طريقة الميكروبيكشن للأجنة الغامبية Anopheles
Summary
تقنيات الميكروجينكشن ضرورية لإدخال الجينات الخارجية في جينوم البعوض. يشرح هذا البروتوكول طريقة استخدمها مختبر جيمس لاستئصال الحمض النووي الدقيق في أجنة أنوفيليس غامبيا لتوليد البعوض المتحول.
Abstract
تقنيات الميكروينجيكشن الأجنة ضرورية للعديد من الدراسات الجزيئية والجينية لأنواع الحشرات. أنها توفر وسيلة لإدخال شظايا الحمض النووي الخارجي ترميز الجينات ذات الاهتمام، فضلا عن الصفات المواتية في الجرثومة الحشرات بطريقة مستقرة وناقلة. ويمكن دراسة السلالات المعدلة وراثيا الناتجة عن التغيرات phenotypic الناتجة عن التعبير عن الحمض النووي المتكامل للإجابة على الأسئلة الأساسية أو استخدامها في التطبيقات العملية. على الرغم من أن التكنولوجيا واضحة ، فإنه يتطلب من المحقق الصبر والممارسة لتحقيق مستوى من المهارة التي تزيد من الكفاءة. يظهر هنا هو وسيلة لmicroinjection من أجنة البعوض الملاريا الأفريقية، Anopheles غامبيا. والهدف من ذلك هو تقديم الحمض النووي الخارجي عن طريق الميكروجين إلى الجنين بحيث يمكن تناوله في الخلايا الجرثومية النامية (القطب). التعبير من الحمض النووي المحقون للمتحولات أو العبارات الصحيحة أو إعادة التركيب أو النوى الأخرى (على سبيل المثال البروتينات المرتبطة ب CRISPR ، Cas) يمكن أن يؤدي إلى أحداث تؤدي إلى إدخاله التساهمي في الكروموسومات. وقد استخدمت الغامبية المعدلة وراثيا الناتجة عن هذه التكنولوجيات للدراسات الأساسية لمكونات الجهاز المناعي، والجينات المشاركة في تغذية الدم، وعناصر من نظام الشم. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمت هذه التقنيات لإنتاج سلالات من الغامبيين ذات سمات قد تساعد على مكافحة انتقال طفيليات الملاريا.
Introduction
وقد استخدمت تقنيات الميكروبيكشن للتلاعب تجريبيا الكائنات الحية منذ أوائل 1900s1. وقد استخدم الميكروبيكشن لدراسة كل من الوظائف البيولوجية الأساسية و / أو إدخال تغييرات هامة في بيولوجيا الكائن الحي المطلوب. وقد تقنية microinjection ذات أهمية خاصة لعلماء الأحياء ناقلات واستخدمت على نطاق واسع للتلاعب ناقلات الجينوم2-11. غالبا ما تهدف تجارب التكوين عبر المفصليات إلى جعل النواقل أقل كفاءة في نقل مسببات الأمراض إما عن طريق سن تغييرات تقلل من لياقة الناقل أو تزيد من الانكسار إلى مسببات الأمراض التي تنقلها. ينقل البعوض مجموعة متنوعة من مسببات الأمراض البشرية ويكون له تأثير كبير على المراضة والوفيات في جميع أنحاء العالم. جنس Anopheles من البعوض ينقل مسببات الأمراض الطفيلية الملاريا البشرية ، Plasmodium spp. وقد استهدفت تجارب الهندسة الوراثية مع Anopheles فهم أفضل لعلم الأحياء والحد من القدرة النواقل لهذه البعوض في الجهود الرامية إلى وضع استراتيجيات جديدة للقضاء على الملاريا.
وناقلات البعوض التي تسهم في أكبر عدد من الإصابات بالملاريا في جميع أنحاء العالم تقع في مجمع الأنواع الغامبية في أنوفيليس. ومع ذلك، فقد أجريت معظم التجارب الناجحة transgenesis على ناقلات الملاريا في شبه القارة الهندية، أنوفيليس ستيفنسي. في حين أن الكثير من السلالات الغامبية Anopheles تكييفها مختبرية موجودة, عدد من المعدلة وراثيا Anopheles غامبيا spp. خطوط ذكرت في الأدب لا يقارن إلى أن من أنوفيليس ستيفنسي. ويعتقد أن الجنين غامبي Anopheles هو أكثر صعوبة لحقن وتحقيق transgenesis ناجحة من أنوفيليس ستيفنسي, على الرغم من أن أسباب هذه الاختلافات غير معروفة. يصف هذا البروتوكول طريقة ثبت نجاحها باستمرار في تحقيق توليد الأجنة الغامبية الأنوفيليس عن طريق التلقيح الدقيق. ويستند البروتوكول على طريقة تم تطويرها سابقا من قبل هيرفي بوسين ومارك بنديكت12 مع بعض التفاصيل الإضافية والتعديلات المضافة التي تم العثور عليها لزيادة كفاءة transgenesis.
Protocol
Representative Results
Discussion
ومع زيادة توافر تكنولوجيات الهندسة الوراثية الدقيقة والمرنة مثل CRISPR/Cas9، يمكن تطوير الكائنات المعدلة وراثيا بطريقة أكثر مباشرة واستقرارا مما كان ممكنا من قبل. وقد سمحت هذه الأدوات للباحثين بإنشاء سلالات معدلة وراثيا من ناقلات البعوض التي هي قريبة جدا من تحقيق الخصائص المرجوة إما الانكسا?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون لدروزيلا ستيلينغر، كيونا باركر، باريش باول ومادلين نوتولي تربية البعوض. وقدمت مبادرة إيرفين للملاريا التابعة لجامعة كاليفورنيا التمويل. AAJ هو أستاذ دونالد برين في جامعة كاليفورنيا، إيرفين.
Materials
| 10x Microinjection Buffer | – | – | 1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl |
| Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane) | Bio-Rad | Neatly and straightly cut into 2×1 cm piece | |
| Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene) | Fisher Brand | Ends cut | |
| De-ionized or double-distilled water (ddH20) | Mili-Q | In a wash bottle | |
| Dissecting microscope | Leica | Leica MZ12 | For embryo alignment |
| Forceps | No. 5 size | ||
| Glass container | Pyrex | No. 3140 | 125 x 65 |
| Glass slide | Fisher Brand | No. 12-549-3 | 75×26 mm |
| Incubator | Barnsted Lab-line | Model No. 150 | 28 °C |
| KCl | 50 mM | ||
| Latex dental film | Crosstex International | No. 19302 | |
| Microinjector | Sutter Instrument | XenoWorks Digital Microinjector | |
| Microloader Pipette tips | Eppendorf | 20 µL microloader epT.I.P.S. | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | XenoWorks Micromanipulator | |
| Micropipette | Rainin | 20 µL | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Sutter P-2000 micropipette puller | |
| Microscope | Leica | DM 1000 LED or M165 FC | For microinjection |
| Minimum fiber filter paper | Fisher Brand | No. 05-714-4 | Chromatography Paper, Thick |
| Mosquitoes | MR4, BEI Resources | Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion | |
| NaHPO4 buffer | 1 mM, ph 6.8 | ||
| Nylon mesh | |||
| Paint brush | Blick | No. 05831-7040 | Fine, size 4/0 |
| Petri dish | Plastic, (60×15 mm, 90×15 mm) | ||
| Sodium acetate | 3M | ||
| Quartz glass capillaries | Sutter Instrument | No. QF100-70-10 | With filament, 1 mm OD, ID 0.7 10 cm length |
| Water PCR grade | Roche | No. 03315843001 |
Referências
- Feramisco, J., Perona, R., Lacal, J. C., Lacal, J. C., Feramisco, J., Perona, R. Needle Microinjection: A Brief History. Microinjection. Methods and Tools in Biosciences and Medicine. , (1999).
- Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito. Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).
- Meredith, J. M., et al. Site-specific integration and expression of an anti-malarial gene in transgenic Anopheles gambiae significantly reduces Plasmodium infections. PLoS One. 6 (1), 14587 (2011).
- Hammond, A., et al. CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
- Carballar-Lejarazu, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).
- Simões, M. L., et al. The Anopheles FBN9 immune factor mediates Plasmodium species-specific defense through transgenic fat body expression. Develomental & Comparative Immunology. 67, 257-265 (2017).
- Arik, A. J., et al. Increased Akt signaling in the mosquito fat body increases adult survivorship. FASEB Journal. 4, 1404-1413 (2015).
- Riabinina, O., et al. Organization of olfactory centres in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature Communications. 7, 13010 (2016).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Dong, Y., Simões, M. L., Dimopoulos, G. Versatile transgenic multistage effector-gene combinations for Plasmodium falciparum suppression in Anopheles. Science Advances. 6 (20), (2020).
- Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Molecular Biology. 6, 597-604 (2001).
- Benedict, M. Q. Methods in Anopheles research. Chapter 3: Specific Anopheles techniques. 3.1 Embryonic Techniques. 3.1.1 Microinjection methods for Anopheles Embryos. BEI resources. , (2015).
- Pham, T. B., et al. Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. PLoS Genetics. 15 (12), 1008440 (2019).
- Benedict, M. Q., et al. Pragmatic selection of larval mosquito diets for insectary rearing of Anopheles gambiae and Aedes aegypti. PLoS One. 15 (3), 0221838 (2020).
- Carballar-Lejarazú, R., James, A. A. Population modification of Anopheline species to control malaria transmission. Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).
