La tecnologia di sequenziamento dell’RNA di nuova generazione (RNA-Seq) è ora il gold standard dell’analisi del trascrittoma¹. Fin dai primi giorni della tecnologia, gli sforzi combinati di bioinformatici e biostatistici hanno portato allo sviluppo di numerosi metodi che affrontano tutte le fasi essenziali delle analisi trascrittomiche, dalla mappatura alla quantificazione della trascrizione². La maggior parte degli strumenti oggi disponibili per il biologo sono sviluppati all’interno dell’ambiente software R per il calcolo statistico e i grafici³, e molti pacchetti per l’analisi dei dati biologici sono disponibili nel repository Bioconductor⁴. Questi pacchetti offrono il controllo totale e la personalizzazione dell’analisi, ma hanno il costo di un uso estensivo di un’interfaccia a riga di comando. Poiché molti biologi sono più a loro agio con un approccio “punta e clicca”⁵, la democratizzazione delle analisi RNA-Seq richiede lo sviluppo di interfacce o protocolli più user-friendly⁶. Ad esempio, è possibile creare interfacce web di pacchetti R utilizzando Shiny⁷ e l’analisi dei dati della riga di comando è resa più intuitiva con l’interfaccia R-studio⁸ . Lo sviluppo di tutorial dedicati e passo-passo può anche aiutare il nuovo utente. In particolare, un video tutorial integra un classico testo di testo, portando ad una comprensione più profonda di tutte le fasi della procedura.

Abbiamo recentemente sviluppato DiCoExpress⁹, uno strumento per analizzare esperimenti multifattoriali RNA-Seq in R utilizzando metodi considerati i migliori basati su studi di confronto neutri^10,11,12. Partendo da una tabella di conteggio, DiCoExpress propone una fase di controllo della qualità dei dati seguita da un’analisi di espressione genica differenziale (pacchetto edgeR¹³) utilizzando un modello lineare generalizzato (GLM) e la generazione di cluster di co-espressione utilizzando modelli di miscela gaussiana (pacchetto coseq¹²). DiCoExpress gestisce una progettazione completa e sbilanciata fino a 2 fattori biologici (genotipo e trattamento) e un fattore tecnico (replica). L’originalità di DiCoExpress risiede nella sua architettura di directory che memorizza e organizza dati, script e risultati e nell’automazione della scrittura dei contrasti che consente all’utente di indagare numerose domande all’interno dello stesso modello statistico. È stato inoltre compiuto uno sforzo per fornire risultati grafici che illustrano i risultati statistici.

L’area di lavoro DiCoExpress è disponibile all’indirizzo https://forgemia.inra.fr/GNet/dicoexpress. Contiene quattro directory, due pdf e due file di testo. La directory Data/ contiene i set di dati di input; Per questo protocollo, utilizzeremo il set di dati “Tutorial”. La directory Sources/ contiene sette funzioni R necessarie per eseguire l’analisi e non deve essere modificata dall’utente. L’analisi viene eseguita utilizzando script memorizzati nella directory Template_scripts/. Quello utilizzato in questo protocollo si chiama DiCoExpress_Tutorial_JoVE.R e può essere facilmente adattato a qualsiasi progetto trascrittomico. Tutti i risultati sono scritti nella directory Results/ e memorizzati in una sottodirectory denominata in base al progetto. Il file README.md contiene utili informazioni di installazione e tutti i dettagli specifici relativi al metodo e al suo utilizzo sono disponibili nel file DiCoExpress_Reference_Manual.pdf.

Questo video tutorial guida l’utente attraverso le diverse funzionalità di DiCoExpress con l’obiettivo di superare la riluttanza sentita dai biologi utilizzando strumenti basati su riga di comando. Presentiamo qui l’analisi di un set di dati artificiale RNA-Seq che descrive l’espressione genica in tre repliche biologiche di quattro genotipi, con o senza trattamento. Esamineremo ora i diversi passaggi del flusso di lavoro DiCoExpress illustrati nella Figura 1. Lo script descritto nella sezione Protocollo e i file di input sono disponibili sul sito: https://forgemia.inra.fr/GNet/dicoexpress

Preparare i file di dati
I quattro file csv memorizzati nella directory Data/ devono essere denominati in base al nome del progetto. Nel nostro esempio, tutti i nomi, quindi, iniziano con “Tutorial” e imposteremo Project_Name = “Tutorial” nel passaggio 4 del protocollo. Il separatore utilizzato nei file CSV deve essere indicato nella variabile Sep nel passaggio 4. Nel nostro set di dati “tutorial”, il separatore è una tabella. Per gli utenti avanzati l’intero set di dati può essere ridotto a un sottoinsieme fornendo un elenco di istruzioni e una nuova Project_Name tramite la variabile Filter. Questa opzione evita copie ridondanti dei file di input e verifica i principi FAIR¹⁴.

Tra i quattro file csv, solo i file COUNTS e TARGET sono obbligatori. Contengono i conteggi grezzi per ogni gene (qui Tutorial_COUNTS.csv) e la descrizione del disegno sperimentale (qui Tutorial_TARGET.csv). Il file TARGET.csv descrive ogni campione (un campione per riga) con una modalità per ciascun fattore biologico o tecnico (nelle colonne). Raccomandiamo vivamente che i nomi scelti per le modalità inizino con una lettera, non con un numero. Il nome dell’ultima colonna (“Replica”) non può essere modificato. Infine, i nomi di esempio (prima colonna) devono corrispondere ai nomi nelle intestazioni del file COUNTS.csv (Genotype1_control_rep1 nel nostro esempio). Il file Enrichment.csv in cui ogni riga contiene un Gene_ID e un termine di annotazione è necessario solo se l’utente prevede di eseguire l’analisi di arricchimento. Se un gene ha diverse annotazioni, dovranno essere scritte su righe diverse. Il file Annotation.csv è facoltativo e viene utilizzato per aggiungere una breve descrizione di ogni gene nei file di output. Il modo migliore per ottenere un file di annotazione è recuperare le informazioni da database dedicati (ad esempio, Thalemine: https://bar.utoronto.ca/thalemine/begin.do per Arabidopsis).

Installazione di DiCoExpress
DiCoExpress richiede pacchetti R specifici. Utilizzare l’origine della riga di comando(“.. /Sources/Install_Packages.R”) nella console R per verificare lo stato di installazione del pacchetto richiesto. Per gli utenti su Linux, un’altra soluzione è quella di installare il contenitore dedicato a DiCoExpress e disponibile su https://forgemia.inra.fr/GNet/dicoexpress/container_registry. Per definizione, questo contenitore contiene DiCoExpress con tutte le parti necessarie, come librerie e altre dipendenze.