Wie derzeit implementiert, erfordert die Optogenetik bei nichtmenschlichen Primaten die Injektion viraler Vektoren in das Gehirn. Eine optimale Injektionsmethode sollte zuverlässig sein und für viele Anwendungen in der Lage sein, einzelne Stellen beliebiger Tiefe anzuvisieren, die in der postmortalen Histologie leicht und eindeutig identifiziert werden können. Ein Injektionsverfahren mit diesen Eigenschaften wird vorgestellt.
Optogenetische Techniken haben die neurowissenschaftliche Forschung revolutioniert und sind bereit, dasselbe für die neurologische Gentherapie zu tun. Der klinische Einsatz der Optogenetik erfordert jedoch, dass Sicherheit und Wirksamkeit in Tiermodellen nachgewiesen werden, idealerweise in nicht-menschlichen Primaten (NHPs), aufgrund ihrer neurologischen Ähnlichkeit mit dem Menschen. Die Anzahl der Kandidatenvektoren, die potenziell für die Neurowissenschaften und die Medizin nützlich sind, ist enorm, und es gibt noch keine Hochdurchsatzmittel, um diese Vektoren zu testen. Daher besteht ein Bedarf an Techniken, um mehrere räumlich und volumetrisch genaue Injektionen von viralen Vektoren in das NHP-Gehirn durchzuführen, die durch postmortale Histologie eindeutig identifiziert werden können. Hierin wird ein solches Verfahren beschrieben. Injektionskanülen bestehen aus gekoppelten Polytetrafluorethylen- und Edelstahlrohren. Diese Kanülen sind autoklavierbar, Einwegkanülen und haben ein geringes Minimalbelastungsvolumen, was sie ideal für die Injektion teurer, hochkonzentrierter viraler Vektorlösungen macht. Ein inertes, rot gefärbtes Mineralöl füllt den Totraum und bildet mit der Vektorlösung einen sichtbaren Meniskus, der eine sofortige und genaue Messung von Injektionsraten und -volumina ermöglicht. Das Öl wird in die Rückseite der Kanüle geladen, wodurch das Risiko einer Co-Injektion mit dem Vektor verringert wird. Kanülen können in 10 Minuten geladen werden, und Injektionen können in 20 Minuten durchgeführt werden. Dieses Verfahren eignet sich gut für Injektionen in wache oder betäubte Tiere. Wenn es verwendet wird, um qualitativ hochwertige virale Vektoren zu liefern, kann dieses Verfahren eine robuste Expression optogenetischer Proteine erzeugen, was eine optische Kontrolle der neuronalen Aktivität und des Verhaltens in NHPs ermöglicht.
Die Optogenetik bei nicht-menschlichen Primaten (NHPs) beinhaltet typischerweise die Injektion von viralen Vektoren direkt in das Gehirn. Eine Klasse von Vektoren, die für diese Anwendung gut geeignet ist, basiert auf Adeno-assoziierten Viren (AAV). Diese Vektoren bestehen aus einem Proteinkapsid, das ein einzelsträngiges DNA-Genom umgibt, das wiederum aus einem Promotor, einem Opsin-Gen und gegebenenfalls anderen proteinkodierenden und genregulatorischen Elementen besteht. Fortschritte beim molekularen Klonen haben die Manipulation und Kombination dieser Komponenten für die Entwicklung neuer Vektoren erleichtert. Folglich ist die Sammlung von AAV-Vektoren, die für die NHP-Optogenetik potenziell nützlich ist, groß und wächst schnell.
Derzeit erfordert der Nutzen eines AAV-Vektors für die NHP-Optogenetik Tests in vivo. Diese Tatsache ist ein wesentliches Hindernis für den Fortschritt. Tiere müssen sparsam verwendet werden, und das Testen mehrerer Vektoren in einem einzigen Tier erfordert, dass die Injektionsstellen in Bezug auf die neuronale Architektur vernünftig positioniert und in Bezug auf die Virusausbreitung gut getrennt werden. Eine genaue histologische Beurteilung erfordert, dass Injektionen räumlich und volumetrisch genau sind. Eine Injektionstechnik, die zuvor für die fokale Verabreichung von pharmakologischen Wirkstoffen 1,2,3,4 verwendet wurde, wurde angepasst und vereinfacht, um solche Injektionen durchzuführen. Diese Injektionstechnik ist kostengünstig, verwendet sterilisierbare Einwegkomponenten, kann bei betäubten oder wach verhaltenden Affen verwendet werden und kann verwendet werden, um verschiedene Gehirnbereiche jeder Tiefe anzusprechen. Das folgende Protokoll beschreibt Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Herstellung der Einwegkomponenten und zur Durchführung von Injektionen in das NHP-Gehirn. Die Vor- und Nachteile der Technik werden diskutiert.
Fortschritte in der NHP-Optogenetik haben einen Bedarf an genauen, zuverlässigen intrakraniellen Injektionsmethoden geschaffen. Vorteile der in diesem Bericht beschriebenen Methode sind, dass sie kostengünstig ist, sterilisierbare und Einwegkomponenten verwendet und die Fähigkeit hat, verschiedene Gehirnbereiche jeder Tiefe anzusprechen. Es ermöglicht auch die Steuerung der Einspritzgeschwindigkeit und des Volumens aufgrund der Geschwindigkeit, mit der das Luftventil gesteuert werden kann. Der Luftdruck kann vorübergehend erhöht werden, um eine Verstopfung zu lösen, und dann schnell reduziert werden, um eine nachfolgende Überinjektion zu vermeiden, die durch anhaltenden Druck erzeugt würde. Einwegkomponenten reduzieren das Risiko einer Kreuzkontamination zwischen den Injektionsstellen.
Zu den kritischen Schritten in diesem Injektionsprotokoll gehören die Konstruktion hochwertiger Kanülen, deren Beladung ohne Einführung von Blasen und die Auswahl von Injektionsstellen, die nicht zu nahe beieinander liegen. Injektionen ≥ Abstand von 1 cm transduzieren normalerweise nicht überlappende Regionen, aber diese Heuristik ist abhängig von viralem Serotyp, Titer, Promotor, Volumen, Ziel und Nachweismethode. Die Auswahl von Injektionsstellen, die nicht direkt miteinander verbunden sind, vermeidet potenzielle Störfaktoren, die durch den Opsintransport entlang von Axonen und die Neigung einiger AAV-Serotypen zur retrograden Transduktion verursacht werden.
Die Methode kann verwendet werden, um NHPs zu injizieren, während sie betäubt und in einem stereotaktischen Rahmen (Abbildung 3) oder alarmiert und kopffixiert (Abbildung 4) sind. Ersteres hat den Vorteil, dass Injektionen gezielt in stereotaktischen Koordinaten durchgeführt werden können, und es ermöglicht eine visuelle Bestätigung der Kanülenpenetration durch eine akute Durotomie (das Einschneiden der Dura bei einem wachen Affen durch eine chronische Kraniotomie erhöht das Infektionsrisiko). Der letztere Ansatz hat den Vorteil, dass er die Anzahl der Überlebensoperationen und damit den Stress für das Tier reduziert, mit elektrophysiologischen Aufzeichnungen während des Verhaltens kompatibel ist und den gleichen Koordinatenrahmen und die gleichen Instrumente verwendet, die zum Einfügen optischer Fasern für Experimente nach der Injektion verwendet werden. Die Injektionstechnik bei wachen Affen könnte durch Injektionen durch künstliche Dura13,14,15 weiter verbessert werden. Dies würde die zusätzlichen Vorteile der direkten Visualisierung von Injektionsstellen und der Gewebefluoreszenz, die eine erfolgreiche Transduktion anzeigt, verleihen.
Mehrere andere AAV-Injektionstechniken wurden in NHPs verwendet. Vor kurzem wurde eine Mehrkanal-Injektionsvorrichtung entwickelt, um AAV-Vektoren gleichmäßig an große kortikale NHP-Regionen zu liefern16. Ähnliche Ergebnisse können mit konvektionsverstärkter Abgabe17,18 erzielt werden. Diese Methoden zielen darauf ab, die Transduktionsausbreitung zu maximieren, was ein wichtiges Ziel ist, das sich jedoch von der räumlichen Präzision unterscheidet, die unsere Methode erreichen soll.
Eine weitere alternative Methode besteht darin, AAV-Vektoren durch Borosilikatschläuche zu injizieren, die an einem Ende an einer scharfen Spitze abgeschrägt undam anderen Ende 5,6 an einer Hamiltonspritze befestigt sind. Diese Methode hat viel mit der in diesem Artikel beschriebenen Methode gemeinsam. Der virale Vektor wird in einer Länge von Schläuchen gehalten, der Raum im Schlauch hinter dem Virus ist mit gefärbtem Öl gefüllt, und der Fluss des Vektors wird über die Bewegung des Ölvektormeniskus überwacht. Diese alternative Technik erfordert weniger Ausrüstung und Vorbereitung, erfordert jedoch das Ziehen von Öl in das Borosilikatrohr durch die abgeschrägte Spitze durch Unterdruck und das anschließende Laden des Vektors über den gleichen Weg. Dies führt unweigerlich zu Spuren von Öl, das an das Gehirn abgegeben wird. Darüber hinaus muss der Borosilikatschlauch unserer Erfahrung nach einen Durchmesser von ~350 μm haben, um Dura auch bei abgeschrägter Abschrägung zu durchdringen und verursacht daher größere mechanische Schäden als die in diesem Artikel beschriebene dünnere Metallkanüle (Abbildung 2D). 30 G-Schläuche wurden verwendet, weil ihre kritische Knicklast hoch genug ist, um trotz einer Länge von 1-10 cm eine Dura zu vermitteln, weil sie fest in den PTFE-Schlauch passen und weil sie selten verstopft werden. 33 G Schläuche verstopft und biegt sich leichter und ist schwieriger mit dem PTFE-Schlauch zu verbinden. 36 G Schläuche sind nicht steif genug, um NHP dura mater zu durchdringen.
Eine weitere alternative Injektionstechnik besteht darin, den Ausgang der Luftpumpe mit einer Rückseite einer vektorgeladenen, gezogenen Glaspipette19 zu verbinden. Der Vektor wird durch direkten, intermittierenden Luftdruck von der Pumpe aus der Pipettenspitze gedrückt, wodurch Öl überflüssig wird. Ähnlich wie bei der oben erläuterten Einschlauchmethode verringert das Fehlen von Materialverbindungen zwischen Meniskus und Kanülenspitze das Risiko von Leckagen. Die scharfe Verjüngung und die empfindlichen Spitzen von Glaspipetten verhindern jedoch, dass sie NHP dura durchdringen oder auf tiefe Strukturen abzielen.
The authors have nothing to disclose.
Diese Studie wurde von WaNPRC / ITHS P51OD010425 (JTT), National Institute of Health (NIH) Grants EY023277 (R01 für YK), EY030441 (R01 für GH), MH114126 (RF1 to JTT, Boaz Levi, Ed Lein), MH120095 (UG3 für JTT und GH), EY028902 (R01 für RS) unterstützt und durch NIH-Zuschüsse OD010425 (P51 für WaNPRC) und University of Washington Royalty Research Fund A148416 ermöglicht. Die Autoren danken Yasmine El-Shamayleh und Victoria Omstead für die Histologie, Refugio Martinez für das Klonen viraler Vektoren und John Mich für die Unterstützung bei der Verarbeitung von NHP-Hirngewebe.
Equipment: Stereotaxic set | |||
Item | |||
Allen keys | BONDHUS | 10936 | STERRAD |
Cannula holder | KOPF | 1770 | STERRAD |
Carrier (manipulator) | KOPF | 1404 | STERRAD |
Carrier platform | KOPF | 1430 | NA |
Carrier stand | KOPF | 1449 | STERRAD |
Eye, ear, mouth bars | KOPF | 1430 | NA |
Stereotaxic base | KOPF | 1210 | NA |
Equipment: Cannula | |||
Item | |||
1 mL Luer-lock syringes | BD | 309628 | NA (sterilized package) |
Cannulas* | (homemade – see below) | NA | steam (autoclave) |
Colored oil** | (homemade – see below) | NA | NA |
Elevator (for tube rack) | Cole-Parmer | UX-08057-10 | STERRAD |
Filter tip | Genesee Scientific | 23-404 | NA (sterilized package) |
Fluorescent microbeads | Lumafluor | R170 | NA |
P20 pipetman | Gilson | FA10003M | NA |
PCR tubes | Olympus Plastics | 22-161 | STERRAD |
Stopcock | Cole-Parmer | 3060004 | STERRAD |
Tube rack | homemade | NA | STERRAD |
Vector solution | (homemade) | NA | NA |
Equipment: Electric air pump set | |||
Item | |||
Electric air pump | World Precision Instruments | PV830 | NA |
Foot pedal | World Precision Instruments | 3260 | NA |
Tube cover | EZ Drape | A400-1000 | NA (sterilized package) |
Equipment: General surgery tools | |||
Item | |||
Beaker | MEDLINE | azlon | STERRAD |
Burrs | STRYKER | 277-10-235 | STERRAD |
Double pronged tissue pick | Fine Science Tools | 18067-11 | STERRAD |
Drapes | MEDLINE | DYNJP3004 | NA (sterilized package) |
Dressing forceps | Miltex | 6-118 | STERRAD |
Drill | STRYKER | Q9R-5400 | NA |
Drill bits | STRYKER | 277-82-87 | STERRAD |
Gauze | MEDLINE | NON26334 | NA (sterilized package) |
Hemostatic mosquito forceps | Miltex | 7-2, 7-4 | STERRAD |
Light handles | SKYTRON | Stellar XL | STERRAD |
Needle hodler | Miltex | 8-2 | STERRAD |
Periosteal elevator | Miltex | 18-1968 | STERRAD |
Rongeurs | Miltex | 17-4800 | STERRAD |
Saline | BAXTER | 2F7122 | STERRAD |
Scalpel | Bard-Parker | 372610 | STERRAD |
Scissors | Miltex | 5-12, 5-114 | STERRAD |
Senn retractors | Miltex | 28065 | STERRAD |
Sterile gloves | MEDLINE | Triumph Micro | NA (sterilized package) |
Suction | medela | 200-4869 | NA |
Suction tip | MEDLINE | DYNDFR12S | NA (sterilized package) |
Suction tube | COVIDEN | 8888301614 | NA (sterilized package) |
Surgical gowns | MEDLINE | DYNJP2002S | NA (sterilized package) |
Surgical pens & ruler | MEDLINE | DYNJSM03 | NA (sterilized package) |
Suture | COVIDEN | SL-635 | NA (sterilized package) |
Tissue forceps | Miltex | 6-114 | STERRAD |
Towel clamps | Miltex | 7-504 | STERRAD |
Wood swabs | MEDLINE | MDS202095 | NA (sterilized package) |
Equipment: *cannulas | |||
Item | |||
Hypodermic needle | EXELINT INTERNATIONAL | 26437 | NA (sterilized package) |
Stainless steel tube | K-TUBE | K30R | NA |
PTFE tube | ZEUS | 216200 | NA |
Equipment: **colored oil | |||
Item | |||
Liquid Candle Dye Concentrate | PremiumCraft | Red/Pink | NA |
Mineral oil | Vi-Jon | S0883 | NA |
STERRAD: low-temperature hydrogen peroxide gas plasma |