Mikroinjektionsmethode für Anopheles gambiae Embryonen
Summary
Mikroinjektionstechniken sind unerlässlich, um exogene Gene in die Genome von Moskitos einzuführen. Dieses Protokoll erklärt eine Methode, die vom James-Labor verwendet wird, um DNA-Konstrukte in Anopheles gambiae-Embryonen zu mikroinjizieren, um transformierte Moskitos zu erzeugen.
Abstract
Embryo-Mikroinjektionstechniken sind für viele molekulare und genetische Studien von Insektenarten unerlässlich. Sie bieten ein Mittel, um exogene DNA-Fragmente, die für interessante Gene sowie günstige Merkmale kodieren, stabil und vererbbar in die Keimbahn des Insekts einzuführen. Die resultierenden transgenen Stämme können auf phänotypische Veränderungen untersucht werden, die sich aus der Expression der integrierten DNA ergeben, um grundlegende Fragen zu beantworten oder in praktischen Anwendungen verwendet zu werden. Obwohl die Technologie unkompliziert ist, erfordert sie vom Ermittler Geduld und Übung, um ein Maß an Fähigkeiten zu erreichen, das die Effizienz maximiert. Hier ist eine Methode zur Mikroinjektion von Embryonen der afrikanischen Malariamücke, Anopheles gambiae, gezeigt. Ziel ist es, durch Mikroinjektion exogene DNA an den Embryo abzugeben, so dass sie in den sich entwickelnden Keimbahnzellen (Polzellen) aufgenommen werden kann. Die Expression von Transposasen, Integrasen, Rekombinasen oder anderen Nukleasen (z. B. CRISPR-assoziierte Proteine, Cas) aus der injizierten DNA kann Ereignisse auslösen, die zu ihrer kovalenten Insertion in Chromosomen führen. Transgene An. gambiae, die aus diesen Technologien erzeugt werden, wurden für grundlegende Studien von Komponenten des Immunsystems, Genen, die an der Bluternährung beteiligt sind, und Elementen des olfaktorischen Systems verwendet. Darüber hinaus wurden diese Techniken verwendet, um An. gambiae-Stämme mit Merkmalen herzustellen, die dazu beitragen können, die Übertragung von Malariaparasiten zu kontrollieren.
Introduction
Mikroinjektionstechniken werden seit den frühen 1900er Jahren verwendet, um Organismen experimentell zu manipulieren1. Die Mikroinjektion wurde verwendet, um sowohl grundlegende biologische Funktionen zu untersuchen als auch / oder wichtige Veränderungen in der Biologie eines gewünschten Organismus einzuführen. Die Mikroinjektionstechnik war für Vektorbiologen von besonderem Interesse und wurde häufig zur Manipulation von Vektorgenomen2-11eingesetzt. Transgenese-Experimente an Arthropodenvektoren zielen oft darauf ab, Vektoren bei der Übertragung von Krankheitserregern weniger effizient zu machen, indem sie entweder Änderungen vornehmen, die die Fitness eines Vektors verringern, oder die Refraktivität gegenüber den von ihnen übertragenen Krankheitserregern erhöhen. Mücken übertragen eine Vielzahl von menschlichen Krankheitserregern und haben weltweit einen erheblichen Einfluss auf Morbidität und Mortalität. Die Anopheles-Mückengattung überträgt die parasitären Erreger Plasmodium spp. Gentechnische Experimente mit Anopheles zielten darauf ab, die Biologie besser zu verstehen und die vektorielle Kapazität dieser Moskitos zu reduzieren, um neuartige Strategien zur Eliminierung von Malaria zu entwickeln.
Die Mückenvektoren, die weltweit die meisten Malariainfektionen verursachen, befinden sich im Anopheles gambiae-Artenkomplex. Die meisten erfolgreichen Transgenese-Experimente wurden jedoch am Malaria-Vektor des indischen Subkontinents, Anopheles stephensi,durchgeführt. Während es viele laborangepasste Anopheles gambiae-Stämme gibt, ist die Anzahl der transgenen Anopheles gambiae spp.-Linien, die in der Literatur berichtet werden, nicht mit der von Anopheles stephensivergleichbar. Es wird angenommen, dass der Embryo von Anopheles gambiae schwieriger zu injizieren und eine erfolgreiche Transgenese zu erreichen ist als Anopheles stephensi, obwohl die Gründe für diese Unterschiede unbekannt sind. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, die sich bei der Transgenese von Anopheles gambiae-Embryonen durch Mikroinjektion als durchgängig erfolgreich erwiesen hat. Das Protokoll basiert auf einer Methode, die zuvor von Hervé Bossin und Mark Benedict12 entwickelt wurde, wobei einige zusätzliche Details und Änderungen hinzugefügt wurden, die die Effizienz der Transgenese erhöhen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mit der erhöhten Verfügbarkeit präziser und flexibler gentechnischer Technologien wie CRISPR/Cas9 können transgene Organismen einfacher und stabiler als bisher entwickelt werden. Diese Werkzeuge haben es den Forschern ermöglicht, transgene Stämme von Mückenvektoren zu erzeugen, die den gewünschten Eigenschaften der Refraktärität gegenüber Krankheitserregern (Populationsmodifikation) oder der vererbbaren Sterilität (Populationsunterdrückung) sehr nahe kommen. Um jedoch möglichst sichere und stabilste gentech…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish Powell und Madeline Nottoli für die Mückenhaltung. Die Finanzierung erfolgte durch die University of California, Irvine Malaria Initiative. AAJ ist Donald Bren Professor an der University of California, Irvine.
Materials
| 10x Microinjection Buffer | – | – | 1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl |
| Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane) | Bio-Rad | Neatly and straightly cut into 2×1 cm piece | |
| Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene) | Fisher Brand | Ends cut | |
| De-ionized or double-distilled water (ddH20) | Mili-Q | In a wash bottle | |
| Dissecting microscope | Leica | Leica MZ12 | For embryo alignment |
| Forceps | No. 5 size | ||
| Glass container | Pyrex | No. 3140 | 125 x 65 |
| Glass slide | Fisher Brand | No. 12-549-3 | 75×26 mm |
| Incubator | Barnsted Lab-line | Model No. 150 | 28 °C |
| KCl | 50 mM | ||
| Latex dental film | Crosstex International | No. 19302 | |
| Microinjector | Sutter Instrument | XenoWorks Digital Microinjector | |
| Microloader Pipette tips | Eppendorf | 20 µL microloader epT.I.P.S. | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | XenoWorks Micromanipulator | |
| Micropipette | Rainin | 20 µL | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Sutter P-2000 micropipette puller | |
| Microscope | Leica | DM 1000 LED or M165 FC | For microinjection |
| Minimum fiber filter paper | Fisher Brand | No. 05-714-4 | Chromatography Paper, Thick |
| Mosquitoes | MR4, BEI Resources | Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion | |
| NaHPO4 buffer | 1 mM, ph 6.8 | ||
| Nylon mesh | |||
| Paint brush | Blick | No. 05831-7040 | Fine, size 4/0 |
| Petri dish | Plastic, (60×15 mm, 90×15 mm) | ||
| Sodium acetate | 3M | ||
| Quartz glass capillaries | Sutter Instrument | No. QF100-70-10 | With filament, 1 mm OD, ID 0.7 10 cm length |
| Water PCR grade | Roche | No. 03315843001 |
Referências
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