Identificação de Proteínas de Imunidade Antibacteriana em Escherichia coli usando MALDI-TOF-TOF-MS/MS e Análise Proteômica De Cima Para Baixo

A análise e identificação de proteínas não digeridas por espectrometria de massa é referida como a análise proteômica de cima para baixo^1,2,3,4. É agora uma técnica estabelecida que utiliza a ionização eletrospray (ESI)⁵ e analisadores de massa de alta resolução⁶, e técnicas sofisticadas de dissociação, por exemplo, dissociação de transferência de elétrons (ETD), dissociação de captura de elétrons (ECD)^7,foto-dissociação ultravioleta (UV-PD)⁸, etc.

A outra técnica de ionização suave é a desorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI)^9,10,11 que tem sido menos utilizada para a análise de cima para baixo, em parte porque está principalmente acoplada aos analisadores de massa tempo de voo (TOF), que têm resolução limitada em comparação com outros analisadores de massa. Apesar dessas limitações, os instrumentos MALDI-TOF e MALDI-TOF-TOF têm sido explorados para a rápida análise de cima para baixo de proteínas puras e misturas fracionadas e não fracionadas de proteínas. Para a identificação de proteínas puras, a decadência na fonte (ISD) é uma técnica particularmente útil porque permite a análise da espectrometria de massa (MS) de íons de fragmentos de ISD, bem como espectrometria de massa tandem (MS/MS) de fragmentos de íons proteicos que fornecem fragmentos específicos de sequência muitas vezes do N- e C-termini da proteína alvo, análogo ao sequenciamento de Edman^12,13 . Uma desvantagem para a abordagem isd é que, como no sequenciamento de Edman, a amostra deve conter apenas uma proteína. A única exigência de proteína é devido à necessidade de atribuição inequívoca de íons fragmentários a um íon precursor. Se duas ou mais proteínas estiverem presentes em uma amostra, pode ser difícil atribuir quais íons fragmentários pertencem aos íons precursores.

A atribuição de íon/íon precursor pode ser tratada usando MALDI-TOF-TOF-MS/MS. Como em qualquer experimento clássico de MS/MS, os íons precursores são selecionados em massa/isolados antes da fragmentação, e os íons de fragmento detectados podem ser atribuídos a um íon precursor específico. No entanto, as técnicas de dissociação disponíveis para esta abordagem estão restritas principalmente à dissociação induzida por colisão de alta energia (HE-CID)¹⁴ ou à decadência pós-fonte (PSD)^15,16. HE-CID e PSD são mais eficazes na fragmentação de peptídeos e pequenas proteínas, e a cobertura de sequência pode, em alguns casos, ser limitada. Além disso, o PSD resulta em decote backbone polipeptídeo (PBC) principalmente no lado terminal C de resíduos de ácido aspônico e glutamico por um fenômeno chamado efeito ácido aspartílico^17,18,19,20.

O MALDI-TOF-MS também encontrou uma aplicação de nicho na identificação taxonômica de microrganismos: bactérias^21,fungos²²e vírus²³. Por exemplo, os espectros de MS são usados para identificar bactérias desconhecidas em comparação com uma biblioteca de referência de espectros de MS de bactérias conhecidas usando algoritmos de reconhecimento de padrões para comparação. Esta abordagem tem se mostrado altamente bem sucedida devido à sua velocidade e simplicidade, embora exija uma colheita noturna do isolado. Os íons proteicos detectados por esta abordagem (geralmente abaixo de 20 kDa) compreendem uma impressão digital em MS que permite a resolução taxonômica no nível do gênero e da espécie e, em alguns casos, na subespécie²⁴ e no nível da cepa^25,26. No entanto, ainda há a necessidade de classificar não apenas os microrganismos potencialmente patogênicos, mas também identificar fatores específicos de virulência, toxinas e fatores de resistência antimicrobiana (AMR). Para isso, a massa de peptídeos, proteínas ou pequenas moléculas são medidas por ESM e, posteriormente, isoladas e fragmentadas por MS/MS.

Bactérias patogênicas geralmente carregam pedaços circulares de DNA chamados plasmídeos. Plasmídeos, juntamente com prophagens, são um grande vetor de transferência de genes horizontais entre bactérias e são responsáveis pela rápida disseminação da resistência antimicrobiana e outros fatores de virulência entre as bactérias. Plasmídeos também podem transportar genes antibacterianos (AB), por exemplo, colicina e bacteriocina. Quando esses genes são expressos e as proteínas secretadas, eles agem para desativar a máquina de tradução de proteínas de bactérias vizinhas que ocupam o mesmo nicho ambiental²⁷. No entanto, essas enzimas bactericida também podem representar um risco para o hospedeiro que as produziu. Em consequência, um gene é co-expresso pelo hospedeiro que inibe especificamente a função de uma enzima AB e é referido como sua proteína de imunidade (Im).

Antibióticos prejudiciais ao DNA, como mitomicina-C e ciprofloxacina, são frequentemente usados para induzir a resposta sos na E. coli (STEC) produtora de toxinas Shiga (STEC) cujo gene de toxina Shiga(stx) é encontrado dentro de um genoma de prophagem presente no genoma bacteriano²⁸. Utilizamos indução de antibióticos, maldi-TOF-TOF-MS/MS e análise proteômica de cima para baixo anteriormente para detectar e identificar tipos e subtipos stx produzidos pelas cepas STEC^29,30,31,32. No trabalho anterior, a cepa STEC O113:H21 RM7788 foi cultivada durante a noite na mídia ágar complementada com mitomicina-C. No entanto, em vez de detectar a subunidade B antecipada de Stx2a em m/z ~7816, um íon proteico diferente foi detectado em m/z ~7839 e identificado como uma proteína hipotética codificada por plasmídeos da função desconhecida³³. No trabalho atual, identificamos duas proteínas AB-Im codificadas por plasmídeos produzidas por esta cepa usando indução de antibiótico, MALDI-TOF-TOF-MS/MS, e análise proteômica de cima para baixo usando software autônomo desenvolvido para processar e digitalizar em sequências de proteína silico derivadas de sequenciamento de genoma inteiro (WGS). Além disso, a possibilidade de modificações pós-tradução (PTM) envolvendo truncação de sequência foram incorporadas ao software. As proteínas de imunidade foram identificadas utilizando-se este software a partir da massa medida do íon proteico maduro e íons de fragmentos específicos de sequência de PBC causados pelo efeito ácido aspartic e detectados por MS/MS-PSD. Finalmente, um promotor foi identificado a montante dos genes AB/Im em um genoma plasmídeo que pode explicar a expressão desses genes quando esta cepa é exposta a um antibiótico prejudicial ao DNA. Partes deste trabalho foram apresentadas na National American Chemical Society Fall 2020 Virtual Meeting & Expo (17 a 20 de agosto de 2020)³⁴.