Identifisering av antibakteriell immunitet Proteiner i Escherichia coli ved bruk av MALDI-TOF-TOF-MS/MS og Ovenfra og ned Proteomisk analyse

Analyse og identifisering av ufordøyde proteiner ved massespektrometri kalles ovenfra og ned proteomisk analyse^1,2,3,4. Det er nå en etablert teknikk som benytter elektrosprayionisering (ESI)⁵ og høyoppløselige masseanalysatorer⁶, og sofistikerte dissosiasjonsteknikker, for eksempel elektronoverføringsdissosiasjon (ETD), elektronfangst dissosiasjon (ECD)⁷, ultrafiolett foto-dissosiasjon (UV-PD)⁸, etc.

Den andre myke ioniseringsteknikken er matriseassistert laseravledning / ionisering (MALDI)^9,10,11 som har blitt mindre utnyttet for ovenfra-og-ned-analysen, delvis fordi den hovedsakelig er koblet til tof-masseanalysatorer, som har begrenset oppløsning sammenlignet med andre masseanalysatorer. Til tross for disse begrensningene har MALDI-TOF- og MALDI-TOF-TOF-instrumenter blitt utnyttet for rask ovenfra-og-ned-analyse av rene proteiner og fraksjonerte og fraksjonerte blandinger av proteiner. For identifisering av rene proteiner er in-source decay (ISD) en spesielt nyttig teknikk fordi den tillater massespektrometri (MS) analyse av ISD-fragmentioner, samt tandemmassespektrometri (MS / MS) av proteinionfragmenter som gir sekvensspesifikt fragment ofte fra N- og C-termini av målproteinet, analogt med Edman-sekvensering^12,13 . En ulempe med ISD-tilnærmingen er at, som i Edman-sekvensering, må prøven bare inneholde ett protein. Det ene proteinkravet skyldes behovet for entydig tilskrivelse av fragmentioner til en forløperion. Hvis to eller flere proteiner er til stede i en prøve, kan det være vanskelig å tildele hvilke fragmentioner som tilhører hvilke forløperioner.

Fragmention-/forløper-attribusjon kan adresseres ved hjelp av MALDI-TOF-TOF-MS/MS. Som med alle klassiske MS/MS-eksperimenter, er forløperioner massevalgt/isolert før fragmentering, og fragmentjonene som oppdages kan tilskrives en bestemt forløperion. Dissosiasjonsteknikkene som er tilgjengelige for denne tilnærmingen, er imidlertid begrenset til primært høyenergikollisjonsindusert dissosiasjon (HE-CID)¹⁴ eller forfall etter kilden (PSD)^15,16. HE-CID og PSD er mest effektive til fragmentering av peptider og små proteiner, og sekvensdekningen kan i noen tilfeller begrenses. I tillegg resulterer PSD i polypeptid ryggrad spalting (PBC) primært på C-terminalsiden av aspartic og glutaminsyrerester av et fenomen som kalles aspartinsyreeffekten^17,18,19,20.

MALDI-TOF-MS har også funnet en nisjeapplikasjon i taksonomisk identifisering av mikroorganismer: bakterier²¹, sopp²²og virus²³. For eksempel brukes MS-spektra til å identifisere ukjente bakterier sammenlignet med et referansebibliotek med MS-spektra av kjente bakterier ved hjelp av mønstergjenkjenningsalgoritmer til sammenligning. Denne tilnærmingen har vist seg svært vellykket på grunn av sin hastighet og enkelhet, selv om det krever en nattlig dyrking av isolasjonen. Proteinionene som oppdages av denne tilnærmingen (vanligvis under 20 kDa) består av et MS-fingeravtrykk som tillater taksonomisk oppløsning på slekts- og artsnivå og i noen tilfeller på underarten²⁴ og belastningsnivå^25,26. Imidlertid er det fortsatt behov for ikke bare taksonomisk klassifisere potensielt patogene mikroorganismer, men også identifisere spesifikke virulensfaktorer, toksiner og antimikrobielle resistensfaktorer (AMR). For å oppnå dette måles massen av peptider, proteiner eller små molekyler av MS og deretter isoleres og fragmenteres av MS / MS.

Patogene bakterier bærer ofte sirkulære biter av DNA kalt plasmider. Plasmider, sammen med prophages, er en stor vektor av horisontal genoverføring mellom bakterier og er ansvarlige for rask spredning av antimikrobiell motstand og andre virulensfaktorer på tvers av bakterier. Plasmider kan også bære antibakterielle (AB) gener, f.eks. Når disse genene uttrykkes og proteinene utskilles, virker de for å deaktivere proteinoversettelsesmaskineriet til nærliggende bakterier som opptar samme miljønisje²⁷. Imidlertid kan disse bakteriedrepende enzymene også utgjøre en risiko for verten som produserte dem. Som en konsekvens er et gen co-uttrykt av verten som spesifikt hemmer funksjonen til et AB-enzym og kalles immunitetsproteinet (Im).

DNA-skadelige antibiotika som mitomycin-C og ciprofloxacin brukes ofte til å indusere SOS-responsen i Shiga toksinproduserende E. coli (STEC) hvis Shiga toksingen (stx) finnes i et prophagegenom tilstede i bakteriegenomet²⁸. Vi har brukt antibiotikainduksjon, MALDIV-TOF-TOF-MS/MS, og ovenfra og ned proteomisk analyse tidligere for å oppdage og identifisere Stx-typer og undertyper produsert av STEC-stammer^29,30,31,32. I det forrige arbeidet ble STEC O113:H21-stammen RM7788 dyrket over natten på agarmedier supplert med mitomycin-C. Men i stedet for å oppdage den forventede B-underenheten av Stx2a ved m/z ~7816, ble det påvist en annen proteinion ved m/z ~7839 og identifisert som et plasmidkodet hypotetisk protein av ukjent funksjon³³. I det nåværende arbeidet identifiserte vi to plasmid-kodede AB-Im-proteiner produsert av denne stammen ved hjelp av antibiotikainduksjon, MALALDI-TOF-TOF-MS / MS, og ovenfra og ned proteomisk analyse ved hjelp av frittstående programvare utviklet for å behandle og skanne i silicoproteinsekvenser avledet fra fullgenomsekvensering (WGS). I tillegg ble muligheten for endringer etter oversettelse (PTM) som involverer sekvensavkorting innlemmet i programvaren. Immunitetsproteinene ble identifisert ved hjelp av denne programvaren fra den målte massen av den modne proteinionen og sekvensspesifikke fragmentioner fra PBC forårsaket av aspartinsyreeffekten og oppdaget av MS / MS-PSD. Til slutt ble en promotor identifisert oppstrøms ab / im gener i et plasmidgenom som kan forklare uttrykket av disse genene når denne stammen er utsatt for et DNA-skadelig antibiotika. Deler av dette arbeidet ble presentert på National American Chemical Society Høsten 2020 Virtual Meeting &Expo (17.-20. august 2020)³⁴.