צינורות הקריסטלוגרפיה האוטומטית במתקן EMBL HTX בגרנובל
Summary
כאן, אנו מתארים כיצד להשתמש בצינורות הקריסטלוגרפיה המקרומולקולרית האוטומטית לניתוח מורכב של חלבון למבנה, ניתוח מורכב מהיר של חלבון ליגנד והקרנת שברים בקנה מידה גדול המבוססת על טכנולוגיית CrystalDirect במעבדת HTX ב- EMBL Grenoble.
Abstract
EMBL Grenoble מפעילה את המעבדה להתגבשות בתפוקה גבוהה (מעבדת HTX), מתקן משתמשים בקנה מידה גדול המציע שירותי קריסטלוגרפיה בתפוקה גבוהה למשתמשים ברחבי העולם. למעבדת HTX יש דגש חזק בפיתוח שיטות חדשות בקריסטלוגרפיה מקרומולקולרית. באמצעות השילוב של פלטפורמת התגבשות תפוקה גבוהה, טכנולוגיית CrystalDirect להרכבה והקפאה אוטומטיות לחלוטין ותוכנת CRIMS פיתחנו צינורות אוטומטיים לחלוטין לקריסטלוגרפיה מאקרומולקולרית שניתן להפעיל מרחוק דרך האינטרנט. אלה כוללים צינור חלבון למבנה לקביעת מבנים חדשים, צינור לאפיון מהיר של מתחמי ליגנד חלבונים לתמיכה בכימיה רפואית, וצינור סינון שברים אוטומטי בקנה מידה גדול המאפשר הערכה של ספריות של מעל 1000 שברים. כאן אנו מתארים כיצד לגשת למשאבים אלה ולהשתמש בהם.
Introduction
אוטומציה הוצגה בכל השלבים של תהליך הניסוי של קריסטלוגרפיה מקרומולקולרית, החל מהתגבשות וכלה באיסוף ועיבוד נתוני עקיפה1,2,3,4,5,6,7,8,9, כולל מספר טכנולוגיות להרכבה מדגם10,11,12 ,13,14,15,16,17. זה לא רק האיץ את הקצב שבו מבנים קריסטלוגרפיים מתקבלים, אלא תרם לייעל יישומים כמו עיצוב תרופה מונחית מבנה18,19,20,21,22,23,24. בכתב יד זה אנו מתארים כמה מההיבטים של צינורות הקריסטלוגרפיה האוטומטיים הזמינים במעבדת HTX בגרנובל, כמו גם בטכנולוגיות הבסיסיות.
מעבדת HTX ב- EMBL Grenoble היא אחד המתקנים האקדמיים הגדולים ביותר להקרנת התגבשות באירופה. הוא ממוקם במשותף בקמפוס האירופי פוטון וניוטרון (EPN) יחד עם מתקן הקרינה הסינכרוטרוני האירופי (ESRF), המייצר כמה מקורות הרנטגן המבריקות ביותר בעולם והמכון לאו לנגווין (ILL), המספק קרני נויטרונים בשטף גבוה. מאז תחילת הפעילות בשנת 2003 סיפקה מעבדת HTX שירותים ליותר מ-800 מדענים ומעבדת יותר מ-1,000 דגימות בשנה. למעבדת HTX יש מיקוד חזק בפיתוח שיטות חדשות בקריסטלוגרפיה מקרומולקולרית, כולל שיטות להערכת מדגם ובקרת איכות25,26 וטכנולוגיית CrystalDirect, המאפשרות הרכבה ועיבוד קריסטל אוטומטיים לחלוטין15,16,17. מעבדת HTX פיתחה גם את מערכת ניהול המידע הקריסטלוגרפית (CRIMS), מערכת מידע מעבדתית מבוססת אינטרנט המספקת תקשורת אוטומטית בין מתקני התגבשות ואיסוף נתונים סינכרוטרון, ומאפשרת זרימת מידע ללא הפרעה לאורך כל מחזור המדגם מחלבון טהור לנתוני עקיפה. באמצעות השילוב של היכולות של מתקן HTX, טכנולוגיית CrystalDirect ותוכנת CRIMS, פיתחנו צינורות אוטומטיים לחלוטין מחלבון למבנה המשלבים סינון התגבשות, אופטימיזציה של קריסטלים, עיבוד אוטומטי של קצירת קריסטלים ואיסוף נתוני קריוקולינג ורנטגן בסינכרוטרונים מרובים לזרימת עבודה אחת ורציפה שניתן להפעיל מרחוק באמצעות דפדפן אינטרנט. צינורות אלה ניתן ליישם כדי לתמוך בקביעה מהירה של מבנים חדשים, אפיון של מתחמי חלבון-ליגנד והקרנת תרכובת ורסיסים בקנה מידה גדול באמצעות קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן.
מעבדת HTX מצוידת ברובוט התגבשות nonvolume (כולל מודול LCP המאפשר התגבשות של חלבונים מסיסים וממברנה), חוות קריסטל (ב 5 °C (5 °C ו 20 °C), שתי תחנות טיפול נוזלי רובוטי להכנת מסכי התגבשות, ושני קוצרי קריסטל CrystalDirect אוטומטיים עם יכולת לייצר ולאחסן עד 400 סיכות מדגם קפואות לכל מחזור פעולה. מדענים שולחים את הדגימות שלהם למתקן באמצעות שליח אקספרס, אשר מעובדים לאחר מכן על ידי טכנאים ייעודיים במעבדת HTX. מדענים יכולים לתכנן מרחוק סינון התגבשות וניסויי אופטימיזציה באמצעות ממשק אינטרנט המסופק על ידי מערכת CRIMS. באמצעות ממשק זה, הם יכולים לבחור מתוך מגוון רחב של פרמטרים ופרוטוקולים ניסיוניים הזמינים במתקן כדי להתאים לדרישות המדגם הספציפיות שלהם. תוצאות יחד עם כל הפרמטרים הניסיוניים נעשים זמינים למשתמשים בזמן אמת באמצעות CRIMS. כל הדגימות שהתקבלו נמענות בשיטה שפותחה במיוחד המאפשרת להעריך את סבירות ההתגבשות של המדגם25,26,27. בהתבסס על התוצאות של זה בדיקות המלצות ספציפיות נעשות למשתמשים לגבי טמפרטורת הדגירה האופטימלית וניסויי אופטימיזציה מדגם אפשריים. לאחר שנקבעו ניסויי התגבשות, המדען יכול להעריך את התוצאות על ידי התבוננות בתמונות התגבשות שנאספו בנקודות זמן שונות דרך האינטרנט. כאשר מזהים גבישים המתאימים לניסויי עקיפה של קרני רנטגן, מדענים יכולים להשתמש בממשק ייעודי כדי להקים תוכנית הרכבה גבישית שתבוצע לאחר מכן על ידי הרובוט CrystalDirect.
טכנולוגיית CrystalDirect מבוססת על שימוש במיקרו-לוח התגבשות אדים שונה וקרן לייזר להרכבה ודגימות קריסטל קריו-קרירות לתביעות עקיפה תומכת בסגירת פער האוטומציה הקיים בין התגבשות לאיסוף נתונים15,16,17. בקצרה, גבישים גדלים בלוח דיפוזיה אדים שונה, microplate CrystalDirect. ברגע שהקריסטלים מופיעים רובוט הקציר CrystalDirect מחיל באופן אוטומטי קרן לייזר כדי לחתוך קטע סרט המכיל את הגביש, לחבר אותו סיכת איסוף נתוני עקיפה סטנדרטית, וקורר אותה בזרם גז חנקן (ראה זנדר ואח ‘2016 ו- https://www.youtube.com/watch?v=Nk2jQ5s7Xx8 ). לטכנולוגיה זו יש מספר יתרונות נוספים על פני פרוטוקולי הרכבה ידניים או אוטומטיים למחצה של קריסטל. לדוגמה, הגודל והצורה של הגבישים אינם בעיה, מה שהופך אותו קל באותה מידה לקצור גבישים גדולים או microcrystals, לעתים קרובות ניתן להימנע משימוש של קריו-מגן, בשל האופן המיוחד שבו הטכנולוגיה פועלת (ראה התייחסות 17, זנדר ואח ‘), מה שהופך ניתוח עקיפה רנטגן הרבה יותר פשוט. קרן הלייזר יכולה לשמש גם ככלי כירורגי לבחירת החלקים הטובים ביותר של מדגם כאשר גבישים גדלים על אשכולות או להראות צמיחה אפיטקסית למשל. טכנולוגיית CrystalDirect יכולה לשמש גם לניסויי השריה אוטומטיים17. אספקת פתרונות עם מולקולות קטנות או כימיקלים אחרים לגבישים. ובכך הוא מאפשר לתמוך אוטומטית לחלוטין, בקנה מידה גדול תרכובת הקרנה קטע. לאחר גבישים נקצרים ומוקפאים על ידי הרובוט CrystalDirect, הם מועברים ל- SPINE או דיסקיות Unipuck התואמות לרוב קווי הקרן של הקריסטלוגרפיה המקרומולקולרית הסינכרונית ברחבי העולם. המערכת יכולה לקצור עד 400 פינים (הקיבולת של אחסון קריוגני דיואר) באופן אוטונומי לחלוטין. CRIMS מתקשר עם רובוט הקוצר במהלך התהליך ומספק מעקב אוטומטי אחר דגימות קריסטל (דיסקיות וסיכות). דיסקיות מסומנות הן בברקודים והן בתגי RFID כדי להקל על ניהול מדגם21,28.
CRIMS מספקת ממשק תוכנית יישומים (API) התומך בתקשורת אוטומטית עם מערכת ISPyB התומכת בניהול ועיבוד של איסוף נתונים ברנטגן בסינכרוטרון רבים באירופה ובעולם29. לאחר השלמת קצירת הגבישים האוטומטית, מדענים יכולים לבחור דגימות קריסטל (דיסקיות) וליצור משלוחי מדגם עבור קווי הקרן הקריסטלוגרפיים המקרומולקולריים ב- ESRF (גרנובל, צרפת)7,8,9 אופטרה III סינכרוטרון (המבורג, גרמניה)18,19. CRIMS מעבירים את הנתונים המתאימים לדגימות קו הקרן שנבחרו למערכת המידע של סינכרוטרון יחד עם פרמטרי איסוף נתונים שנבחרו מראש. ברגע שהדגימות מגיעות לקו הקרן הסינכרוטרוני שנבחר, איסוף נתוני רנטגן מתבצע באופן ידני, באמצעות פעולת קו קרן מרחוק או באופן אוטומטי לחלוטין (כלומר, בקו הקרן MASSIF-1 של ESRF8 המופעל על ידי קבוצת הביולוגיה המבנית המשותפת EMBL ESRF (JSBG)). לאחר איסוף נתונים CRIMS מאחזר מידע אוטומטי על תוצאות איסוף הנתונים יחד עם תוצאות עיבוד נתונים ראשוניות המבוצעות על ידי מערכות עיבוד הנתונים של סינכרוטרון ומציג אותו למדען באמצעות ממשק משתמש נוח.
מעבדת HTX מיישמת צינורות אוטומטיים אלה כדי לתמוך בשלושה יישומים שונים, קביעות מהירות של מבנים חדשים, אפיון מהיר של מתחמי ליגנד חלבונים והקרנת תרכובת ורסיסים בקנה מידה גדול. להלן אנו מתארים כיצד להשתמש ולהפעיל אותם.
Protocol
Representative Results
Discussion
צינורות הקריסטלוגרפיה האוטומטיים המתוארים כאן זמינים לחוקרים ברחבי העולם באמצעות תוכניות מימון שונות. נכון לעכשיו, גישה ממומנת לניסויי התגבשות וטכנולוגיית CrystalDirect ניתן להשיג על ידי החלה על תוכנית גילוי iNEXT ו INSTRUCT-ERIC, בעוד גישה לקורות קרן קריסטלוגרפיה מאקרומולקולרית ב- ESRF נתמכת באמצעות תוכנית הגישה למשתמש ESRF. גישה זו ממזערת את העיכוב בין צמיחת הגביש למדידה, מאיצה את התקדמותם של פרויקטים מאתגרים מאוד הדורשים אופטימיזציה מבוססת עקיפה של תנאי ייצור וגיבוש חלבונים ומשחררת מדענים מפעולות מורכבות הקשורות להתגבשות, טיפול בגבישים ותפעול קו קרן, מה שהופך את הקריסטלוגרפיה לנגישת יותר לקבוצות שאינן מומחים. זה יכול לשמש גם לחקירה מהירה של תוספי התגבשות, סוכניphasing או עבור הקרנה מורכבת באמצעות ניסויים התגבשות משותפת. בעוד שרוב פרויקטי הקריסטלוגרפיה עשויים להפיק תועלת מגישה זו, דגימות מסוימות עשויות לדרוש פרוטוקולים מיוחדים שאינם מקובלים על אוטומציה או על הצינורות המוצגים כאן, למשל אלה הדורשים מערכות מיקרופלואידיות או התקני התגבשות מיוחדים מאוד או דגימות שהם מאוד שפתיים ולא יסבלו משלוח.
טכנולוגיית CrystalDirect מאפשרת גם השריית קריסטל אוטומטית17 לאפיון מתחמי מטרות מולקולות קטנות. בשביל זה, צמצם קטן נוצר עם הלייזר לפני תהליך הקציר וטיפה של פתרון המכיל את הכימיקלים הרצויים (כלומר, סוכניphasing או ליגנדים פוטנציאליים) מתווסף על גבי, כך שהוא נכנס במגע עם, ומתפזר לתוך פתרון התגבשות בסופו של דבר להגיע גבישי. פתרונות כימיים יכולים להיות מנוסחים במים, DMSO או ממיסים אורגניים אחרים. לאחר זמן דגירה מסוים ניתן לקצור ולנתח את הגבישים על ידי עקיפה כמתואר לעיל. גישה זו יושמה על אפיון מהיר של מתחמי חלבון ליגנד בהקשר של עיצוב תרופות מבוססות מבנה, כמו גם על הקרנת תרכובת ורסיסים בקנה מידה גדול. במקרה האחרון ניתן לנתח במהירות ספריות קטעים עם מאות עד למעלה מאלף שברים. ממשקי CRIMS ספציפיים שאינם מוצגים כאן מאפשרים תכנון ומעקב אוטומטי אחר ניסויי השריית קריסטל, תוך שילוב בין תוכנת CRIMS וחבילת התוכנה Pipedream, שפותחה על ידי Global Phasing Ltd (בריטניה) ומאפשר עיבוד נתונים אוטומטי, פיזות, זיהוי ליגנד ועידון מבנה על פני מאות ערכות נתונים במקביל, ייעול ניתוח נתונים ופרשנות32,33 . לדוגמה, צינור זה הוחל לאחרונה על זיהוי שברים המחייבים הן לאתר הפעיל והן למספר אתרים אלוסטריים של טריפנוסומה ברוסי פרנסיל פירופוספט סינתאז, אנזים מרכזי של הטפיל הגורם טריפנוזומיהזיס אפריקאי אנושי.
הצינורות המוצגים כאן יכולים לתרום להאצת קצב הגילוי בביולוגיה מבנית ולהפוך את הקריסטלוגרפיה המקרומולקולרית לנגישת יותר למספר גדול יותר של קבוצות מחקר. יתר על כן, על ידי הקלת תרכובת בקנה מידה גדול הקרנת שבר הם יכולים לתרום לטפח מחקר תרגום ולהאיץ את תהליך גילוי התרופה, תורם כדי להקל על פיתוח של תרופות טובות ובטוחות יותר נגד מספר גדול יותר של מטרות.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו רוצים להודות לקבוצת הביולוגיה המבנית המשותפת EMBL-ESRF (JSBG) על התמיכה בשימוש ובתפעול של קווי הקרן המקרומולקולריים של ESRF. אנו מודים למת’יו בולר על התמיכה באיסוף נתונים בקו הקרן MASSIF-1 של ESRF ותומאס שניידר וצוות EMBL המבורג על תמיכה מצוינת עם איסוף נתונים ב- P14 של סינכרוטרון פטרהייל (DESY, המבורג, גרמניה). קוצר CrystalDirect פותח בשיתוף עם צוות המכשור ב- EMBL גרנובל. פרויקט זה נתמך במימון תוכנית הקהילה האירופיתH2020 במסגרת הפרויקטים iNEXT (Grant No 653706) ו- iNEXT דיסקברי (Grant No 871037) וכן מתוכנית Région Auvergne-Rhône-Alpes באמצעות תוכנית Booster.
Materials
| CrystalDirect harvester | Arinax | Automated crystal mounting and cryocooling | |
| CrystalDirect Crystallization plate | Mitegen | SKU: M-XDIR-96-2 | 96-well crytsallization microplate |
| Formulator 16 | Formulatrix | For the autoamted preparation of crystallization screens | |
| Mosquito crystallization Robot | SPT Labtech | For the preparation of crystallization experiments | |
| Tecan Evo Liquid handling station | Tecan | For the preparation of crystallization solutions | |
| Spine Pucks | Mitegen | SKU: M-SP-SC3-1 | SPINE-compatible cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers |
| UniPucks | Mitegen | SKU: M-CP-111-021 | Universal cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers |
Referências
- Abola, E., Kuhn, P., Earnest, T., Stevens, R. C. Automation of X-ray crystallography. Nature Structural Biology. 7, 973-977 (2000).
- Banci, L., et al. First steps towards effective methods in exploiting high-throughput technologies for the determination of human protein structures of high biomedical value. Acta crystallographica. Section D, Biological. 62 (10), 1208-1217 (2006).
- Edwards, A. Large-scale structural biology of the human proteome. Annual Review in Biochemistry. 78, 541-568 (2009).
- Rupp, B., et al. The TB structural genomics consortium crystallization facility: towards automation from protein to electron density. Acta crystallographica. Section D, Biological. 58 (10), 1514-1518 (2002).
- Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).
- Cusack, S., et al. Small is beautiful: protein micro-crystallography. Nature Structural and Molecular Biology. 5, 634-637 (1998).
- McCarthy, A. A., et al. ID30B – a versatile beamline for macromolecular crystallography experiments at the ESRF. Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 1249-1250 (2018).
- Bowler, M. W., et al. MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).
- von Stetten, D., et al. ID30A-3 (MASSIF-3) – a beamline for macromolecular crystallography at the ESRF with a small intense beam. Journal of Synchrotron Radiation. 27 (3), 844-851 (2020).
- Viola, R., et al. First experiences with semi-autonomous robotic harvesting of protein crystals. Journal of Structural and Functional Genomics. 12, 77-82 (2011).
- Khajepour, M. Y. H., et al. REACH: Robotic Equipment for Automated Crystal Harvesting using a six-axis robot arm and a micro-gripper. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 69 (3), 381-387 (2013).
- Wagner, A., Duman, R., Stevens, B., Ward, A. . Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 69, 1297-1302 (2006).
- Collins, P. M. Gentle, fast and effective crystal soaking by acoustic dispensing. Acta crystallographica. D73, 246-255 (2017).
- Deller, M. C., Rupp, B. Approaches to automated protein crystal harvesting. Acta crystallographica. F70, 133-155 (2014).
- Cipriani, F., Röwer, M., Landret, C., Zander, U., Felisaz, F., Márquez, J. A. CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (10), 1393-1399 (2012).
- Márquez, J. A., Cipriani, F. CrystalDirectTM: A Novel Approach for Automated Crystal Harvesting Based on Photoablation of Thin Films. Structural Genomics. 1091, 197-203 (2014).
- Zander, U., et al. Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).
- Cianci, M., et al. P13, the EMBL macromolecular crystallography beamline at the low-emittance PETRA III ring for high- and low-energy phasing with variable beam focusing. Journal of Synchrotron Radiation. 24 (1), 323-332 (2017).
- Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), 87-94 (2014).
- iNEXT Consortium . iNEXT: a European facility network to stimulate translational structural biology. FEBS Letters. 592 (12), 1909-1917 (2018).
- Papp, G., et al. Towards a compact and precise sample holder for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 73 (10), 829-840 (2017).
- Whittle, P. J., Blundell, T. L. Protein Structure-Based drug design. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 349-375 (1994).
- Blundell, T. L., Jhoti, H., Abell, C. High-throughput crystallography for lead discovery in drug design. Nature Reviews Drug Discovery. 1, 45-54 (2002).
- Krojer, T., et al. The XChemExplorer graphical workflow tool for routine or large-scale protein–ligand structure determination. Acta Crystallographica. D73, 267-278 (2017).
- Mariaule, V., Dupeux, F., Márquez, J. A. Estimation of Crystallization Likelihood Through a Fluorimetric Thermal Stability Assay. Structural Genomics. 1091, 189-195 (2014).
- Dupeux, F., Röwer, M., Seroul, G., Blot, D., Márquez, J. A. A thermal stability assay can help to estimate the crystallization likelihood of biological samples. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (11), 915-919 (2011).
- Dimasi, N., Dupeux, F., Marquez, J. A. Expression, crystallization and X-ray data collection from microcrystals of the extracellular domain of the human inhibitory receptor expressed on myeloid cells IREM-1. Acta Crystallographica. F63, 204-208 (2007).
- Hiraki, M., Matsugaki, N., Yamada, Y., Hikita, M., Yamanaka, M., Senda, T. . RFID tag system for sample tracking at structural biology beamlines. , 060074 (2019).
- Delageniere, S., et al. ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography. Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).
- Ericsson, U., et al. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
- Gabadinho, J., et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17, 700-707 (2010).
- Vonrhein, C., et al. Data processing and analysis with the autoPROC toolbox. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 293-302 (2011).
- Smart, O. S., et al. Exploiting structure similarity in refinement: automated NCS and target-structure restraints in BUSTER. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (4), 368-380 (2012).
- Bezerra, G. A., et al. Bacterial protease uses distinct thermodynamic signatures for substrate recognition. Scientific Reports. 7 (1), 2848 (2017).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica. D66, 486-501 (2010).
- Bezerra, G. A., et al. Bacterial protease uses distinct thermodynamic signatures for substrate recognition. Scientific Reports. 7 (1), 2848 (2017).
- Martin-Malpartida, P., et al. Structural basis for genome wide recognition of 5-bp GC motifs by SMAD transcription factors. Nature Communications. 8 (1), 2070 (2017).
- Aragón, E., et al. Structural basis for distinct roles of SMAD2 and SMAD3 in FOXH1 pioneer-directed TGF-β signaling. Genes & Development. 33 (21-22), 1506-1524 (2019).
- Münzker, L., et al. Fragment‐Based Discovery of Non‐bisphosphonate Binders of Trypanosoma brucei Farnesyl Pyrophosphate Synthase. ChemBioChem. 21 (21), 3096-3111 (2020).
