Krympningen av tandcement under härdning förskjuter basplattan. Detta protokoll minimerar problemet genom att skapa en första grund av dentalcementet som lämnar utrymme för att cementera basplattan. Veckor senare kan basplattan cementeras på plats på denna ställning med lite ny cement, vilket minskar krympningen.
Neuroforskare använder miniatyrmikroskop (miniskop) för att observera neuronal aktivitet hos fritt betande djur. University of California, Los Angeles (UCLA) Miniscope-teamet tillhandahåller öppna resurser för forskare att bygga miniskop själva. V3 UCLA Miniscope är ett av de mest populära miniskopen med öppen källkod som för närvarande används. Det tillåter avbildning av fluorescenstransienter som emitteras från genetiskt modifierade neuroner genom en objektivlins implanterad på ytliga cortex (ett enlinssystem) eller i djupa hjärnområden genom en kombination av en relälins implanterad i den djupa hjärnan och en objektivlins som är förförankrad i miniskopet för att observera den vidarebefordrade bilden (ett tvålinssystem). Även under optimala förhållanden (när neuroner uttrycker fluorescensindikatorer och relälinsen har implanterats ordentligt) kan en volymförändring av tandcementet mellan basplattan och dess fastsättning på skallen vid cementhärdning orsaka felinriktning med ett förändrat avstånd mellan objektiv- och relälinserna, vilket resulterar i dålig bildkvalitet. En basplatta är en platta som hjälper till att montera miniskopet på skallen och fixerar arbetsavståndet mellan objektiv- och relälinserna. Således förändrar förändringar i volymen av tandcement runt basplattan avståndet mellan linserna. Det nuvarande protokollet syftar till att minimera feljusteringsproblemet som orsakas av volymförändringar i dentalcementet. Protokollet minskar felinriktningen genom att bygga en första grund av tandcement under relälinsimplantation. Konvalescenstiden efter implantation är tillräcklig för att grunden av dentalcement ska härda basplattan helt, så basplattan kan cementeras på denna ställning med så lite ny cement som möjligt. I den här artikeln beskriver vi strategier för basplätering hos möss för att möjliggöra avbildning av neuronal aktivitet med en objektiv lins förankrad i miniskopet.
Fluorescerande aktivitetsreportrar är idealiska för avbildning av neuronaktiviteten eftersom de är känsliga och har stora dynamiska områden 1,2,3. Därför använder ett ökande antal experiment fluorescensmikroskopi för att direkt observera neuronal aktivitet 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16. Det första miniatyriserade enfotonfluorescensmikroskopet (miniskop) designades 2011 av Mark Schnitzer et al.5. Detta miniskop gör det möjligt för forskare att övervaka fluorescensdynamiken hos cerebellära celler i fritt betande djur5 (dvs utan fysisk fasthållning, nackstöd, sedering eller anestesi till djuren). För närvarande kan tekniken tillämpas för att övervaka ytliga hjärnområden som cortex 6,8,15,16; subkortikala områden såsom dorsal hippocampus 8,11,13,14 och striatum 6,17; och djupa hjärnområden som ventral hippocampus 14, amygdala 10,18 och hypotalamus 8,12.
Under de senaste åren har flera miniskop med öppen källkod utvecklats4,5,6,7,11,13,17,19. Miniskopet kan monteras ekonomiskt av forskare om de följer steg-för-steg-riktlinjerna från University of California, Los Angeles (UCLA) Miniscope-teamet4,7,11,13. Eftersom optisk övervakning av neural aktivitet begränsas av begränsningarna för ljusöverföring7 till och från den neuronala populationen av intresse utformades ett miniskop som kräver att en objektiv gradientbrytningsindex (GRIN) lins (eller objektivlins) förankras längst ner i miniskopet för att förstora synfältet som vidarebefordras från ett relä GRIN-objektiv (eller relälins)6,7,8,10,16,17. Denna relälins implanteras i målhjärnregionen så att fluorescensaktiviteten i målhjärnregionen vidarebefordras på ytan av relälinsen6,7,8,10,16,17. Ungefär 1/4 av en hel sinusformad ljusperiod färdas genom objektivet GRIN-linsen (~ 0,25 tonhöjd) (Figur 1A1), vilket resulterar i en förstorad fluorescensbild6,7. Objektivlinsen är inte alltid fixerad längst ner i miniskopet och det är inte heller nödvändigt att implantera relälinsen6,7,11,13,15. Specifikt finns det två konfigurationer: en med en fast objektivlins i miniskopet och en relälins implanterad i hjärnan8,10,12,14,16 (Figur 1B1) och en annan med bara en avtagbar objektivlins6,7,11,13,15 (Figur 1B2). I konstruktionen baserad på kombinationen fast objektiv och implanterad relälins förs fluorescenssignalerna från hjärnan till relälinsens övre yta (Figur 1A1)7,8,10,12,14,16. Därefter kan objektivlinsen förstora och överföra synfältet från relälinsens övre yta (Figur 1A2). Å andra sidan är den avtagbara objektiva GRIN-linsdesignen mer flexibel, vilket innebär att preimplantation av en relälins i hjärnan inte är obligatorisk (Figur 1B2)6,7,11,13,15. När man använder ett miniskop baserat på en avtagbar objektivlinsdesign behöver forskare fortfarande implantera en lins i målhjärnregionen men de kan antingen implantera en objektivlins6,7,11,13,15 eller en relälins i hjärnan6,7. Valet av ett objektiv eller ett relälins för implantation bestämmer miniskopkonfigurationen som forskaren måste använda. Till exempel är V3 UCLA Miniscope baserat på en avtagbar objektiv GRIN-linsdesign. Forskare kan välja att antingen direkt implantera en objektivlins i hjärnregionen av intresse och montera det “tomma” miniskopet på objektivlinsen6,7,11,13,15 (ett system med en lins; Figur 1B2) eller att implantera en relälins i hjärnan och montera ett miniskop som är förförankrat med en objektivlins6,7 (ett system med två linser; Figur 1B1). Miniskopet fungerar sedan som en fluorescenskamera för att fånga liveströmbilder av neuronal fluorescens producerad av en genetiskt kodad kalciumindikator1,2,3. När miniskopet är anslutet till en dator kan dessa fluorescensbilder överföras till datorn och sparas som videoklipp. Forskare kan studera neuronaktivitet genom att analysera de relativa förändringarna i fluorescens med vissa analyspaket20,21 eller skriva sina koder för framtida analys.
V3 UCLA Miniscope ger flexibilitet för användare att avgöra om de ska avbilda neuronal aktivitet med ett en- eller tvålinssystem7. Valet av inspelningssystem baseras på djupet och storleken på målhjärnområdet. Kort sagt, ett enlinssystem kan bara avbilda ett område som är ytligt (mindre än cirka 2,5 mm djupt) och relativt stort (större än cirka 1,8 x 1,8 mm2) eftersom tillverkarna bara producerar en viss storlek på objektivlinsen. Däremot kan ett tvålinssystem appliceras på vilket målhjärnområde som helst. Tandcementet för limning av basplattan tenderar dock att orsaka felinriktning med ett förändrat avstånd mellan objektiv- och relälinserna, vilket resulterar i en dålig bildkvalitet. Om systemet med två linser används måste två arbetsavstånd riktas exakt för att uppnå optimal bildkvalitet (figur 1A). Dessa två kritiska arbetsavstånd är mellan neuronerna och relälinsens bottenyta och mellan relälinsens övre yta och objektivlinsens nedre yta (figur 1A1). Varje felinriktning eller felplacering av linsen utanför arbetsavståndet resulterar i bildfel (figur 1C2). Däremot kräver enlinssystemet bara ett exakt arbetsavstånd. Objektivlinsens storlek begränsar dock dess tillämpning för övervakning av djupa hjärnregioner (objektivlinsen som passar miniskopet är ungefär 1,8 ~ 2,0 mm 6,11,13,15). Därför är implantation av en objektivlins begränsad för observation av ytan och relativt stora hjärnregioner, såsom cortex 6,15 och dorsal cornu ammonis 1 (CA1) hos möss11,13 . Dessutom måste ett stort område av cortex aspireras för att rikta in sig på dorsal CA111,13. På grund av begränsningen av enlinskonfigurationen som förhindrar avbildning av djupa hjärnregioner, erbjuder kommersiella miniskopsystem endast en kombinerad objektiv / relälins (två linser) design. Å andra sidan kan V3 UCLA-miniskopet modifieras till antingen ett enlins- eller tvålinssystem eftersom dess objektivlins är avtagbar 6,11,13,15. Med andra ord kan V3 UCLA-miniskopanvändare dra nytta av den avtagbara linsen genom att implantera den i hjärnan (skapa ett enlinssystem), när de utför experiment med ytliga hjärnobservationer (mindre än 2,5 mm djupa) eller genom att förförankra den i miniskopet och implantera en relälins i hjärnan (skapa ett tvålinssystem), när man utför experiment som involverar djupa hjärnobservationer. Tvålinssystemet kan också användas för att ytligt observera hjärnan, men forskaren måste känna till de exakta arbetsavstånden mellan objektivlinsen och relälinsen. Den största fördelen med enlinssystemet är att det finns en minskad chans att missa arbetsavstånden än med ett tvålinssystem, med tanke på att det finns två arbetsavstånd som måste riktas exakt för att uppnå optimal bildkvalitet i tvålinssystemet (figur 1A). Därför rekommenderar vi att du använder ett enlinssystem för ytliga hjärnobservationer. Men om experimentet kräver avbildning i det djupa hjärnområdet måste forskaren lära sig att undvika felinriktning av de två linserna.
Det grundläggande protokollet för konfiguration med två linser av miniskop för experiment inkluderar linsimplantation och basplätering 8,10,16,17. Baseplating är limning av en basplatta på ett djurs huvud så att miniskopet så småningom kan monteras ovanpå djuret och videoband fluorescenssignalerna från neuroner (figur 1B). Denna procedur innebär att man använder tandcement för att limma basplattan på skallen (figur 1C), men krympning av tandcement kan orsaka oacceptabla förändringar i avståndet mellan den implanterade relälinsen och objektivlinsen 8,17. Om det förskjutna avståndet mellan de två linserna är för stort kan cellerna inte sättas i fokus.
Detaljerade protokoll för kalciumavbildningsexperiment i djupa hjärnor med miniskop har redan publicerats8,10,16,17. Författarna till dessa protokoll har använt Inscopix-systemet8,10,16 eller andra anpassade mönster17 och har beskrivit de experimentella procedurerna för virusselektion, kirurgi och basplattfästning. Deras protokoll kan dock inte exakt tillämpas på andra system med öppen källkod, såsom V3 UCLA Miniscope-systemet, NINscope6och Finchscope19. Feljustering av de två linserna kan uppstå under inspelningen i en konfiguration med två linser med ett UCLA Miniscope på grund av den typ av tandcement som används för att cementera basplattan till skallen8,17 (Figur 1C). Det nuvarande protokollet behövs eftersom avståndet mellan den implanterade relälinsen och objektivlinsen är benägen att förskjutas på grund av oönskad krympning av tandcement under baspläteringsproceduren. Under baspläteringen måste det optimala arbetsavståndet mellan den implanterade relälinsen och objektivlinsen hittas genom att justera avståndet mellan miniskopet och toppen av relälinsen, och basplattan ska sedan limmas på denna idealiska plats. När det korrekta avståndet mellan objektivlinsen och den implanterade relälinsen har ställts in kan longitudinella mätningar erhållas med cellulär upplösning (Figur 1B; in vivo inspelning). Eftersom det optimala arbetsavståndet för ett reläobjektiv är litet (50 – 350 μm)4,8kan överdriven cementkrympning under härdning göra det svårt att hålla objektivlinsen och den implanterade relälinsen inom lämpligt intervall. Det övergripande målet med denna rapport är att tillhandahålla ett protokoll för att minska krympningsproblemen8,17 som inträffar under baspläteringsproceduren och för att öka framgångsgraden för miniskopinspelningar av fluorescenssignaler i en konfiguration med två linser. Framgångsrik miniskopinspelning definieras som inspelning av en liveström av märkbara relativa förändringar i fluorescensen hos enskilda neuroner i ett fritt uppträdande djur. Även om olika märken av tandcement har olika krympningshastigheter kan forskare välja ett märke som tidigare har testats6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22. Men inte alla märken är lätta att få i vissa länder / regioner på grund av importreglerna för medicinska material. Därför har vi utvecklat metoder för att testa krympningshastigheten för tillgängliga dentala cement och, viktigare, tillhandahålla ett alternativt protokoll som minimerar krympningsproblemet. Fördelen jämfört med det nuvarande baspläteringsprotokollet är en ökning av framgångsgraden för kalciumavbildning med verktyg och cement som lätt kan erhållas i laboratorier. UCLA-miniskopet används som ett exempel, men protokollet är också tillämpligt på andra miniskop. I denna rapport beskriver vi en optimerad baspläteringsprocedur och rekommenderar också några strategier för montering av UCLA-miniskopsystemet med två linser (Figur 2A). Både exempel på lyckad implantation (n = 3 möss) och exempel på misslyckad implantation (n = 2 möss) för tvålinskonfigurationen med UCLA-miniskopet presenteras tillsammans med diskussionerna om orsakerna till framgångar och misslyckanden.
Denna rapport beskriver ett detaljerat experimentellt protokoll för forskare som använder UCLA Miniscope-systemet med två linser. Verktygen som är utformade i vårt protokoll är relativt överkomliga för alla laboratorier som vill prova kalciumavbildning in vivo. Vissa protokoll, såsom viral injektion, linsimplantation, dummy baseplating och baseplating, kan också användas för andra versioner av miniskopsystemet för att förbättra framgångsgraden för kalciumavbildning. Förutom allmänna problem me…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av ministeriet för vetenskap och teknik, Taiwan (108-2320-B-002 -074, 109-2320-B-002-023-MY2).
0.7-mm drill bit | #19008-07 | Fine Science Tools; USA | for surgery |
0.1–10 μl pipette tips | 104-Q; QSP | Fisher Scientific; Singapore | for testing dental cement |
20 G IV cathater | #SR-OX2032CA | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
27 G needle | AGANI, AN*2713R | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE | #104487-AAV9; 1.5*10^13 | Addgene viral prep; MA, USA | for viral injection |
Atropine sulfate | Astart; Hsinchu, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
Baseplate | V3 | http://miniscope.org | for dummy baseplating/baseplating |
BLU TACK | #30840350 | Bostik; Chelsea, Massachusetts, USA | Reusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating |
Bone Rongeur Friedman | 13 cm | Diener; Tuttlingen, Germany | for baseplating |
Buprenorphine | INDIVIOR; UK | for surgery | |
Carprofen | Rimadyl | Zoetis; Exton, PA | analgesia |
Ceftazidime | Taiwan Biotech; Taiwan | prevent infection | |
Data Acquisition PCB for UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq | for baseplating | |
Dental cement set | Tempron | GC Corp; Tokyo, Japan | for testing dental cement |
Dental cement set | Tokuso Curefast | Tokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japan | for testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating |
Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors | #51673 | Stoelting Co; Illinois, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
Duratear ointment | Alcon; Geneva, Switzerland | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
Ibuprofen | YungShin; Taiwan | analgesia | |
Isoflurane | Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
Inscopix | nVista System | Inscopix; Palo Alto, CA | for comparison with V3 UCLA Miniscope |
Ketamine | Pfizer; NY, NY | for euthanasia | |
Normal saline | for surgery | ||
Micro bulldog clamps | #12.102.04 | Dimedo; Tuttlingen, Germany | for lens implantation |
Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge | #88400 | Hamilton; Bonaduz, Switzerland | for viral injection |
Molding silicone rubber | ZA22 Thixo | Zhermack; Badia Polesine, Italy | for dummy baseplating |
Objective Gradient index (GRIN) lens | #64519 | Edmund Optics; NJ, USA | for dummy baseplating/baseplating |
Parafilm | #PM996 | Bemis; Neenah, USA | for dummy baseplating |
Portable Suction | #DF-750 | Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan | for surgery |
Relay GRIN lens | #1050-002177 | Inscopix; Palo Alto, CA, USA | for dummy baseplating/baseplating |
Stainless steel anchor screws | 1.00 mm diameter, total length 3.00 mm | for surgery | |
Stereo microscope | #SL720 | Sage Vison; New Taipei City, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
Stereotaxic apparatus | #51673 | Stoelting; IL, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
UV Cure Adhesive | #3321 | Loctite; Düsseldorf, Germany | for testing dental cement |
V3 UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
Xylazine | X1126 | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | for euthanasia |
Xylocaine pump spray 10% | AstraZeneca; Södertälje, Sweden | for surgery |