Overførsel af genetisk information fra DNA til proteiner gennem mRNAs er en kompleks biokemisk proces, som er præcist reguleret på alle niveauer gennem makromolekylære interaktioner inde i celler. For translationel regulering giver RNA-proteininteraktioner en afgørende rolle for hurtigt at reagere på forskellige stimuli og ^signaler1,2. Nogle RNA-proteininteraktioner påvirker mRNA-stabiliteten og ændrer dermed det tidspunkt, hvor et RNA er translationelt aktivt. Andre RNA-protein interaktioner er forbundet med reoding mekanismer såsom stop-codon gennemlæsning, omgåelse, eller programmeret ribosomal frameshifting (PRF)3,4,5,6,7. For nylig har en række RNA-bindende proteiner (RBPs) vist sig at interagere med stimulerende mRNA-elementer og oversættelsesmaskineriet for at diktere, hvornår og hvor meget omkodning der vil forekomme i cellen7,8,9,10,11. For at dissekere RNA-bindende proteiners rolle i oversættelsen, og hvordan de modulerer RNA-struktur og stabilitet, er det afgørende at studere interaktionsprincipperne og de mekaniske egenskaber af disse RNA-proteinkomplekser i detaljer.

Årtiers arbejde har lagt grunden til at studere multi-trins og multi-komponent proces oversættelse, som er afhængig af indviklet kommunikation mellem RNA og protein komponenter i oversættelsen maskiner til at opnå hastighed og nøjagtighed12,13,14. Et afgørende næste skridt i forståelsen af komplekse lovgivningsmæssige begivenheder er at bestemme de kræfter, tidshorisonter og strukturelle determinanter under oversættelse med høj præcision12,15,16,17. Undersøgelsen af RNA-kropsbygningsdynamikken og især hvordan transvirkende hjælpefaktorer virker på RNA-strukturen under oversættelsen, er blevet yderligere belyst af fremkomsten af enkeltmolekyleværktøjer, herunder optiske pincet eller nultilstandsbølgeguider16,17,18,19,20,21,22,23,24 ^25,26.

Optisk pincet (OT) repræsenterer en meget præcis enkeltmolekyle teknik, som er blevet anvendt til at studere mange former for RNA-afhængige dynamiske processer, herunder transskription, og oversættelse26,27,28,29,30,31,32. Brugen af optiske pincet har gjort det muligt sondering af molekylære interaktioner, nukleinsyre strukturer, og termodynamiske egenskaber, kinetika, og energiske af disse processer i detaljer16,17,22,33,34,35,36,37,38,39 . Optisk pincet assay er baseret på fastklemning af mikroskopiske objekter med en fokuseret laserstråle. I et typisk OT-eksperiment bindes interessemolekylet mellem to gennemsigtige (normalt polystyren) perler (figur 1A)²⁷. Disse perler fanges derefter af optiske fælder, der opfører sig som fjedre. Således kan den kraft, der påføres molekylet, beregnes baseret på perlens forskydning fra midten af den fokuserede laserstråle (trap center). For nylig er optiske pincet blevet kombineret med konfokal mikroskopi (Figur 1B), hvilket muliggør fluorescens eller Förster resonans energioverførsel (FRET) målinger40,41,42. Dette åbner et helt nyt felt af mulige eksperimenter, der muliggør samtidig måling og dermed præcis korrelation mellem kraftspektroskopi og fluorescensdata.

Her demonstrerer vi eksperimenter ved hjælp af de optiske pincet kombineret med konfokal mikroskopi til at studere protein-RNA interaktioner, der regulerer translationel frameshifting. Mellem målet og kondensatoren muliggør en flowcelle med fem kanaler kontinuerlig prøveudbringning med laminarflow. Gennem de mikrofluidiske kanaler kan forskellige komponenter injiceres direkte, hvilket reducerer hands-on-tiden samt tillader meget lidt prøveforbrug i hele eksperimentet.

For det første foreslås en grundlæggende retningslinje for at hjælpe med udformningen af OT-eksperimenter, og fordele samt faldgruber ved forskellige opsætninger diskuteres. Dernæst beskrives forberedelsen af prøver og eksperimentelle arbejdsgange, og der leveres en protokol til dataanalysen. For at repræsentere et eksempel skitserer vi resultaterne fra RNA-strækforsøg for at studere SARS-CoV-2 frameshifting RNA-elementet (figur 2A) med den transvirkende faktor den korte isoform af zinkfinger antiviralt protein (ZAP), som ændrer oversættelsen af det virale RNA fra en alternativ ^læseramme43. Derudover påvises det, at fluorescensmærkede ribosomer kan anvendes i denne OT-konfokale analyse, hvilket ville være nyttigt at overvåge oversættelsesmaskinernes processivitet og hastighed. Den metode, der præsenteres her, kan bruges til hurtigt at teste effekten af forskellige buffere, ligands eller andre cellulære komponenter for at studere forskellige aspekter af oversættelse. Endelig diskuteres almindelige eksperimentelle faldgruber, og hvordan man foretager fejlfinding af dem. Nedenfor er nogle afgørende punkter i eksperimentelt design skitseret.

Konstruktion design
I princippet er der to fælles tilgange til at skabe en OT-kompatibel RNA-konstruktion. Den første tilgang anvender et langt RNA-molekyle, der er hybridiseret med komplementære DNA-håndtag, hvilket giver en konstruktion bestående af to RNA / DNA hybrid regioner flankerer en enkeltstrenget RNA-sekvens i midten (Figur 2B). Denne tilgang anvendes i de fleste OT RNA eksperimenter33,44,45.

Den anden tilgang udnytter dsDNA håndtag med korte (ca. 20 nt) ^udhæng15,17. Disse udhæng hybridiseres derefter med RNA-molekylet. Selvom brugen af dsDNA-håndtag er mere kompliceret i design, overvinder det nogle af begrænsningerne i DNA/RNA-hybridsystemet. I princippet kan selv meget lange håndtag (>10kb) implementeres, hvilket er mere bekvemt for konfokale målinger. Derudover kan RNA-molekylet nedtones til DNA-håndtag for at øge tetherstabiliteten.

Strategi for slutmærkning
Konstruktionen skal bindes til perler via en stærk molekylær interaktion. Mens der er tilgange til rådighed for kovalent limning af håndtag til ^perler46, stærke, men ikke-kovalente interaktioner såsom streptavidin-biotin og digoxigenin-antistof er almindeligt anvendt i OT eksperimenter15,33,35,45. I den beskrevne protokol er konstruktionen mærket med henholdsvis biotin eller digoxigenin, og perlerne er belagt med henholdsvis streptavidin eller antistoffer mod digoxigenin (figur 1A). Denne fremgangsmåde vil være egnet til at anvende kræfter op til ca. 60 pN (pr. tether)⁴⁷. Desuden gør brugen af forskellige 5′ og 3′-mærkningsstrategier det muligt at bestemme retningen af tether dannet mellem ^perlerne17.

Proteinmærkning til fluorescensmålinger
For confocal billeddannelse, der er flere almindeligt anvendte tilgange til fluorescens mærkning. For eksempel kan fluorophorer være kovalent fastgjort til aminosyrerester, der findes indbygget i proteiner eller introduceres af stedrettet mutagenese gennem en reaktiv organisk gruppe. Thiol eller amine-reaktive farvestoffer kan bruges til mærkning af henholdsvis cystein- og lysinrester. Der er flere reversible beskyttelsesmetoder til at øge specificiteten af ^{mærkning48,49}, men indfødte proteiner vil typisk blive mærket ved flere rester. Selv om fluorophorens lille størrelse kan give en fordel, kan ikke-specifik mærkning forstyrre proteinaktiviteten, og signalintensiteten kan derfor ^variere49. Afhængigt af mærkningseffektivitetssignalintensiteten kan der også være forskel på forskellige eksperimenter. Derfor bør der udføres en aktivitetskontrol forud for eksperimentet.

Hvis proteinet af interesse indeholder en N- eller C-terminal tag, såsom en His-tag eller STREP-tag, specifikke mærkning af disse tags repræsenterer en anden populær tilgang. Desuden reducerer tag-målrettet mærkning risikoen for, at fluorophoren forstyrrer proteinaktiviteten, og kan forbedre ^{opløseligheden49}. Men tag-specifikke mærkning normalt giver mono-fluorophore mærket proteiner, som kan være udfordrende at opdage. En anden måde at specifik mærkning kan opnås ved at anvende antistoffer.

Opsætning af mikrofluidics
Kombinationen af OT med et mikrofluidics system giver mulighed for en hurtig overgang mellem forskellige eksperimentelle forhold. Desuden udnytter de nuværende systemer at opretholde laminarstrømmen inde i strømningscellen, hvilket udelukker blanding af væsker fra andre kanaler i vinkelret retning i forhold til strømningsretningen. Derfor er laminar flow særligt fordelagtigt for det eksperimentelle design. I øjeblikket er flowceller med op til 5 kanaler almindeligt anvendt (figur 3).