन के निष्कर्षण और दृश्य का वर्णन करता है। इस प्रक्रिया के बाद विभिन्न जीवाणु उपभेदों और/या उपचार के बीच में वीवो में प्रोटीन समग्र गठन की गुणात्मक तुलना की अनुमति देता है ।
Abstract
पर्यावरण और सेलुलर तनाव के लिए जीवित जीवों के जोखिम अक्सर प्रोटीन होरोस्टेसिस में व्यवधान का कारण बनता है और प्रोटीन एकत्रीकरण में परिणाम कर सकते हैं । जीवाणु कोशिकाओं में प्रोटीन समुच्चय के संचय से सेलुलर फेनोटाइपिक व्यवहार में महत्वपूर्ण परिवर्तन हो सकते हैं, जिसमें विकास दर में कमी, तनाव प्रतिरोध और उग्रता शामिल है। इन तनाव-मध्यस्थता फेनोटाइप की परीक्षा के लिए कई प्रायोगिक प्रक्रियाएं मौजूद हैं। यह पत्र चांदी-रुथेनियम युक्त एंटीमाइक्रोबियल के साथ उपचार के बाद विभिन्न एस्चेरिचिया कोलाई उपभेदों से एकत्रित और घुलनशील प्रोटीन के निष्कर्षण और दृश्य के लिए एक अनुकूलित परख का वर्णन करता है। यह यौगिक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों को उत्पन्न करने के लिए जाना जाता है और व्यापक प्रोटीन एकत्रीकरण का कारण बनता है।
विधि सोडियम डॉडेकाइल सल्फेट-पॉलीक्रीलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (एसडीएस-पेज) और कूमासी धुंधला द्वारा बाद के पृथक्करण और दृश्य के साथ इलाज और अनुपचारित कोशिकाओं से प्रोटीन समुच्चय और घुलनशील प्रोटीन के एक अपकेंद्रित्र आधारित पृथक्करण को जोड़ती है। यह दृष्टिकोण सरल, तेज है, और विभिन्न ई. कोलाई उपभेदों में प्रोटीन कुल गठन की गुणात्मक तुलना की अनुमति देता है। कार्यप्रणाली में अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला है, जिसमें बैक्टीरिया की एक विस्तृत श्रृंखला में वीवो प्रोटीन एकत्रीकरण पर अन्य प्रोटोटॉक्सिक एंटीमाइक्रोबिल्स के प्रभाव की जांच करने की संभावना शामिल है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल का उपयोग उन जीनों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जो प्रोटोटॉक्सिक पदार्थों के प्रतिरोध को बढ़ाने में योगदान देते हैं। जेल बैंड का उपयोग प्रोटीन की बाद की पहचान के लिए किया जा सकता है जो विशेष रूप से एकत्रीकरण से ग्रस्त हैं।
Introduction
बैक्टीरिया अनिवार्य रूप से कम पीएच सहित पर्यावरण तनाव के असंख्य के संपर्क में हैं (उदाहरण के लिए, स्तनधारी पेट में)1,2,प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन और क्लोरीन प्रजातियां (आरओएस/आरसीएस) (उदाहरण के लिए, फागोसाइट्स में ऑक्सीडेटिव फटने के दौरान)3,4,5,ऊंचा तापमान (जैसे, गर्म झरनों में या गर्मी-सदमे के दौरान)6,7,और कई शक्तिशाली एंटीमाइक्रोबिल (जैसे, इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले एजीएक्सएक्स)8. प्रोटीन विशेष रूप से इन तनावों में से किसी के लिए असुरक्षित हैं, और जोखिम प्रोटीन को उत्तेजित कर सकता है/गलत है कि फिर बीज एकत्रीकरण । सभी जीव सुरक्षात्मक प्रणालियों को नियोजित करते हैं जो उन्हें प्रोटीन के गलत ो –9से निपटने की अनुमति देते हैं । हालांकि, गंभीर तनाव प्रोटीन गुणवत्ता नियंत्रण मशीनरी को अभिभूत कर सकता है और प्रोटीन की माध्यमिक और/या तृतीयक संरचना को बाधित कर सकता है, जो अंतत प्रोटीन को निष्क्रिय कर देता है । नतीजतन, प्रोटीन समुच्चय बैक्टीरियल विकास और अस्तित्व, तनाव प्रतिरोध और उग्रता10के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण सेलुलर कार्यों को गंभीर रूप से ख़राब कर सकता है। इसलिए, प्रोटीन एकत्रीकरण और बैक्टीरिया में इसके परिणामों पर ध्यान केंद्रित अनुसंधान संक्रामक रोग नियंत्रण पर इसके संभावित प्रभाव के कारण एक प्रासंगिक विषय है ।
गर्मी प्रेरित प्रोटीन खुलासा और एकत्रीकरण अक्सर7उलटा कर रहे हैं । इसके विपरीत, ऑक्सीडेटिव तनाव जैसे अन्य प्रोटोटॉक्सिक तनाव, विशिष्ट अमीनो एसिड साइड चेन के ऑक्सीकरण के माध्यम से अपरिवर्तनीय प्रोटीन संशोधनपैदा कर सकते हैं जिसके परिणामस्वरूप प्रोटीन अन-/मिसफोल्डिंग और अंततः प्रोटीन एकत्रीकरण4। अघुलनशील प्रोटीन के तनाव -प्रेरित गठन का आणविक चैपरोन और खमीर और बैक्टीरिया11 , 12,13में उनके सुरक्षात्मक कार्यों के संदर्भ में व्यापक रूप से अध्ययन किया गया है । कई प्रोटोकॉल प्रकाशित किए गए हैं जो अघुलनशील प्रोटीन के अलगाव और विश्लेषण के लिए विभिन्न प्रकार की जैव रासायनिक तकनीकों का उपयोग करते हैं14,15,16,17. मौजूदा प्रोटोकॉल मुख्य रूप से गर्मी-सदमे और/या आणविक chaperones की पहचान पर बैक्टीरियल प्रोटीन एकत्रीकरण का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । हालांकि इन प्रोटोकॉल निश्चित रूप से क्षेत्र के लिए एक उन्नति किया गया है, वहां प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं में कुछ बड़ी असुविधाओं रहे है क्योंकि वे (i) 10 एल14, 17, (ii) जटिल शारीरिक व्यवधान प्रक्रियाओं, सेल बाधित, फ्रांसीसी प्रेस, और/या sonication14, 15,17,या (iii) समय लेने के लिए एक बड़ी जीवाणु संस्कृति की मात्रा की आवश्यकता है धुलाई और इनक्यूबेशन कदम15,16,17.
यह पेपर एक संशोधित प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जिसका उद्देश्य पिछले दृष्टिकोणों की सीमाओं को संबोधित करना है और एक प्रोटोटॉक्सिक एंटीमाइक्रोबियल सतह कोटिंग के साथ उपचार के बाद दो अलग-अलग एस्चेरिचिया कोलाई उपभेदों में गठित प्रोटीन समुच्चय की मात्रा के विश्लेषण की अनुमति देता है। कोटिंग धातु-चांदी (एजी) और रुथेनियम (आरयू) से बना है- एस्कॉर्बिक एसिड के साथ वातानुकूलित, और इसकी रोगाणुरोधी गतिविधि प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों8, 18के उत्पादन द्वारा प्राप्त की जाती है। इसके बाद एंटीमाइक्रोबियल यौगिक के साथ उपचार के बाद बैक्टीरियल संस्कृति की तैयारी और एंटीमाइक्रोबियल की एकाग्रता बढ़ाने के लिए अलग संवेदनशीलता प्रोफाइल के साथ दो ई कोलाई उपभेदों के संपर्क में प्रोटीन एकत्रीकरण की स्थिति की तुलना का विस्तृत विवरण है। वर्णित विधि सस्ती, तेज और प्रजनन योग्य है और इसका उपयोग अन्य प्रोटोटॉक्सिक यौगिकों की उपस्थिति में प्रोटीन एकत्रीकरण का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल को विभिन्न बैक्टीरिया में प्रोटीन एकत्रीकरण पर विशिष्ट जीन विलोपन के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल एक प्रोटेटोक्सिक एंटीमाइक्रोबियल के साथ विभिन्न ई कोलाई उपभेदों के उपचार के बाद प्रोटीन कुल गठन के विश्लेषण के लिए एक अनुकूलित पद्धति का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल इलाज और अनुपचारित …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को इलिनोइस स्टेट यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ बायोलॉजिकल साइंसेज स्टार्टअप फंड्स, इलिनोइस स्टेट यूनिवर्सिटी न्यू फैकल्टी इनिशिएटिव ग्रांट और एनआईएआईडी ग्रांट R15AI164585 (जे-यू) द्वारा समर्थित किया गया था। D.). जी.M को इलिनोइस स्टेट यूनिवर्सिटी अंडरग्रेजुएट रिसर्च सपोर्ट प्रोग्राम (जी.M ए) द्वारा समर्थित किया गया था। के पी एच को जर्मन अकादमिक एक्सचेंज सर्विस (डीएएडी) द्वारा प्रदान की गई राइज फेलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था । लेखक AGXX पाउडर प्रदान करने के लिए लार्जनटेक वेर्ट्रिब्स जीएमबीएच से डॉ उवे लैंडौ और डॉ कार्स्टेन मेयेर का शुक्रिया अदा करते हैं । आंकड़े 1, चित्रा 2, चित्र 3, चित्र 4,और चित्रा 5 बायोरेंडर के साथ उत्पन्न किए गए थे।
Materials
| Chemicals/Reagents | |||
| Acetone | Fisher Scientific | 67-64-1 | |
| 30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1 | Bio-Rad | 1610156 | |
| Ammonium persulfate | Millipore Sigma | A3678-100G | |
| Benzonase nuclease | Sigma | E1014-5KU | |
| Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa | GoldBio | P008-500 | |
| β-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-100ML | |
| Bromophenol blue | GoldBio | B-092-25 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | MP Biomedicals LLC | 821616 | |
| D-Glucose | Millipore Sigma | G8270-1KG | |
| D-Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | SLBT9686 | |
| Glacial Acetic acid | Millipore Sigma | ARK2183-1L | |
| Glycerol, 99% | Sigma-Aldrich | G5516-1L | |
| Glycine | GoldBio | G-630-1 | |
| Hydrochloric acid, ACS reagent | Sigma-Aldrich | 320331-2.5L | |
| Isopropanol (2-Propanol) | Sigma | 402893-2.5L | |
| LB broth (Miller) | Millipore Sigma | L3522-1KG | |
| LB broth with agar (Miller) | Millipore Sigma | L2897-1KG | |
| Lysozyme | GoldBio | L-040-25 | |
| 10x MOPS Buffer | Teknova | M2101 | |
| Nonidet P-40 | Thomas Scientific | 9036-19-5 | |
| Potassium phosphate, dibasic | Sigma-Aldrich | P3786-1KG | |
| Potassium phosphate, monobasic | Acros Organics | 7778-77-0 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Millipore Sigma | T9281-50ML | |
| Thiamine | Sigma-Aldrich | T4625-100G | |
| 100% Trichloroacetic acid | Millipore Sigma | T6399-100G | |
| Tris base | GoldBio | T-400-1 | |
| Material/Equipment | |||
| Centrifuge tubes (15 mL) | Alkali Scientific | JABG-1019 | |
| Erlenmeyer flask (125 mL) | Carolina | 726686 | |
| Erlenmeyer flask (500 mL) | Carolina | 726694 | |
| Freezer: -80 °C | Fisher Scientific | ||
| Glass beads (0.5 mm) | BioSpec Products | 1107-9105 | |
| Microcentrifuge | Hermle | Z216MK | |
| Microcentriguge tubes (1.7 mL) | VWR International | 87003-294 | |
| Microcentriguge tubes (2.0 mL) | Axygen Maxiclear Microtubes | MCT-200-C | |
| Plastic cuvettes | Fischer Scientific | 14-377-012 | |
| Power supply | ThermoFisher Scientific | EC105 | |
| Rocker | Alkali Scientific | RS7235 | |
| Shaking incubator (37 °C) | Benchmark Scientific | ||
| Small glass plate | Bio-Rad | 1653311 | |
| Spacer plates (1 mm) | Bio-Rad | 1653308 | |
| Spectrophotometer | Thermoscientific | 3339053 | |
| Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes | Beckman-Coulter | ||
| Vertical gel electrophoresis chamber | Bio-Rad | 1658004 | |
| Vortexer | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 | |
| Thermomixer | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
| 10 well comb | Bio-Rad | 1653359 |
Referências
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