마우스의 칼슘 과도 연구를 위해 대물 렌즈가 사전 고정된 베이스플레이팅과 미니스코프 사용
Summary
경화 중 치과용 시멘트의 수축은 베이스 플레이트를 대체합니다. 이 프로토콜은 베이스 플레이트를 시멘트로 만들 공간을 남기는 치과용 시멘트의 초기 기초를 만들어 문제를 최소화합니다. 몇 주 후, 베이스 플레이트는 새 시멘트를 거의 사용하지 않고 이 비계의 위치에 접합될 수 있으므로 수축을 줄일 수 있습니다.
Abstract
신경 과학자들은 미니어처 현미경 (미니 스코프)을 사용하여 자유롭게 행동하는 동물의 신경 활동을 관찰합니다. 캘리포니아 대학교 로스앤젤레스(UCLA) 미니스코프 팀은 연구원들이 미니스코프를 직접 만들 수 있는 개방형 리소스를 제공합니다. V3 UCLA 미니스코프는 현재 사용 중인 가장 인기 있는 오픈 소스 미니스코프 중 하나입니다. 표재성 피질에 이식 된 대물 렌즈 (1 렌즈 시스템)를 통해 유전자 변형 뉴런에서 방출되는 형광 과도 현상의 이미징을 허용하거나 심부 뇌에 이식 된 릴레이 렌즈와 중계 된 이미지를 관찰하기 위해 미니 스코프에 미리 고정 된 대물 렌즈의 조합을 통해 깊은 뇌 영역에서 이미징 할 수 있습니다 (2 렌즈 시스템). 최적의 조건(뉴런이 형광 지표를 발현하고 릴레이 렌즈가 적절하게 이식된 경우)에서도 시멘트 경화 시 베이스 플레이트와 두개골에 부착된 시멘트 사이의 치과용 시멘트의 부피 변화로 인해 대물 렌즈와 릴레이 렌즈 사이의 거리가 변경되어 정렬 불량이 발생하여 이미지 품질이 저하될 수 있습니다. 베이스 플레이트는 미니스코프를 두개골에 장착하고 대물 렌즈와 릴레이 렌즈 사이의 작동 거리를 고정하는 데 도움이 되는 플레이트입니다. 따라서 베이스 플레이트 주변의 치과용 시멘트 부피의 변화는 렌즈 사이의 거리를 변경합니다. 본 프로토콜은 치과용 시멘트의 부피 변화로 인한 오정렬 문제를 최소화하는 것을 목표로 한다. 이 프로토콜은 릴레이 렌즈 이식 중에 치과 용 시멘트의 초기 기초를 구축하여 정렬 불량을 줄입니다. 이식 후 회복 시간은 치과용 시멘트의 기초가 베이스 플레이트를 완전히 경화시키기에 충분하므로 가능한 한 적은 새 시멘트를 사용하여 베이스 플레이트를 이 비계에 접합할 수 있습니다. 이 기사에서는 미니스코프에 고정된 대물 렌즈로 신경 활동의 이미징을 가능하게 하기 위해 마우스의 베이스플레이팅 전략을 설명합니다.
Introduction
형광 활동 리포터는 민감하고 큰 동적 범위 1,2,3을 갖기 때문에 신경 활동의 이미징에 이상적입니다. 따라서 형광 현미경을 사용하여 신경 세포 활동 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15를 직접 관찰하는 실험이 증가하고 있습니다. ,16. 최초의 소형화된 단광자 형광 현미경(미니스코프)은 2011년 Mark Schnitzer et al.5에 의해 설계되었습니다. 이 미니스코프를 통해 연구자들은 자유롭게 행동하는 동물5(즉, 동물에 대한 물리적 구속, 머리 고정, 진정 또는 마취 없이)에서 소뇌 세포의 형광 역학을 모니터링할 수 있습니다. 현재이 기술은 피질 6,8,15,16과 같은 표면 뇌 영역을 모니터링하는 데 적용될 수 있습니다. 등쪽 해마 8,11,13,14 및 선조체 6,17과 같은 피질 하 영역; 복부 해마 14, 편도체10,18 및 시상 하부 8,12와 같은 심뇌 영역.
최근 몇 년 동안 여러 오픈 소스 미니 스코프가 개발되었습니다.4,5,6,7,11,13,17,19. 미니스코프는 연구원들이 캘리포니아 대학교 로스앤젤레스(UCLA) 미니스코프 팀에서 제공하는 단계별 지침을 따르는 경우 경제적으로 조립할 수 있습니다.4,7,11,13. 신경 활동의 광학 모니터링은 광 투과의 한계에 의해 제한되기 때문에7 관심 있는 뉴런 집단과 함께 중계 GRIN 렌즈(또는 릴레이 렌즈)에서 중계되는 시야를 확대하기 위해 미니스코프 하단에 대물 기울기 굴절률(GRIN) 렌즈(또는 대물 렌즈)를 미리 고정해야 하는 미니스코프가 설계되었습니다.6,7,8,10,16,17. 이 릴레이 렌즈는 표적 뇌 영역의 형광 활동이 릴레이 렌즈의 표면으로 릴레이되도록 표적 뇌 영역에 이식됩니다.6,7,8,10,16,17. 빛의 전체 정현파 주기의 약 1/4이 대물 GRIN 렌즈(~ 0.25피치)를 통해 이동합니다(그림 1A1), 확대된 형광 이미지를 생성합니다.6,7. 대물 렌즈가 항상 미니스코프 하단에 고정되는 것은 아니며 릴레이 렌즈의 이식이 필요하지 않습니다.6,7,11,13,15. 구체적으로, 두 가지 구성이 있습니다 : 하나는 미니 스코프에 고정 대물 렌즈가 있고 하나는 뇌에 이식 된 릴레이 렌즈입니다.8,10,12,14,16 (그림 1B1) 그리고 다른 하나는 탈착식 대물 렌즈가 있습니다.6,7,11,13,15 (그림 1B2). 고정 대물렌즈와 이식된 릴레이 렌즈 조합을 기반으로 한 설계에서 뇌의 형광 신호는 릴레이 렌즈의 상단 표면(그림 1A1)7,8,10,12,14,16. 이어서, 대물 렌즈는 릴레이 렌즈의 상부 표면으로부터 시야를 확대하고 전송할 수 있습니다 (그림 1A2). 반면에 탈착식 대물 GRIN 렌즈 디자인은 더 유연하여 릴레이 렌즈를 뇌에 미리 이식하는 것이 필수가 아닙니다(그림 1B2)6,7,11,13,15. 탈착식 대물 렌즈 디자인을 기반으로 한 미니스코프를 사용할 때 연구원은 여전히 대상 뇌 영역에 렌즈를 이식해야 하지만 대물 렌즈를 이식할 수 있습니다.6,7,11,13,15 또는 뇌의 릴레이 렌즈6,7. 이식을위한 대물 렌즈 또는 릴레이 렌즈의 선택은 연구원이 사용해야하는 미니 스코프 구성을 결정합니다. 예를 들어, V3 UCLA 미니스코프는 탈착식 대물 GRIN 렌즈 디자인을 기반으로 합니다. 연구원은 관심 있는 뇌 영역에 대물 렌즈를 직접 이식하고 “빈” 미니스코프를 대물 렌즈에 장착하도록 선택할 수 있습니다.6,7,11,13,15 (일렌즈 시스템; 그림 1B2) 또는 뇌에 릴레이 렌즈를 이식하고 대물 렌즈가 미리 고정 된 미니 스코프를 장착합니다.6,7 (2 렌즈 시스템; 그림 1B1). 그런 다음 미니스코프는 형광 카메라로 작동하여 유전적으로 암호화된 칼슘 지표에 의해 생성된 신경 형광의 라이브 스트림 이미지를 캡처합니다.1,2,3. 미니스코프를 컴퓨터에 연결한 후 이러한 형광 이미지를 컴퓨터로 전송하여 비디오 클립으로 저장할 수 있습니다. 연구원은 일부 분석 패키지로 형광의 상대적 변화를 분석하여 신경 활동을 연구할 수 있습니다.20,21 또는 향후 분석을 위해 코드를 작성하십시오.
V3 UCLA 미니스코프는 사용자가 1렌즈 또는 2렌즈 시스템으로 뉴런 활동을 이미지화할지 여부를 결정할 수 있는 유연성을 제공합니다7. 기록 시스템의 선택은 대상 뇌 영역의 깊이와 크기를 기반으로합니다. 간단히 말해서, 단일 렌즈 시스템은 제조업체가 특정 크기의 대물 렌즈만 생산하기 때문에 표면적(약 2.5mm 깊이) 비교적 큰(약 1.8 x 1.8mm2보다 큼) 영역만 이미징할 수 있습니다. 대조적으로, 2 렌즈 시스템은 모든 표적 뇌 영역에 적용될 수 있습니다. 그러나 베이스 플레이트를 접착하기 위한 치과용 시멘트는 대물 렌즈와 릴레이 렌즈 사이의 거리가 변경되어 정렬 불량을 일으켜 이미지 품질이 저하되는 경향이 있습니다. 2렌즈 시스템을 사용하는 경우 최적의 이미징 품질을 달성하기 위해 두 개의 작동 거리를 정밀하게 타겟팅해야 합니다(그림 1A). 이 두 가지 중요한 작동 거리는 릴레이 렌즈의 뉴런과 하단 표면 사이, 릴레이 렌즈의 상단 표면과 대물 렌즈의 하단 표면 사이입니다(그림 1A1). 작동 거리 밖에서 렌즈가 잘못 정렬되거나 잘못 배치되면 이미징 오류가 발생합니다(그림 1C2). 반면, 단일 렌즈 시스템은 단 하나의 정확한 작동 거리만 필요합니다. 그러나 대물 렌즈 크기는 심뇌 영역 모니터링에 대한 적용을 제한합니다 (미니 스코프에 맞는 대물 렌즈는 약 1.8 ~ 2.0mm 6,11,13,15). 따라서, 대물 렌즈의 이식은 마우스 11,13에서 피질 6,15 및 등쪽 각막 암모니스 1 (CA1)과 같은 표면 및 비교적 큰 뇌 영역의 관찰을 위해 제한된다. 또한, 피질의 넓은 영역은 등쪽 CA111,13을 표적으로 삼기 위해 흡인되어야합니다. 심부 뇌 영역의 이미징을 방지하는 단일 렌즈 구성의 한계로 인해 상용 미니스코프 시스템은 결합된 대물 렌즈/릴레이 렌즈(2개 렌즈) 설계만 제공합니다. 반면에 V3 UCLA 미니 스코프는 대물 렌즈가 탈착식 6,11,13,15이기 때문에 1 렌즈 또는 2 렌즈 시스템으로 수정할 수 있습니다. 즉, V3 UCLA 미니 스코프 사용자는 탈착식 렌즈를 뇌에 이식 (단일 렌즈 시스템 생성), 표면 뇌 관찰 (깊이 2.5mm 미만)과 관련된 실험을 수행 할 때 또는 미니 스코프에 미리 고정하고 뇌에 릴레이 렌즈를 이식하여 (2 렌즈 시스템 생성) 활용할 수 있습니다. 심뇌 관찰과 관련된 실험을 수행 할 때. 2 렌즈 시스템은 뇌를 표면적으로 관찰하는 데에도 적용 할 수 있지만 연구원은 대물 렌즈와 릴레이 렌즈 사이의 정확한 작동 거리를 알아야합니다. 단일 렌즈 시스템의 주요 장점은 두 렌즈 시스템에서 최적의 이미징 품질을 달성하기 위해 정확하게 타겟팅해야 하는 두 개의 작동 거리가 있기 때문에 두 렌즈 시스템보다 작동 거리를 놓칠 가능성이 적다는 것입니다(그림 1A). 따라서 피상적 인 뇌 관찰을 위해 단일 렌즈 시스템을 사용하는 것이 좋습니다. 그러나 실험에 심뇌 영역의 이미징이 필요한 경우 연구원은 두 렌즈의 정렬 불량을 피하는 방법을 배워야합니다.
실험용 미니스코프의 2렌즈 구성을 위한 기본 프로토콜에는 렌즈 이식 및 베이스플레이팅 8,10,16,17이 포함됩니다. 베이스플레이팅은 미니스코프를 동물의 머리 위에 장착하고 뉴런의 형광 신호를 비디오테이프로 녹화할 수 있도록 하는 베이스 플레이트를 동물의 머리에 붙이는 것입니다(그림 1B). 이 절차에는 치과용 시멘트를 사용하여 베이스 플레이트를 두개골에 붙이는 것이 포함되지만(그림 1C), 치과용 시멘트의 수축은 이식된 릴레이 렌즈와 대물 렌즈(8,17) 사이의 거리에 허용할 수 없는 변화를 일으킬 수 있습니다. 두 렌즈 사이의 이동 거리가 너무 크면 셀에 초점을 맞출 수 없습니다.
미니스코프를 사용한 심부 뇌 칼슘 영상 실험에 대한 자세한 프로토콜이 이미 발표되었습니다.8,10,16,17. 이러한 프로토콜의 작성자는 Inscopix 시스템을 사용했습니다.8,10,16 또는 다른 주문을 받아서 만들어진 디자인17 바이러스 선택, 수술 및 베이스 플레이트 부착에 대한 실험 절차를 설명했습니다. 그러나 프로토콜은 V3 UCLA Miniscope 시스템, NINscope와 같은 다른 오픈 소스 시스템에 정확하게 적용될 수 없습니다.6, 및 핀치스코프19. 베이스 플레이트를 두개골에 접합하는 데 사용되는 치과 용 시멘트의 유형으로 인해 UCLA Miniscope를 사용하여 두 렌즈 구성으로 기록하는 동안 두 렌즈의 정렬 불량이 발생할 수 있습니다.8,17 (그림 1C). 이식된 릴레이 렌즈와 대물 렌즈 사이의 거리가 베이스도금 절차 동안 치과용 시멘트의 바람직하지 않은 수축으로 인해 이동하기 쉽기 때문에 본 프로토콜이 필요합니다. 베이스 도금 중에 미니스코프와 릴레이 렌즈 상단 사이의 거리를 조정하여 이식된 릴레이 렌즈와 대물 렌즈 사이의 최적 작동 거리를 찾아야 하며, 그런 다음 베이스 플레이트를 이 이상적인 위치에 접착해야 합니다. 대물 렌즈와 이식된 릴레이 렌즈 사이의 정확한 거리가 설정되면 셀룰러 해상도(그림 1B; in vivo 녹음). 릴레이 렌즈의 최적 작동 거리 범위가 작기 때문에(50 – 350 μm)4,8경화 중 과도한 시멘트 수축으로 인해 대물 렌즈와 이식된 릴레이 렌즈를 적절한 범위 내로 유지하기 어려울 수 있습니다. 이 보고서의 전반적인 목표는 수축 문제를 줄이기위한 프로토콜을 제공하는 것입니다.8,17 이는 베이스도금 절차 중에 발생하고 2렌즈 구성에서 형광 신호의 미니스코프 기록 성공률을 높이기 위한 것입니다. 성공적인 미니스코프 기록은 자유롭게 행동하는 동물에서 개별 뉴런의 형광에서 눈에 띄는 상대적 변화를 실시간으로 기록하는 것으로 정의됩니다. 치과용 시멘트 브랜드마다 수축률이 다르지만 연구원은 이전에 테스트한 브랜드를 선택할 수 있습니다.6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22. 그러나 의료 재료에 대한 수입 규정으로 인해 일부 국가/지역에서 모든 브랜드를 쉽게 구할 수 있는 것은 아닙니다. 따라서 우리는 사용 가능한 치과용 시멘트의 수축률을 테스트하는 방법을 개발했으며, 중요하게는 수축 문제를 최소화하는 대체 프로토콜을 제공합니다. 현재의 베이스도금 프로토콜에 비해 장점은 실험실에서 쉽게 얻을 수 있는 도구 및 시멘트를 사용한 칼슘 이미징의 성공률이 증가한다는 것입니다. UCLA 미니스코프가 예제로 사용되지만 프로토콜은 다른 미니스코프에도 적용할 수 있습니다. 이 보고서에서는 최적화된 베이스플레이팅 절차에 대해 설명하고 UCLA 미니스코프 2렌즈 시스템(그림 2A). UCLA 미니 스코프를 사용한 2 렌즈 구성에 대한 성공적인 이식 예 (n = 3 마우스)와 이식 실패 사례 (n = 2 마우스)가 성공과 실패의 이유에 대한 논의와 함께 제시됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 보고서는 2 렌즈 UCLA 미니 스코프 시스템을 사용하는 연구자를위한 상세한 실험 프로토콜을 설명합니다. 당사 프로토콜에서 설계된 도구는 생체 내 칼슘 이미징을 시도하려는 모든 실험실에 비교적 저렴합니다. 바이러스 주입, 렌즈 이식, 더미 베이스 도금 및 베이스 플레이팅과 같은 일부 프로토콜은 칼슘 이미징의 성공률을 향상시키기 위해 미니스코프 시스템의 다른 버전에도 사용할…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 대만 과학 기술부 (108-2320-B-002 -074, 109-2320-B-002-023-MY2)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 0.7-mm drill bit | #19008-07 | Fine Science Tools; USA | for surgery |
| 0.1–10 μl pipette tips | 104-Q; QSP | Fisher Scientific; Singapore | for testing dental cement |
| 20 G IV cathater | #SR-OX2032CA | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| 27 G needle | AGANI, AN*2713R | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE | #104487-AAV9; 1.5*10^13 | Addgene viral prep; MA, USA | for viral injection |
| Atropine sulfate | Astart; Hsinchu, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Baseplate | V3 | http://miniscope.org | for dummy baseplating/baseplating |
| BLU TACK | #30840350 | Bostik; Chelsea, Massachusetts, USA | Reusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Bone Rongeur Friedman | 13 cm | Diener; Tuttlingen, Germany | for baseplating |
| Buprenorphine | INDIVIOR; UK | for surgery | |
| Carprofen | Rimadyl | Zoetis; Exton, PA | analgesia |
| Ceftazidime | Taiwan Biotech; Taiwan | prevent infection | |
| Data Acquisition PCB for UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq | for baseplating | |
| Dental cement set | Tempron | GC Corp; Tokyo, Japan | for testing dental cement |
| Dental cement set | Tokuso Curefast | Tokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japan | for testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors | #51673 | Stoelting Co; Illinois, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Duratear ointment | Alcon; Geneva, Switzerland | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Ibuprofen | YungShin; Taiwan | analgesia | |
| Isoflurane | Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Inscopix | nVista System | Inscopix; Palo Alto, CA | for comparison with V3 UCLA Miniscope |
| Ketamine | Pfizer; NY, NY | for euthanasia | |
| Normal saline | for surgery | ||
| Micro bulldog clamps | #12.102.04 | Dimedo; Tuttlingen, Germany | for lens implantation |
| Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge | #88400 | Hamilton; Bonaduz, Switzerland | for viral injection |
| Molding silicone rubber | ZA22 Thixo | Zhermack; Badia Polesine, Italy | for dummy baseplating |
| Objective Gradient index (GRIN) lens | #64519 | Edmund Optics; NJ, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Parafilm | #PM996 | Bemis; Neenah, USA | for dummy baseplating |
| Portable Suction | #DF-750 | Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan | for surgery |
| Relay GRIN lens | #1050-002177 | Inscopix; Palo Alto, CA, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Stainless steel anchor screws | 1.00 mm diameter, total length 3.00 mm | for surgery | |
| Stereo microscope | #SL720 | Sage Vison; New Taipei City, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Stereotaxic apparatus | #51673 | Stoelting; IL, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| UV Cure Adhesive | #3321 | Loctite; Düsseldorf, Germany | for testing dental cement |
| V3 UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Xylazine | X1126 | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | for euthanasia |
| Xylocaine pump spray 10% | AstraZeneca; Södertälje, Sweden | for surgery |
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