JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

Автоматизированные кристаллографические трубопроводы на заводе EMBL HTX в Гренобле

Published: June 05, 2021
doi:
10.3791/62491
, , , , , , , , , ,
1European Molecular Biology Laboratory, 2ALPX S.A.S., 3Institut de Biologie Structurale

Summary

Здесь мы описываем, как использовать автоматизированные макромолекулярные кристаллографические конвейеры для анализа белково-структурного, быстрого анализа лиганд-белкового комплекса и крупномасштабного скрининга фрагментов на основе технологии CrystalDirect в лаборатории HTX в EMBL Гренобле.

Abstract

EMBL Grenoble управляет Лабораторией кристаллизации высокой пропускной способности (HTX Lab), крупномасштабным пользовательским объектом, предлагающим высокопроизводительный кристаллографический сервис для пользователей по всему миру. Лаборатория HTX уделяет большое внимание разработке новых методов в макромолекулярной кристаллографии. Благодаря сочетанию высокопроизводительной платформы кристаллизации, технологии CrystalDirect для полностью автоматизированного монтажа и криокоирования кристаллов и программного обеспечения CRIMS мы разработали полностью автоматизированные трубопроводы для макромолекулярной кристаллографии, которые могут удаленно управляться через Интернет. К ним относятся конвейер «белок-структура» для определения новых структур, конвейер для быстрой характеристики белково-лигандных комплексов в поддержку медицинской химии и крупномасштабный автоматизированный конвейер скрининга фрагментов, позволяющий оценить библиотеки из более чем 1000 фрагментов. Здесь мы расскажем, как получить доступ к этим ресурсам и использовать их.

Introduction

Автоматизация внедрена на всех этапах экспериментального процесса макромолекулярной кристаллографии, от кристаллизации до сбора и обработки дифракционных данных1,2,3,4,5,6,7,8,9,включая ряд технологий монтажа образцов10,11,12 ,13,14,15,16,17. Это не только ускорило темпы получения кристаллографических структур, но и способствовало упорядочению приложений, таких как структурно-управляемый дизайн лекарств18,19,20,21,22,23,24. В этой рукописи мы описываем некоторые аспекты автоматизированных кристаллографических конвейеров, доступных в лаборатории HTX в Гренобле, а также базовые технологии.

Лаборатория HTX в EMBL Grenoble является одним из крупнейших академических учреждений для скрининга кристаллизации в Европе. Он расположен в европейском кампусе фотонов и нейтронов (EPN) вместе с Европейской установкой синхротронного излучения (ESRF), которая производит некоторые из самых ярких рентгеновских лучей в мире, и Институтом Лауэ Ланжевена (ILL), который обеспечивает пучки нейтронов с высоким потоком. С момента начала работы в 2003 году лаборатория HTX оказала услуги более чем 800 ученым и обрабатывает более 1000 образцов в год. Лаборатория HTX уделяет большое внимание разработке новых методов в макромолекулярной кристаллографии, включая методы оценки образцов и контроля качества25,26 и технологию CrystalDirect, позволяющую полностью автоматизировать монтаж и обработку кристаллов15,16,17. Лаборатория HTX также разработала Систему управления кристаллографической информацией (CRIMS), веб-систему лабораторной информации, которая обеспечивает автоматизированную связь между средствами кристаллизации и сбора синхротронных данных, обеспечивая непрерывный поток информации в течение всего цикла выборки от чистого белка до дифракционных данных. Благодаря сочетанию мощностей установки HTX, технологии CrystalDirect и программного обеспечения CRIMS мы разработали полностью автоматизированные трубопроводы от белка к структуре, объединяющие кристаллизационное скрининг, оптимизацию кристаллов, автоматизированную обработку сбора кристаллов и криокооление и сбор рентгеновских данных на нескольких синхротронах в единый и непрерывный рабочий процесс, которым можно удаленно управлять через веб-браузер. Эти трубопроводы могут быть применены для поддержки быстрого определения новых структур, характеристик белково-лигандных комплексов и крупномасштабного скрининга соединений и фрагментов с помощью рентгеновской кристаллографии.

Лаборатория HTX оснащена необъемным кристаллизационным роботом (включая модуль LCP, который позволяет кристаллизировать как растворимые, так и мембранные белки), кристаллическими фермами (при 5 °C и 20 °C), двумя роботизированными станциями обработки жидкости для подготовки кристаллизационных экранов и двумя автоматизированными кристаллоуборочными комбайнами CrystalDirect с возможностью производства и хранения до 400 замороженных образцов штифтов за рабочий цикл. Ученые отправляют свои образцы на объект экспресс-курьером, которые затем обрабатываются специальными техниками в лаборатории HTX. Ученые могут удаленно проектировать эксперименты по скринингу кристаллизации и оптимизации через веб-интерфейс, предоставляемый системой CRIMS. Благодаря этому интерфейсу они могут выбирать из широкого спектра параметров и экспериментальных протоколов, доступных на объекте, в соответствии с их конкретными требованиями к образцам. Результаты вместе со всеми экспериментальными параметрами предоставляются пользователям в режиме реального времени через CRIMS. Все полученные образцы анализируются с помощью специально разработанного метода, позволяя оценить вероятность кристаллизации образца25,26,27. На основе результатов этого анализа пользователям даются конкретные рекомендации относительно оптимальной температуры инкубации и возможных экспериментов по оптимизации образцов. Как только эксперименты по кристаллизации установлены, ученый может оценить результаты, глядя на изображения кристаллизации, собранные в разные моменты времени через Интернет. Когда кристаллы, подходящие для экспериментов по дифракции рентгеновских лучей, идентифицированы, ученые могут использовать специальный интерфейс для создания плана монтажа кристаллов, который затем будет выполнен роботом CrystalDirect.

Технология CrystalDirect основана на использовании модифицированной микропластины кристаллизации паровой диффузии и лазерного луча для монтажа криоохладимых кристаллических образцов в дифракционно-совместимые средства, закрывающие зазор автоматизации, существующий между кристаллизацией и сбором данных15,16,17. Вкратце, кристаллы выращиваются в модифицированной пародиффузионной пластине, микропластине CrystalDirect. Как только появляются кристаллы, робот для сбора данных CrystalDirect автоматически применяет лазерный луч, чтобы иссечь кусок пленки, содержащий кристалл, прикрепить его к стандартному штифту сбора дифракционных данных и криохлаждать его в потоке газообразного азота (см. Zander et al. 2016 и https://www.youtube.com/watch?v=Nk2jQ5s7Xx8). Эта технология имеет ряд дополнительных преимуществ по сравнению с ручными или полуавтоматическими протоколами монтажа кристаллов. Например, размер и форма кристаллов не являются проблемой, что делает одинаково легким сбор крупных кристаллов или микрокристаллов, часто можно избежать использования криопротекторов, из-за особого способа, которым работает технология (см. ссылку 17, Zander et al.), что делает рентгеновский дифракционный анализ гораздо более простым. Лазерный луч также может быть использован в качестве хирургического инструмента для отбора лучших частей образца, когда кристаллы растут на кластерах или показывают эпитаксиальный рост, например. Технология CrystalDirect также может быть использована для автоматизированных экспериментов по замачивания17. Доставка растворов с малыми молекулами или другими химическими веществами к кристаллам. Таким образом, это позволяет поддерживать полностью автоматизированный, крупномасштабный скрининг соединений и фрагментов. После того, как кристаллы собраны и криокоолены роботом CrystalDirect, они передаются либо в SPINE, либо в Unipuck шайбы, которые совместимы с большинством синхронных макромолекулярных кристаллографических лучей по всему миру. Система может собирать до 400 штифтов (емкость криогенного хранилища Дьюара) полностью автономным образом. CRIMS взаимодействует с роботом-харвестером во время процесса и обеспечивает автоматическое отслеживание образцов кристаллов (шайб и штифтов). Шайбы маркируются как штрих-кодами, так и RFID-метками для облегчения управления образцами21,28.

CRIMS предоставляет интерфейс прикладной программы (API), поддерживающий автоматизированную связь с системой ISPyB, поддерживающей управление сбором и обработку рентгеновских данных на многих синхротронах в Европе и мире29. После завершения автоматизированного сбора кристаллов ученые могут отбирать образцы кристаллов (шайбы) и создавать партии образцов для макромолекулярных кристаллографических лучевых линий на синхротронах ESRF (Гренобль, Франция)7,8,9 или Петра III (Гамбург, Германия)18,19. CRIMS передают данные, соответствующие выбранным образцам лучевой линии, в синхротронную информационную систему вместе с предварительно выбранными параметрами сбора данных. Как только образцы поступают на выбранную линию синхротронного пучка, сбор рентгеновских данных осуществляется либо вручную, либо с помощью дистанционного управления лучевой линией, либо полностью автоматизированным способом (т.е. на линии пучка MASSIF-1 ESRF8, управляемой совместной объединенной группой структурной биологии EMBL ESRF (JSBG)). После сбора данных CRIMS автоматически извлекает информацию о результатах сбора данных вместе с исходными результатами обработки данных, осуществляемой системами синхротронной обработки данных, и представляет ее ученому через удобный пользовательский интерфейс.

Лаборатория HTX применяет эти автоматизированные конвейеры для поддержки трех различных применений: быстрого определения новых структур, быстрой характеристики белково-лигандных комплексов и крупномасштабного скрининга соединений и фрагментов. Ниже мы опишем, как их использовать и эксплуатировать.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Финансируемый доступ к этим трубопроводам для ученых во всем мире поддерживается через ряд программ финансирования. На момент написания этой рукописи заявки на доступ принимаются либо через программу iNEXT Discovery (https://inext-discovery.eu), европейскую сеть объектов для стимулирования трансляционной структурной биологии20, финансируемую программой Horizon 2020 Европейской комиссии, либо INSTRUCT-Eric (https://instruct-eric.eu/). Свяжитесь с соответствующим автором для получения текущих условий и маршрутов для финансируемого доступа в определенное время. Этот протокол описывает работу конвейера от белка до структуры и включает этапы, общие для всех наших конвейеров, в то время как особенности для двух других конвейеров обсуждаются в следующем разделе. Инструкции здесь относятся к CRIMS V4.0. 1. Лаборатория кристаллизации высокой пропускной способности Перед началом работы попросите быть регистратором в лаборатории HTX через систему CRIMS https://htxlab.embl.fr/#/. Учетные данные пользователя обеспечивают удаленный доступ ко всем интерфейсам экспериментального проектирования и оценки. Войдите в CRIMS через веб-навигатор (поддерживаются Firefox, Chrome и Safari). Веб-сервер CRIMs шифруется, чтобы предотвратить доступ третьих лиц к данным во время их перемещения через Интернет. Оказавшись в CRIMS, серия меню слева от скрининга помогает управлять и создавать образцы, запрашивать эксперименты по кристаллизации, управлять и визуализировать пластины и т. Д. Серия видеоуроков доступна на сайте https://medias01-web.embl.de/Mediasite/Showcase/embl/Channel/a2168bcaa36b4564851663e5b69594014d.ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователи, отправляя образцы курьером, должны зарегистрировать образцы и запрошенные эксперименты кристаллизации через CRIMS перед отправкой образца, чтобы гарантировать, что они могут быть обработаны без задержек по прибытии. Пожалуйста, отправьте детали отправления в htx@embl.fr. Войдите в CRIMS (https://htxlab.embl.fr) с помощью веб-браузера и нажмите на меню примеров. Откроется интерфейс с проектами и образцами средств управления. Нажмите кнопку «Новый образец» и предоставьте запрашиваемую информацию. CRIMS позволяет организовывать выборки под различные проекты, цели и конструкции. Назначьте образец существующим или создайте новые на этом этапе. После того, как запрошенная информация была введена, нажмите «Сохранить и сделать запрос». Выберите протокол кристаллизации, используемые кристаллизационные экраны, температуру инкубации и желаемую дату экспериментов. Используйте поля комментариев, чтобы предоставить сведения о образцах, которые важно знать операторам лаборатории HTX. Также можно выбрать пользовательские экраны (см. ниже). После отправки запроса на кристаллизацию он будет проверен командой лаборатории HTX и подтверждение о планировании экспериментов будет отправлено по электронной почте. Убедитесь, что выбраны даты эксперимента, совместимые со временем, необходимым для отправки образца. Как только образцы поступят на объект, операторы в лаборатории HTX проведут эксперименты по запросу. Как только эксперименты по кристаллизации будут настроены, подтверждение будет отправлено по электронной почте, а лотки кристаллизации будут переданы автоматизированным томоикроителям. CRIMS предоставляет доступ ко всем экспериментальным параметрам и автоматически отслеживает новые сеансы визуализации. Уведомления по электронной почте будут автоматически отправляться при наличии новых изображений. Эксперимент по оценке качества образцов на основе термофтора на основе30 образцов, основанный на протоколе, разработанном на объекте25,26, проводится с каждым образцом на этом этапе и будет доступен через CRIMS. Изображения экспериментов по кристаллизации вместе с результатами оценки качества образцов будут доступны в CRIMS вскоре после установки лотков кристаллизации. Нажмите на меню Термофтор и перейдите к образцу, чтобы увидеть результаты эксперимента по оценке качества образца. Нажмите на меню Пластины, чтобы увидеть изображения с пластин кристаллизации. Перейдите к образцу и щелкните Вид, чтобы увидеть последний сеанс обработки изображений, или символ + (развернуть), чтобы выбрать другой сеанс обработки изображений. Ряд инструментов помогает легко находить примеры и перемещаться по ним. Например, щелкнув поле проекта в верхней части экранов, образцы фильтров для этого проекта и функции поиска доступны для большинства столбцов таблицы. Используйте интерфейс представления пластин для оценки и оценки результатов экспериментов по кристаллизации. Он позволяет навигацию по различным скважинам кристаллизационных пластин, выбирать типы изображений (например, Vis, UV), выбирать разрешение изображения или записывать оценки, например. Этот интерфейс также предоставляет все экспериментальные параметры, используемые для экспериментов кристаллизации, включая состав кристаллизационных растворов. Нажмите на меню Уточнение, чтобы спроектировать экраны оптимизации кристаллов на основе основных условий попадания, определенных в ходе первоначального скрининга. Подменю «Химические вещества и стоковые решения» позволяет регистрировать и управлять кристаллизацией стоковых растворов. Подменю «Экраны» предоставляет доступ к интерфейсу для разработки собственных оптимизаций или пользовательских экранов. Выберите тип пластины, стандартные решения или конфигурации градиента, которые наилучшим образом соответствуют экспериментальному проекту. Можно попросить CRIMS вывести файл, непосредственно совместимый с formulator Robot (Formulatrix), чтобы автоматически пипетировать экраны в пластину или вывести печатный документ с томами для ручного управления. Выполните итерацию шагов 1.2-1.8 для проведения экспериментов по оптимизации кристаллов. После того, как кристаллы, подходящие для экспериментов по дифракции рентгеновских лучей, будут идентифицированы, перейдите к интерфейсу просмотра пластины и выберите изображение, соответствующее правильному капле кристаллизации. Предварительно сохраненные оценки помогут вам сделать это легко. Нажмите либо на Crystal Harvesting, чтобы записать автоматический план сбора кристаллов для робота-комбайна CrystalDirect, либо на Ручной сбор для традиционного ручного монтажа кристаллов, если используется CRIMS на объекте, который не оснащен CrystalDirect. Оба интерфейса будут направлять пользователя через процесс сбора кристаллов. CRIMS автоматически записывает и сохраняет местоположение собранных кристаллов в SPINE или Unipucks21. Выберите меню Crystal Manager в CRIMS. Нажмите на подменю «Собранные кристаллы», чтобы осмотреть замороженные образцы. При использовании комбайна CrystalDirect представлены изображения процесса сбора урожая, в том числе изображения штифтов с собранными кристаллами. Выберите меню «Отгрузки», чтобы подключиться к синхротронам ESRF или Petra III и создать партии образцов для рентгеновского дифракционного анализа. Нажмите кнопку «Создать отправление» и выберите синхротрон, который вы хотите использовать, и номер сумки (пароль сумки на синхротроне необходим здесь). Следующая серия интерфейсов используется для выбора пуксов, которые будут включены в отгрузку. Система позволяет предоставлять комментарии для поддержки сбора данных и определения параметров сбора данных для автоматизированных линий луча, таких как MASSIF-1. Если сбор данных осуществляется в лаборатории ESRF или Petra III HTX, операторы будут передавать образцы на линию луча, сбор данных на других синхротронах будет осуществляться за счет пользователя. Сбор данных возможен путем перемещения к синхротрону, через дистанционное управление лучевой линией или на MASSIF-1. В последнем случае процесс сбора данных полностью автоматизирован. На синхротроне специальные интерфейсы в ISPyB29 позволяют пользователям восстанавливать информацию, отправленную CRIMS, и связывать с ней пики образцов, чтобы результаты сбора данных автоматически отслеживались. Для экспериментов, описанных здесь, сбор данных на синхротронах обычно осуществлялся с помощью программного обеспечения MXcube31, в то время как обработка данных и уточнение структуры осуществлялись с помощью atuoPROC32,Staraninso33,BUSTER33,Pipedream32,33 и Coot35. После проведения экспериментов по сбору данных CRIMS извлекает сводную информацию вместе с результатами первоначальной обработки данных на синхротроне из системы ISPyB29. Перейдите в меню CRIMS Crystal Manager и нажмите на подменю Crystal Diffraction Data. Вся информация и метаданные, касающиеся сбора данных о дифракции, имеются. Также можно загружать обработанные данные с синхротрона, а также необработанные дифракционные изображения. Просмотр нескольких коллекций данных или выбор определенных наборов данных. Примеры средств управления позволяют перемещаться и выбирать образцы для конкретных конструкций проектов.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот конвейер обеспечивает полностью автоматизированную работу через Интернет от чистого белка до результатов рентгеновской дифракции и может работать с одним или несколькими образцами одновременно. Он может быть применен к различным контекстам и типам проектов в структурной биологии.

Representative Results

Автоматизированный кристаллографический конвейер, описанный выше, был применен для поддержки большого количества внутренних и внешних проектов с замечательным успехом. Несколько основных моментов включают проект Джиновича-Каруго и сотрудников из Лаборатории Макса Перуца (Вена), сосредоточенный на структурном и функциональном анализе дипептидилпептидазы, необходимой для роста бактериального патогена. Быстрая последовательность циклов скрининга кристаллизации, дифракционной оценки, оптимизации кристаллов и сбора рентгеновских данных (до 8 итераций для данного проекта) позволила всего за несколько недель получить структурные модели для трех различных конформационных состояний белка, что обеспечило ключевое механистическое понимание функции этого класса белков36 (см. Рисунок 1). Другим примером является Масиас и его коллеги из Института биомедицинских исследований (IRB, Барселона), которые объединили инструменты биоинформатики и структурные подходы для выявления новых мотивов связывания ДНК для факторов транскрипции SMAD3 и SMAD4, участвующих в регуляции судьбы клеток. Эта работа произвела 6 структур высокого разрешения SMAD3 и 4 в комплексе с различными мотивами связывания ДНК37,38, раскрывая до сих пор неподозрительную способность этих факторов транскрипции распознавать и связываться с разнообразным массивом последовательностей ДНК, что является ключевым для интерпретации их функции в различных биологических контекстах. Эти технологии также применялись для поддержки собственных исследований в контексте проектов по разработке лекарств от исследовательских групп в фармацевтических и биотехнологических компаниях. Например, благодаря быстроте, которую вносят эти конвейеры, структурный анализ нескольких лиганд-целевых комплексов может быть достигнут в течение нескольких дней, что имеет большое значение для поддержки последовательных раундов оптимизации медицинской химии в контексте разработки лекарств. Наконец, мы также применили эту инфраструктуру для крупномасштабного рентгеновского скрининга фрагментов39. Рисунок 1:Автоматизированный кристаллографический конвейер. Интегрированная работа лаборатории EMBL HTX, включая технологию CrystalDirect и программное обеспечение CRIMS с лучевой линией MASSIF-1 на ESRF и автоматизированной связью между программным обеспечением CRIMS и ISPyB, позволяет поддерживать полностью автоматизированный, дистанционно управляемый трубопровод белка в структуру, объединяющий скрининг и оптимизацию кристаллизации, автоматизированный сбор кристаллов и криоохлаждение и автоматизированный сбор и обработку данных. Структурные модели соответствуют трем различным конформационным состояниям протеазы из патогенной бактерии, идентифицированной в рекордно короткие сроки путем применения этих трубопроводов36. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Автоматизированные кристаллографические конвейеры, описанные здесь, доступны исследователям по всему миру через различные программы финансирования. В настоящее время финансируемый доступ для экспериментов по кристаллизации и технологии CrystalDirect можно получить, обратившись к программе iNEXT Discovery и INSTRUCT-ERIC, в то время как доступ к макромолекулярным кристаллографическим лучевым линиям в ESRF поддерживается через программу доступа пользователей ESRF. Этот подход сводит к минимуму задержку между ростом кристаллов и измерением, ускоряя прогрессирование очень сложных проектов, требующих дифракционной оптимизации условий производства и кристаллизации белка, и освобождает ученых от сложных операций, связанных с кристаллизацией, обработкой кристаллов и работой с лучевой линией, делая кристаллографию более доступной для неэкспертных групп. Он также может быть использован для быстрого исследования кристаллизационных добавок, фазовых агентов или для скрининга соединений с помощью экспериментов по кокристаллизации. В то время как большинство проектов кристаллографии потенциально могут извлечь выгоду из этого подхода, для некоторых образцов могут потребоваться специальные протоколы, не поддающиеся автоматизации или представленным здесь трубопроводам, например, те, которые требуют микрофлюидных систем или узкоспециализированных устройств кристаллизации или образцов, которые являются чрезвычайно лабильными и не допускают транспортировки.

Технология CrystalDirect также позволяет автоматизировать замачивание кристаллов17 для характеристики комплексов малых молекул-мишеней. Для этого лазером создается небольшое отверстие перед процессом сбора урожая и сверху добавляется капля раствора, содержащего желаемые химические вещества (т.е. фазовые агенты или потенциальные лиганды), так что он вступает в контакт и диффундирует в кристаллизационный раствор, в конечном итоге достигая кристалла. Химические растворы могут быть сформулированы в воде, ДМСО или других органических растворителях. После определенного времени инкубации кристаллы могут быть собраны и проанализированы дифракционным путем, как описано выше. Этот подход был применен к быстрой характеристике лиганд-белковых комплексов в контексте структурно-ориентированного лекарственного дизайна, а также к крупномасштабному скринингу соединений и фрагментов. В последнем случае можно быстро проанализировать библиотеки фрагментов с сотнями и более чем тысячей фрагментов. Конкретные интерфейсы CRIMS, не представленные здесь, облегчают проектирование и автоматическое отслеживание экспериментов по замачинию кристаллов, в то время как интеграция между программным обеспечением CRIMS и пакетом программного обеспечения Pipedream, разработанным Global Phasing Ltd (Великобритания), позволяет автоматизировать обработку данных, фазирование, идентификацию лигандов и уточнение структуры сотен наборов данных параллельно, оптимизируя анализ и интерпретацию данных32,33 . Например, этот конвейер был недавно применен для идентификации фрагментов, связывающих как с активным сайтом, так и с несколькими аллостерическими участками Trypanosoma brucei farnesyl pyrophosphate synthase, ключевого фермента паразита, вызывающего африканский трипаносомоз человека.

Представленные здесь конвейеры могут способствовать ускорению темпов открытий в структурной биологии и сделать макромолекулярную кристаллографию более доступной для большего числа исследовательских групп. Кроме того, способствуя крупномасштабному скринингу соединений и фрагментов, они могут способствовать трансляционным исследованиям и ускорению процесса открытия лекарств, способствуя разработке более совершенных и безопасных лекарств против большего числа мишеней.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотим поблагодарить совместную группу структурной биологии EMBL-ESRF (JSBG) за поддержку в использовании и эксплуатации макромолекулярных лучевых линий ESRF. Мы благодарны Мэтью Боулеру за поддержку в сборе данных на линии луча MASSIF-1 ESRF и Томасу Шнайдеру и команде EMBL Hamburg за отличную поддержку в сборе данных на P14 синхротрона PetraIII (DESY, Гамбург, Германия). Комбайн CrystalDirect разработан в сотрудничестве с командой приборов EMBL Grenoble. Этот проект был поддержан финансированием программы Европейского сообщества H2020 в рамках проектов iNEXT (грант No 653706) и iNEXT Discovery (грант No 871037), а также Région Auvergne-Rhône-Alpes через программу Booster.

Materials

CrystalDirect harvester Arinax Automated crystal mounting and cryocooling
CrystalDirect Crystallization plate Mitegen SKU: M-XDIR-96-2 96-well crytsallization microplate
Formulator 16 Formulatrix For the autoamted preparation of crystallization screens
Mosquito crystallization Robot SPT Labtech For the preparation of crystallization experiments
Tecan Evo Liquid handling station Tecan For the preparation of crystallization solutions
Spine Pucks Mitegen SKU: M-SP-SC3-1 SPINE-compatible cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers
UniPucks Mitegen SKU: M-CP-111-021 Universal cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Abola, E., Kuhn, P., Earnest, T., Stevens, R. C. Automation of X-ray crystallography. Nature Structural Biology. 7, 973-977 (2000).
  2. Banci, L., et al. First steps towards effective methods in exploiting high-throughput technologies for the determination of human protein structures of high biomedical value. Acta crystallographica. Section D, Biological. 62 (10), 1208-1217 (2006).
  3. Edwards, A. Large-scale structural biology of the human proteome. Annual Review in Biochemistry. 78, 541-568 (2009).
  4. Rupp, B., et al. The TB structural genomics consortium crystallization facility: towards automation from protein to electron density. Acta crystallographica. Section D, Biological. 58 (10), 1514-1518 (2002).
  5. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).
  6. Cusack, S., et al. Small is beautiful: protein micro-crystallography. Nature Structural and Molecular Biology. 5, 634-637 (1998).
  7. McCarthy, A. A., et al. ID30B – a versatile beamline for macromolecular crystallography experiments at the ESRF. Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 1249-1250 (2018).
  8. Bowler, M. W., et al. MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).
  9. von Stetten, D., et al. ID30A-3 (MASSIF-3) – a beamline for macromolecular crystallography at the ESRF with a small intense beam. Journal of Synchrotron Radiation. 27 (3), 844-851 (2020).
  10. Viola, R., et al. First experiences with semi-autonomous robotic harvesting of protein crystals. Journal of Structural and Functional Genomics. 12, 77-82 (2011).
  11. Khajepour, M. Y. H., et al. REACH: Robotic Equipment for Automated Crystal Harvesting using a six-axis robot arm and a micro-gripper. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 69 (3), 381-387 (2013).
  12. Wagner, A., Duman, R., Stevens, B., Ward, A. . Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 69, 1297-1302 (2006).
  13. Collins, P. M. Gentle, fast and effective crystal soaking by acoustic dispensing. Acta crystallographica. D73, 246-255 (2017).
  14. Deller, M. C., Rupp, B. Approaches to automated protein crystal harvesting. Acta crystallographica. F70, 133-155 (2014).
  15. Cipriani, F., Röwer, M., Landret, C., Zander, U., Felisaz, F., Márquez, J. A. CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (10), 1393-1399 (2012).
  16. Márquez, J. A., Cipriani, F. CrystalDirectTM: A Novel Approach for Automated Crystal Harvesting Based on Photoablation of Thin Films. Structural Genomics. 1091, 197-203 (2014).
  17. Zander, U., et al. Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).
  18. Cianci, M., et al. P13, the EMBL macromolecular crystallography beamline at the low-emittance PETRA III ring for high- and low-energy phasing with variable beam focusing. Journal of Synchrotron Radiation. 24 (1), 323-332 (2017).
  19. Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), 87-94 (2014).
  20. iNEXT Consortium . iNEXT: a European facility network to stimulate translational structural biology. FEBS Letters. 592 (12), 1909-1917 (2018).
  21. Papp, G., et al. Towards a compact and precise sample holder for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 73 (10), 829-840 (2017).
  22. Whittle, P. J., Blundell, T. L. Protein Structure-Based drug design. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 349-375 (1994).
  23. Blundell, T. L., Jhoti, H., Abell, C. High-throughput crystallography for lead discovery in drug design. Nature Reviews Drug Discovery. 1, 45-54 (2002).
  24. Krojer, T., et al. The XChemExplorer graphical workflow tool for routine or large-scale protein–ligand structure determination. Acta Crystallographica. D73, 267-278 (2017).
  25. Mariaule, V., Dupeux, F., Márquez, J. A. Estimation of Crystallization Likelihood Through a Fluorimetric Thermal Stability Assay. Structural Genomics. 1091, 189-195 (2014).
  26. Dupeux, F., Röwer, M., Seroul, G., Blot, D., Márquez, J. A. A thermal stability assay can help to estimate the crystallization likelihood of biological samples. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (11), 915-919 (2011).
  27. Dimasi, N., Dupeux, F., Marquez, J. A. Expression, crystallization and X-ray data collection from microcrystals of the extracellular domain of the human inhibitory receptor expressed on myeloid cells IREM-1. Acta Crystallographica. F63, 204-208 (2007).
  28. Hiraki, M., Matsugaki, N., Yamada, Y., Hikita, M., Yamanaka, M., Senda, T. . RFID tag system for sample tracking at structural biology beamlines. , 060074 (2019).
  29. Delageniere, S., et al. ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography. Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).
  30. Ericsson, U., et al. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
  31. Gabadinho, J., et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17, 700-707 (2010).
  32. Vonrhein, C., et al. Data processing and analysis with the autoPROC toolbox. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 293-302 (2011).
  33. Smart, O. S., et al. Exploiting structure similarity in refinement: automated NCS and target-structure restraints in BUSTER. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (4), 368-380 (2012).
  34. Bezerra, G. A., et al. Bacterial protease uses distinct thermodynamic signatures for substrate recognition. Scientific Reports. 7 (1), 2848 (2017).
  35. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica. D66, 486-501 (2010).
  36. Bezerra, G. A., et al. Bacterial protease uses distinct thermodynamic signatures for substrate recognition. Scientific Reports. 7 (1), 2848 (2017).
  37. Martin-Malpartida, P., et al. Structural basis for genome wide recognition of 5-bp GC motifs by SMAD transcription factors. Nature Communications. 8 (1), 2070 (2017).
  38. Aragón, E., et al. Structural basis for distinct roles of SMAD2 and SMAD3 in FOXH1 pioneer-directed TGF-β signaling. Genes & Development. 33 (21-22), 1506-1524 (2019).
  39. Münzker, L., et al. Fragment‐Based Discovery of Non‐bisphosphonate Binders of Trypanosoma brucei Farnesyl Pyrophosphate Synthase. ChemBioChem. 21 (21), 3096-3111 (2020).

Tags

Automated CrystallographyEMBL HTX FacilityGrenobleCrystalDirect TechnologyCRIM SoftwareCrystal Graphic Information Management SystemCrystallization ProtocolCrystallization ScreensHigh Throughput Crystallization LabAutomated ImagersCRIMSCrystallization PlatesCrystallization ExperimentsCrystal HarvestingProtein Structure DeterminationFragment ScreeningLigand Screening

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Cornaciu, I., Bourgeas, R., Hoffmann, G., Dupeux, F., Humm, A., Mariaule, V., Pica, A., Clavel, D., Seroul, G., Murphy, P., Márquez, J. A. The Automated Crystallography Pipelines at the EMBL HTX Facility in Grenoble. J. Vis. Exp. (172), e62491, doi:10.3791/62491 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image