JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Química

Identifikation af antibakterielle immunitetsproteiner i Escherichia coli ved hjælp af MALDI-TOF-TOF-MS/MS og Top-Down Proteomisk analyse

Published: May 23, 2021
doi:
10.3791/62577
,
1Produce Safety & Microbiology, Western Regional Research Center,Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture

Summary

Her præsenterer vi en protokol for hurtig identifikation af proteiner produceret af genomisk sekventeret patogene bakterier ved hjælp af MALDI-TOF-TOF tandem massespektrometri og top-down proteomisk analyse med software udviklet in-house. Metastable proteinioner fragment på grund af aspartsyre effekt og denne specificitet udnyttes til protein identifikation.

Abstract

Denne protokol identificerer immunitetsproteinerne i de bakteriedræbende enzymer: kolikin E3 og baktericin, produceret af en patogen Escherichia coli-stamme ved hjælp af antibiotikainduktion, og identificeret af MALDI-TOF-TOF tandem massespektrometri og top-down proteomisk analyse med software udviklet internt. Immunitetsproteinet af kolikin E3 (Im3) og bakterieproteinet af bakterien (Im-Bac) blev identificeret fra fremtrædende b- og/eller y-type fragmentioner genereret af polypeptid rygradsspalteren (PBC) på C-terminalsiden af aspartsyre, glutaminsyre og asparaginerester ved fragmenteringsmekanismen for aspartsyreeffekt. Softwaren scanner hurtigt i silicoproteinsekvenser afledt af hele genomsekvenseringen af bakteriestammen. Softwaren fjerner også iterativt aminosyrerester af en proteinsekvens i tilfælde af, at den modne proteinsekvens afkortes. En enkelt protein sekvens besad masse og fragmentioner i overensstemmelse med dem, der påvises for hver immunitet protein. Kandidatsekvensen blev derefter manuelt inspiceret for at bekræfte, at alle fundne fragmentioner kunne tildeles. N-terminal methionine af Im3 blev post-translationelt fjernet, mens Im-Bac havde den komplette sekvens. Derudover fandt vi, at kun to eller tre ikke-komplementære fragmentioner dannet af PBC er nødvendige for at identificere den korrekte proteinsekvens. Endelig blev en promotor (SOS box) identificeret opstrøms antibakterielle og immunitet gener i en plasmid genom af bakteriestammen.

Introduction

Analyse og identifikation af ufordøjede proteiner ved massespektrometri kaldes top-down proteomisk analyse1,2,3,4. Det er nu en etableret teknik, der udnytter elektrosprayionisering (ESI)5 og høj opløsning masseanalysatorer6, og sofistikerede dissociation teknikker, fx elektron overførsel dissociation (ETD), elektron fange dissociation (ECD)7, ultraviolet foto-dissociation (UV-PD)8,osv.

Den anden bløde ionisering teknik er matrix-assisteret laser desorption / ionisering (MALDI)9,10,11, der har været mindre omfattende udnyttet til top-down analyse, dels fordi det primært er koblet til time-of-flight (TOF) masseanalysatorer, som har begrænset opløsning i forhold til andre masseanalysatorer. På trods af disse begrænsninger er MALDI-TOF- og MALDI-TOF-TOF-TOF-instrumenter blevet udnyttet til den hurtige top-down-analyse af rene proteiner og fraktionerede og ufraktionerede blandinger af proteiner. Til identifikation af rene proteiner er in-source henfald (ISD) en særlig nyttig teknik, fordi det giver mulighed for massespektrometri (MS) analyse af ISD-fragmentioner samt tandemmassespektrometri (MS / MS) af proteinionfragmenter, der giver sekvensspecifikt fragment ofte fra N- og C-termini af målproteinet, svarende til Edman-sekventering12,13 . En ulempe ved ISD-tilgangen er, at som i Edman-sekventering må prøven kun indeholde ét protein. Det ene proteinbehov skyldes behovet for entydig tilskrivning af fragmentioner til en prækursorion. Hvis der er to eller flere proteiner til stede i en prøve, kan det være vanskeligt at tildele hvilke fragmentioner, der tilhører hvilke forstadier.

Fragmention/prækursorion kan afhjælpes ved hjælp af MALDI-TOF-TOF-MS/MS. Som med ethvert klassisk MS/MS-eksperiment massevalgtes/isoleres prækursorer før fragmentering, og de fundne fragmentioner kan tilskrives en bestemt forløberion. De dissociationsteknikker, der er tilgængelige for denne fremgangsmåde, er dog begrænset til primært højenergikollisionsinduceret dissociation (HE-CID)14 eller postkildeforrådnelse (PSD)15,16. HE-CID og PSD er mest effektive til fragmentering af peptider og små proteiner, og sekvensdækningen kan i nogle tilfælde begrænses. Desuden resulterer PSD i polypeptid rygradsspaltning (PBC) primært på C-terminalsiden af aspartiske og glutaminsyrerester ved et fænomen kaldet aspartsyreeffekten17,18,19,20.

MALDI-TOF-MS har også fundet en nicheapplikation i den taksonomiske identifikation af mikroorganismer: bakterier21, svampe22og vira23. For eksempel bruges MS-spektre til at identificere ukendte bakterier i forhold til et referencebibliotek af MS-spektre af kendte bakterier ved hjælp af mønstergenkendelsesalgoritmer til sammenligning. Denne tilgang har vist sig at være en stor succes på grund af dens hastighed og enkelhed, selv om den kræver en dyrkning fra den ene dag til den anden af isolaten. De proteinioner , der påvises ved denne fremgangsmåde (normalt under 20 kDa), omfatter et MS-fingeraftryk, der muliggør taksonomisk opløsning på slægts- og artsniveau og i nogle tilfælde på underarten24 og stammeniveau25,26. Der er dog stadig behov for ikke kun taksonomisk at klassificere potentielt patogene mikroorganismer, men også identificere specifikke virulensfaktorer, toksiner og antimikrobiel resistens (AMR) faktorer. For at opnå dette måles massen af peptider, proteiner eller små molekyler af MS og efterfølgende isoleres og fragmenteret af MS / MS.

Patogene bakterier bærer ofte cirkulære stykker DNA kaldet plasmider. Plasmider, sammen med prophages, er en vigtig vektor af horisontal genoverførsel mellem bakterier og er ansvarlige for den hurtige spredning af antimikrobiel resistens og andre virulensfaktorer på tværs af bakterier. Plasmider kan også bære antibakterielle (AB) gener, f.eks. Når disse gener udtrykkes og proteinerne udskilles, virker de for at deaktivere proteinoversættelsesmaskineriet af nabobakterier, der besætter den samme miljømæssige niche27. Men disse bakteriedræbende enzymer kan også udgøre en risiko for værten, der producerede dem. Som følge heraf udtrykkes et gen i samerklæring af værten, der specifikt hæmmer funktionen af et AB-enzym og kaldes dets immunitetsprotein (Im).

DNA-skadelige antibiotika såsom mitomycin-C og ciprofloxacin bruges ofte til at fremkalde SOS-respons i Shiga toksinproducerende E. coli (STEC), hvis Shiga toksingen (stx) findes i et prophage-genom, der findes i bakteriegenomet28. Vi har brugt antibiotikainduktion, MALDI-TOF-TOF-MS/MS og top-down proteomisk analyse tidligere til at opdage og identificere Stx-typer og undertyper produceret af STEC-stammer29,30,31,32. I det foregående arbejde blev STEC O113:H21 stamme RM7788 kulturret natten over på agar medier suppleret med mitomycin-C. Men i stedet for at opdage den forventede B-underenhed af Stx2a på m / z ~7816, en anden protein ion blev opdaget på m / z ~ 7839 og identificeret som en plasmid-kodet hypotetisk protein af ukendt funktion33. I det nuværende arbejde identificerede vi to plasmid-kodede AB-Im proteiner produceret af denne stamme ved hjælp af antibiotikainduktion, MALDI-TOF-TOF-MS/ MS og top-down proteomisk analyse ved hjælp af standalone software udviklet til at behandle og scanne i silicoproteinsekvenser afledt af hele genomsekvensering (WGS). Desuden blev muligheden for post-oversættelsesændringer (PTM), der involverer sekvensafkortning, indarbejdet i softwaren. Immunitetsproteinerne blev identificeret ved hjælp af denne software fra den målte masse af den modne proteinion og sekvensspecifikke fragmentioner fra PBC forårsaget af aspartsyreeffekten og denekteret af MS/MS-PSD. Endelig blev en promotor identificeret opstrøms AB / Im gener i et plasmid genom, der kan forklare udtrykket af disse gener, når denne stamme udsættes for et DNA-skadeligt antibiotikum. Dele af dette arbejde blev præsenteret på National American Chemical Society Fall 2020 Virtual Meeting &Expo (17.-20. august 2020)34.

Protocol

1. Mikrobiologisk prøvepræparat Pod 25 mL Luria bouillon (LB) i et 50 mL konisk rør med E. coli O113:H21 stamme RM7788 (eller en anden bakteriestamme) fra en glycerol lager ved hjælp af en steril 1 μL loop. Røret og prækulturen skal begrænses ved 37 °C med rystelser (200 omdrejninger) i 4 timer. Aliquot 100 μL af prækulturel bouillon og spredes på en LB agarplade suppleret med 400 eller 800 ng/mL mitomycin-C. Kultur agarplader statisk natten over i en inkubator ved 37 °C.FORS…

Representative Results

Figur 3 (øverste panel) viser MS af STEC O113:H21 stamme RM7788 dyrkes natten over på LBA suppleret med 400 ng/mL mitomycin-C. Toppe ved m/z 7276, 7337 og 7841 var tidligere blevet identificeret som koldchokprotein C (CspC), koldchokprotein E (CspE) og et plasmidbåren protein med ukendt funktion henholdsvis33. Proteinionen ved m/z 9780 [M+H]+ blev analyseret af MS/MS-PSD som vist i figur 3 (bundpanel). Forløberen ion blev i…

Discussion

Overvejelser i forbindelse med protokoller
De primære styrker ved den nuværende protokol er dens hastighed, enkelhed prøve forberedelse, og brug af et instrument, der er relativt let at betjene, trænes på, og vedligeholde. Selvom bottom-up og top-down proteomisk analyse af flydende kromatografi-ESI-HR-MS er allestedsnærværende og langt overlegen i mange henseender til top-down af MALDI-TOF-TOF, de kræver mere tid, arbejdskraft og ekspertise. Instrumentets kompleksitet kan ofte påvirke, om vis…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Protein Biomarker Seeker software er frit tilgængelig (uden omkostninger) ved at kontakte Clifton K. Fagerquist på clifton.fagerquist@usda.gov. Vi ønsker at anerkende støtte til denne forskning af ARS, USDA, CRIS tilskud: 2030-42000-051-00-D.

Materials

4000 Series Explorer software AB Sciex Version 3.5.3
4800 Plus MALDI TOF/TOF Analyzer AB Sciex
Acetonitrile Optima LC/MS grade Fisher Chemical A996-1
BSL-2 biohazard cabinet The Baker Company SG403A-HE
Cytochrome-C Sigma C2867-10MG
Data Explorer software AB Sciex Version 4.9
Focus Protein Reduction-Alkylation kit G-Biosciences 786-231
GPMAW software Lighthouse Data Version 10.0
Incubator VWR 9120973
LB Agar Invitrogen 22700-025
Luria Broth Invitrogen 12795-027
Lysozyme Sigma L4919-1G
Microcentrifuge Tubes, 2 mL, screw-cap, O-ring Fisher Scientific 02-681-343
MiniSpin Plus Centrifuge Eppendorf 22620207
Mitomycin-C (from streptomyces) Sigma-Aldrich M0440-5MG
Myoglobin Sigma M5696-100MG
Shaker MaxQ 420HP Model 420 Thermo Scientific Model 420
Sinapinic acid Thermo Scientific 1861580
Sterile 1 uL loops Fisher Scientific 22-363-595
Thioredoxin (E. coli, recombinant) Sigma T0910-1MG
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich 299537-100G
Water Optima LC/MS grade Fisher Chemical W6-4
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Fornelli, L., et al. Accurate sequence analysis of a monoclonal antibody by top-down and middle-down orbitrap mass spectrometry applying multiple ion activation techniques. Analytical Chemistry. 90 (14), 8421-8429 (2018).
  2. Fornelli, L., et al. Top-down proteomics: Where we are, where we are going. Journal of Proteomics. 175, 3-4 (2018).
  3. He, L., et al. Top-down proteomics-a near-future technique for clinical diagnosis. Annals of Translational Medicine. 8 (4), 136 (2020).
  4. Wu, Z., et al. MASH explorer: A universal software environment for top-down proteomics. Journal of Proteome Research. 19 (9), 3867-3876 (2020).
  5. Konermann, L., Metwally, H., Duez, Q., Peters, I. Charging and supercharging of proteins for mass spectrometry: recent insights into the mechanisms of electrospray ionization. Analyst. 144 (21), 6157-6171 (2019).
  6. Bourmaud, A., Gallien, S., Domon, B. Parallel reaction monitoring using quadrupole-Orbitrap mass spectrometer: Principle and applications. Proteomics. 16 (15-16), 2146-2159 (2016).
  7. Hart-Smith, G. A review of electron-capture and electron-transfer dissociation tandem mass spectrometry in polymer chemistry. Analitica Chimica Acta. 808, 44-55 (2014).
  8. Brodbelt, J. S., Morrison, L. J., Santos, I. Ultraviolet photodissociation mass spectrometry for analysis of biological molecules. Chemical Reviews. 120 (7), 3328-3380 (2020).
  9. Karas, M., Bachmann, D., Bahr, U., Hillenkamp, F. Matrix-assisted ultraviolet-laser desorption of nonvolatile compounds. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 78, 53-68 (1987).
  10. Karas, M., Bachmann, D., Hillenkamp, F. Influence of the wavelength in high-irradiance ultraviolet-laser desorption mass-spectrometry of organic-molecules. Analytical Chemistry. 57 (14), 2935-2939 (1985).
  11. Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).
  12. Resemann, A., et al. Top-down de Novo protein sequencing of a 13.6 kDa camelid single heavy chain antibody by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight/time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (8), 3283-3292 (2010).
  13. Suckau, D., Resemann, A. T3-sequencing: targeted characterization of the N- and C-termini of undigested proteins by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 75 (21), 5817-5824 (2003).
  14. Mikhael, A., Jurcic, K., Fridgen, T. D., Delmas, M., Banoub, J. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight tandem mass spectrometry (negative ion mode) of French Oak Lignin: A Novel Series of Lignin and Tricin Derivatives attached to Carbohydrate and Shikimic acid Moieties. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 34 (18), 8841 (2020).
  15. Demirev, P. A., Feldman, A. B., Kowalski, P., Lin, J. S. Top-down proteomics for rapid identification of intact microorganisms. Analytical Chemistry. 77 (22), 7455-7461 (2005).
  16. Fagerquist, C. K. Unlocking the proteomic information encoded in MALDI-TOF-MS data used for microbial identification and characterization. Expert Review of Proteomics. 14 (1), 97-107 (2017).
  17. Gu, C., Tsaprailis, G., Breci, L., Wysocki, V. H. Selective gas-phase cleavage at the peptide bond C-terminal to aspartic acid in fixed-charge derivatives of Asp-containing peptides. Analytical Chemistry. 72 (23), 5804-5813 (2000).
  18. Herrmann, K. A., Wysocki, V. H., Vorpagel, E. R. Computational investigation and hydrogen/deuterium exchange of the fixed charge derivative tris(2,4,6-trimethoxyphenyl) phosphonium: implications for the aspartic acid cleavage mechanism. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (7), 1067-1080 (2005).
  19. Rozman, M. Aspartic acid side chain effect-experimental and theoretical insight. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 18 (1), 121-127 (2007).
  20. Yu, W., Vath, J. E., Huberty, M. C., Martin, S. A. Identification of the facile gas-phase cleavage of the Asp-Pro and Asp-Xxx peptide bonds in matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 65 (21), 3015-3023 (1993).
  21. Luethy, P. M., Johnson, J. K. The use of Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) for the identification of pathogens causing sepsis. The Journal of Applied Laboratory Medicine. 3 (4), 675-685 (2019).
  22. Knabl, L., Lass-Florl, C. Antifungal susceptibility testing in Candida species: current methods and promising new tools for shortening the turnaround time. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 18 (8), 779-787 (2020).
  23. Gould, O., Ratcliffe, N., Krol, E., de Lacy Costello, B. Breath analysis for detection of viral infection, the current position of the field. Journal of Breath Research. 14 (4), 041001 (2020).
  24. Fagerquist, C. K., et al. Sub-speciating Campylobacter jejuni by proteomic analysis of its protein biomarkers and their post-translational modifications. Journal of Proteome Research. 5 (10), 2527-2538 (2006).
  25. Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review. Mass Spectrometry Reviews. 32 (3), 188-217 (2013).
  26. Christner, M., et al. Rapid MALDI-TOF mass spectrometry strain typing during a large outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli. PLoS One. 9 (7), 101924 (2014).
  27. Masaki, H., Ohta, T. Colicin E3 and its immunity genes. Journal of Molecular Biology. 182 (2), 217-227 (1985).
  28. Michel, B. After 30 years of study, the bacterial SOS response still surprises us. PLoS Biology. 3 (7), 255 (2005).
  29. Fagerquist, C. K., Sultan, O. Induction and identification of disulfide-intact and disulfide-reduced beta-subunit of Shiga toxin 2 from Escherichia coli O157:H7 using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and top-down proteomics. Analyst. 136 (8), 1739-1746 (2011).
  30. Fagerquist, C. K., Sultan, O. Top-down proteomic identification of furin-cleaved alpha-subunit of Shiga toxin 2 from Escherichia coli O157:H7 using MALDI-TOF-TOF-MS/MS. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2010, 123460 (2010).
  31. Fagerquist, C. K., et al. Top-down proteomic identification of Shiga toxin 2 subtypes from Shiga toxin-producing Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption ionization-tandem time of flight mass spectrometry. Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2928-2940 (2014).
  32. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J., Lee, B. G., Yambao, J. C., Quiñones, B. Clinically-relevant Shiga toxin 2 subtypes from environmental Shiga toxin-producing Escherichia coli identified by top-down/middle-down proteomics and DNA sequencing. Clinical Mass Spectrometry. 11, 27-36 (2019).
  33. Fagerquist, C. K., Lee, B. G., Zaragoza, W. J., Yambao, J. C., Quiñones, B. Software for top-down proteomic identification of a plasmid-borne factor (and other proteins) from genomically sequenced pathogenic bacteria using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and post-source decay. International Journal of Mass Spectrometry. 438, 1-12 (2019).
  34. Fagerquist, C. K., Rojas, E. . ACS Fall 2020 Virtual Meeting & Expo. American Chemical Society, Virtual. , (2020).
  35. Fagerquist, C. K., Sultan, O. A new calibrant for matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight-time-of-flight post-source decay tandem mass spectrometry of non-digested proteins for top-down proteomic analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26 (10), 1241-1248 (2012).
  36. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Complementary b/y fragment ion pairs from post-source decay of metastable YahO for calibration of MALDI-TOF-TOF-MS/MS. International Journal of Mass Spectrometry. 415, 29-37 (2017).
  37. Quinones, B., Yambao, J. C., Lee, B. G. Draft genome sequences of Escherichia coli O113:H21 strains recovered from a major produce production region in California. Genome Announcements. 5 (44), 01203-01217 (2017).
  38. Harrison, A. G. The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides. Mass Spectrometry Reviews. 16 (4), 201-217 (1997).
  39. Fagerquist, C. K. Polypeptide backbone cleavage on the C-terminal side of asparagine residues of metastable protein ions analyzed by MALDI-TOF-TOF-MS/MS and post-source decay. International Journal of Mass Spectrometry. 457, (2020).
  40. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. . Mass Spectrometry: Application to the Clinical Lab 2019 (MSACL 2019). , (2019).
  41. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Bacteriophage cell lysis of Shiga toxin-producing Escherichia coli for top-down proteomic identification of Shiga toxins 1 & 2 using matrix-assisted laser desorption/ionization tandem time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (6), 671-680 (2016).
  42. Fagerquist, C. K., et al. Web-based software for rapid top-down proteomic identification of protein biomarkers, with implications for bacterial identification. Applied and Environmental Microbiology. 75 (13), 4341-4353 (2009).
  43. Fagerquist, C. K., et al. Rapid identification of protein biomarkers of Escherichia coli O157:H7 by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight-time-of-flight mass spectrometry and top-down proteomics. Analytical Chemistry. 82 (7), 2717-2725 (2010).
  44. Maus, A., Bisha, B., Fagerquist, C., Basile, F. Detection and identification of a protein biomarker in antibiotic-resistant Escherichia coli using intact protein LC offline MALDI-MS and MS/MS. Journal of Applied Microbiology. 128 (3), 697-709 (2020).

Tags

Escherichia ColiAntibacterial Immunity ProteinsMALDI-TOF-TOF-MS/MSTop-down ProteomicsMass SpectrometryBacterial Protein IdentificationAntibiotic InductionSample PreparationHPLC-grade WaterSinapinic AcidMS Linear Mode AcquisitionMS/MS Reflectron Mode AcquisitionPrecursor MassIsolation WidthCIDMetastable Suppressor

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Fagerquist, C. K., Rojas, E. Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis. J. Vis. Exp. (171), e62577, doi:10.3791/62577 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image