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Bioquímica

格勒诺布尔EMBL HTX工厂的自动化晶体学管道

Published: June 05, 2021
doi:
10.3791/62491
, , , , , , , , , ,
1European Molecular Biology Laboratory, 2ALPX S.A.S., 3Institut de Biologie Structurale

Summary

在这里，我们描述了如何使用自动化大分子晶体学管道进行蛋白质到结构，快速配体 – 蛋白质复合物分析和基于EMBL格勒诺布尔HTX实验室的CrystalDirect技术的大规模片段筛选。

Abstract

EMBL Grenoble运营着高通量结晶实验室（HTX Lab），这是一个大型用户设施，为全球用户提供高通量晶体学服务。HTX实验室专注于开发大分子晶体学的新方法。通过高通量结晶平台、用于全自动晶体安装和低温冷却的 CrystalDirect 技术以及 CRIMS 软件的组合，我们开发了可通过互联网远程操作的大分子晶体学全自动管道。其中包括用于测定新结构的蛋白质-结构管道，用于快速表征蛋白质 -配体复合物以支持药物化学的管道，以及用于评估1000多个片段的文库的大规模自动化片段筛选管道。在这里，我们将介绍如何访问和使用这些资源。

Introduction

在大分子晶体学实验过程的各个步骤都引入了自动化，从结晶到衍射数据的采集和处理1、2、3、4、5、6、7、8、9，包括一些样品安装技术10、11、12 ，13，14，15，16，17。这不仅加快了获得晶体学结构的速度，而且有助于简化应用，如结构引导药物设计18，19，20，21，22，23，24。在本手稿中，我们描述了格勒诺布尔HTX实验室提供的自动化晶体学管道的一些方面以及基础技术。

EMBL格勒诺布尔的HTX实验室是欧洲最大的结晶筛选学术设施之一。它与欧洲光子和中子（EPN）校园位于欧洲同步子辐射设施（ESRF）和提供高通量中子束的Laue Langevin研究所（ILL）位于同一地点，该设施可产生世界上最明亮的X射线束。自2003年开始运营以来，HTX实验室已为800多名科学家提供服务，每年处理1000多个样品。HTX实验室非常注重开发大分子晶体学的新方法，包括样品评估和质量控制方法25，26和CrystalDirect技术，可实现全自动晶体安装和处理15，16，17。HTX实验室还开发了晶体信息管理系统（CRIMS），这是一个基于网络的实验室信息系统，可在结晶和同步加速器数据收集设施之间提供自动通信，从而在整个样品周期内实现从纯蛋白质到衍射数据不间断的信息流。通过结合HTX设施、CrystalDirect技术和CRIMS软件的能力，我们开发了全自动蛋白质到结构管道，将结晶筛选、晶体优化、自动晶体收获处理以及多个同步加速器的低温冷却和X射线数据收集整合到一个单一的连续工作流程中，该工作流程可以通过Web浏览器进行远程操作。这些管道可用于支持新结构的快速测定，蛋白质 – 配体复合物的表征以及通过X射线晶体学进行大规模化合物和片段筛选。

HTX实验室配备了一个非卷结晶机器人（包括一个LCP模块，可实现可溶性和膜蛋白的结晶），晶体农场（在5°C和20°C下），两个用于制备结晶筛选的机器人液体处理站，以及两个自动化CrystalDirect晶体收获器，每个操作周期能够生产和存储多达400个冷冻样品针。科学家通过快递将样品送到设施，然后由HTX实验室的专门技术人员进行处理。科学家可以通过CRIMS系统提供的Web界面远程设计结晶筛选和优化实验。通过该接口，他们可以从设施中提供的各种参数和实验方案中进行选择，以满足其特定的样品要求。结果连同所有实验参数通过CRIMS实时提供给用户。所有收到的样品都通过专门开发的方法进行测定，该方法能够估计样品25，26，27的结晶可能性。根据该测定的结果，向用户提出了有关最佳孵育温度和可能的样品优化实验的具体建议。一旦建立了结晶实验，科学家就可以通过查看通过网络在不同时间点收集的结晶图像来评估结果。当确定适合X射线衍射实验的晶体时，科学家可以使用专用接口建立晶体安装计划，然后由CrystalDirect机器人执行。

CrystalDirect技术是基于使用改良的蒸汽扩散结晶微孔板和激光束将晶体样品安装到低温兼容的衍射中，从而缩小了结晶和数据收集之间存在的自动化差距15、16、17。简而言之，晶体在改良的蒸汽扩散板（CrystalDirect微孔板）中生长。一旦晶体出现，CrystalDirect采集机器人会自动应用激光束切除含有晶体的薄膜片，将其连接到标准衍射数据收集引脚，并将其冷冻冷却到氮气流中（参见Zander等人，2016年和 https://www.youtube.com/watch?v=Nk2jQ5s7Xx8）。与手动或半自动晶体安装协议相比，该技术具有许多其他优势。例如，晶体的大小和形状不是问题，使得收获大晶体或微晶同样容易，由于该技术的特殊操作方式（参见参考文献17，Zander等人），使得X射线衍射分析更加直接，因此通常可以避免使用冷冻保护剂。激光束还可以用作手术工具，当晶体在簇上生长或显示外延生长时，选择样品的最佳部分。CrystalDirect技术还可用于自动浸泡实验17。将含有小分子或其他化学物质的溶液输送到晶体中。因此，它能够支持全自动，大规模的化合物和片段筛选。一旦晶体被CrystalDirect机器人捕获和冷冻冷却，它们就会被转移到SPINE或Unipuck冰球上，这些冰球与世界上大多数同步的大分子晶体学光束线兼容。该系统可以完全自主地收集多达400个引脚（低温储存杜瓦瓶的容量）。CRIMS在此过程中与收割机机器人进行通信，并提供晶体样品（圆盘和销钉）的自动跟踪。圆盘同时标有条形码和RFID标签，以方便样品管理21、28。

CRIMS提供了一个应用程序接口（API），支持与ISPyB系统的自动通信，支持欧洲和世界许多同步加速器的X射线数据收集管理和处理29。在自动晶体收获完成后，科学家可以选择晶体样品（圆盘）并为ESRF（法国格勒诺布尔）7，8，9或Petra III同步加速器（德国汉堡）18，19的大分子晶体学光束线创建样品运输。CRIMS将与所选光束线样本相对应的数据以及预选的数据收集参数一起传输到同步加速器信息系统。一旦样品到达选定的同步加速器光束线，X射线数据收集要么手动进行，要么通过远程光束线操作或以全自动方式进行（即，在EMBL ESRF联合结构生物学小组（JSBG）操作的ESRF8的MASSIF-1光束线上）。数据收集后，CRIMS会自动检索有关数据收集结果的信息以及同步加速器数据处理系统执行的初始数据处理结果，并通过方便的用户界面将其呈现给科学家。

HTX实验室应用这些自动化管道来支持三种不同的应用，快速测定新结构，快速表征蛋白质 – 配体复合物以及大规模化合物和片段筛选。下面我们描述如何使用和操作它们。

Protocol

注：通过一系列资助计划，为全球科学家获得这些管道的资金支持。在撰写本文时，通过iNEXT发现计划（https://inext-discovery.eu）接受访问申请，这是一个由欧盟委员会地平线2020计划资助的欧洲设施网络，旨在刺激转化结构生物学20或INSTRUCT-Eric（https://instruct-eric.eu/）。联系通讯作者，了解在特定时间获得资金的当前模式和途径。该协议描述了蛋白质到结构管道的操作，包括我们所有管道的共同步骤，而其他两个管道的特异性将在下一节中讨论。此处的说明参考 CRIMS V4.0。 1. 高通量结晶实验室 在开始之前，请通过 CRIMS 系统 https://htxlab.embl.fr/#/ 要求在 HTX 实验室注册。用户凭据提供对所有实验设计和评估界面的远程访问。 通过网络导航器登录CRIMS（支持Firefox，Chrome和Safari）。CRIMs Web 服务器经过加密，以防止第三方在数据通过 Web 时访问数据。进入CRIMS后，筛选左侧的一系列菜单有助于管理和创建样品，请求结晶实验，管理和可视化板等。https://medias01-web.embl.de/Mediasite/Showcase/embl/Channel/a2168bcaa36b4564851663e5b69594014d 提供一系列视频教程。注意：通过快递发送样品的用户需要在发送样品之前通过CRIMS注册样品和请求的结晶实验，以确保它们可以在到达时立即处理。请将货件详细信息发送给 htx@embl.fr。 使用网络浏览器登录到CRIMS（https://htxlab.embl.fr），然后单击”示例菜单”。这将打开一个与项目和示例管理工具的接口。 单击” 新建示例 “按钮并提供所需的信息。CRIMS允许在不同的项目，目标和构造下组织样本。此时，将示例分配给现有示例或创建新示例。 输入请求的信息后，单击” 保存并发出请求”。选择结晶方案，要使用的结晶筛选，孵育温度和实验所需的日期。 使用注释字段提供有关 HTX 实验室操作员需要了解的重要示例的指示。还可以选择自定义屏幕（见下文）。提交结晶请求后，HTX实验室团队将对其进行验证，并通过电子邮件发送有关实验安排的确认。确保选择与样品装运所需时间兼容的实验日期。 一旦样品到达设施，HTX实验室的操作员将按照要求进行实验。一旦建立了结晶实验，确认将通过电子邮件发送，结晶托盘将被转移到自动成像仪。CRIMS提供对所有实验参数的访问，并将自动跟踪新的成像会话。当有新图像可用时，将自动发送电子邮件通知。基于热氟的30样品质量评估实验基于设施25，26开发的方案，此时对每个样品进行，并将通过CRIMS提供。 结晶实验的图像以及样品质量评估的结果将在结晶托盘设置后不久在CRIMS中提供。单击 “热荧光 “菜单并导航到样品以查看样品质量评估实验的结果。 单击” 板 “菜单以查看结晶板中的图像。导航到样品，然后单击” 视图 “以查看上一个成像会话，或单击 +（ 展开）符号以选择其他成像会话。一系列工具有助于轻松查找和浏览示例。例如，单击屏幕顶部的项目框可筛选该项目的示例，并且搜索函数可用于大多数表列。 使用板 视图 界面帮助评估和评分结晶实验的结果。例如，它允许通过结晶板的不同孔进行导航，选择图像类型（即可见度，UV），选择图像分辨率或记录分数。该接口还提供用于结晶实验的所有实验参数，包括结晶溶液的组成。 单击” 细化 “菜单，根据通过初始筛选确定的主要命中条件设计晶体优化屏幕。 化学品 和 储备解决方案 子菜单允许注册和管理结晶解决方案。” 屏幕” 子菜单提供对界面的访问，以设计您自己的优化或自定义屏幕。 选择最适合实验设计的板类型、库存溶液或梯度配置。可以要求CRIMS输出与配方机器人（Formulatrix）直接兼容的文件，以自动将屏幕移液到印版中，或输出带有卷的可打印文档以进行手动操作。 迭代步骤1.2-1.8进行晶体优化实验。 一旦确定了适合X射线衍射实验的晶体，导航到板 视图 界面，然后选择对应于正确结晶滴的图像。预先存储的分数将帮助您轻松完成此操作。 单击 “水晶采集 “以记录 CrystalDirect 收割机机器人的自动水晶采集计划，或单击 “手动采集” 以记录传统手动晶体安装的”手动采集”，如果在未配备 CrystalDirect 的设施中使用 CRIMS。这两个接口都将指导用户完成晶体采集过程。CRIMS会自动记录收获的晶体的位置并将其存储到SPINE或Unipucks21中。 在 CRIMS 中选择 “水晶管理器 “菜单。单击” 收获的晶体 “子菜单以检查冷冻样品。使用CrystalDirect收获器时，将显示收获过程的图像，包括带有收获晶体的引脚的图像。 选择” 货件 “菜单以连接到 ESRF 或 Petra III 同步加速器，并创建用于 X 射线衍射分析的样品货件。单击 “创建货件 “按钮，然后选择要使用的同步加速器和行李编号（此处需要同步加速器处的行李密码）。接下来的一系列接口用于选择要包含在装运中的 pukcs。该系统可以提供注释以支持数据收集，并确定自动光束线（如MASSIF-1）的数据收集参数。 如果在ESRF或Petra III HTX实验室进行数据收集，操作员会将样品传输到光束线，其他同步加速器的数据收集将由用户自费完成。可以通过行进到同步加速器，通过远程光束线操作或在MASSIF-1上收集数据。在后一种情况下，数据收集过程是完全自动化的。在同步加速器上，ISPyB29中的特定接口允许用户恢复CRIMS发送的信息并将样本圆盘关联到该信息中，以便自动跟踪数据收集结果。对于这里描述的实验，同步加速器的数据收集通常使用MXcube31软件进行，而数据处理和结构细化则使用atuoPROC 32，Staraninso33，BUSTER33，Pipedream32，33和Coot35进行。 一旦进行了数据收集实验，CRIMS就会从ISPyB29系统检索摘要信息以及同步加速器的初始数据处理结果。转到CRIMS 晶体管理器 菜单，然后单击 晶体衍射数据 子菜单。有关衍射数据收集的所有信息和元数据都可用。还可以从同步加速器下载处理后的数据以及原始衍射图像。查看多个数据集合或选择特定数据集。通过示例管理工具，可以为特定项目构造导航和选择示例。注：该管道通过互联网提供从纯蛋白质到X射线衍射结果的全自动操作，并且可以同时操作一个或多个样品。它可以应用于结构生物学中的不同背景和项目类型。

Representative Results

上述自动化晶体学管道已应用于支持大量内部和外部项目，并取得了显著成功。一些亮点包括来自Djinović-Carugo的项目和来自Max Perutz实验室（维也纳）的同事，该项目专注于对细菌病原体的生长至关重要的二肽基肽酶的结构和功能分析。结晶筛选，衍射评估，晶体优化和X射线数据收集周期的快速连续（本项目最多8次迭代）能够在短短几周内获得蛋白质三种不同构象状态的结构模型，这为此类蛋白质的功能提供了关键的机制理解36（见图1）。 另一个例子是来自Macias和来自生物医学研究所（IRB，巴塞罗那）的同事，他们结合了生物信息学工具和结构方法，以鉴定参与细胞命运调节的SMAD3和SMAD4转录因子的新DNA结合基序。这项工作已经产生了6种具有不同DNA结合基序37，38的SMAD3和4的高分辨率结构，揭示了迄今为止这些转录因子识别和结合各种DNA序列的能力，这是在不同生物学背景下解释其功能的关键。这些技术还被应用于支持制药和生物技术公司研究小组的药物设计项目背景下的专有研究。例如，由于这些管道的快速性，可以在几天内实现多个配体靶标复合物的结构分析，这对于在药物开发的背景下支持连续几轮药物化学优化具有重要价值。最后，我们还将这种基础设施应用于大规模基于X射线的片段筛选39。 图1：自动晶体学管道。 EMBL HTX实验室的集成操作，包括CrystalDirect技术和CRIMS软件，与ESRF的MASSIF-1光束线以及CRIMS和ISPyB软件之间的自动通信，能够支持全自动，远程控制的蛋白质到结构管道，集成结晶筛选和优化，自动晶体收获和冷冻冷却以及自动数据收集和处理。结构模型对应于通过应用这些管道36在创纪录的时间内鉴定出的致病细菌的蛋白酶的三种不同构象状态。 请点击此处查看此图的放大版本。

Discussion

这里描述的自动晶体学管道可通过不同的资助计划提供给世界各地的研究人员。目前，可以通过申请iNEXT发现计划和INSTRUCT-ERIC来获得结晶实验和CrystalDirect技术的资金访问，而通过ESRF用户访问计划支持在ESRF访问大分子晶体学光束线。这种方法最大限度地减少了晶体生长和测量之间的延迟，加速了非常具有挑战性的项目的进展，这些项目需要对蛋白质生产和结晶条件进行基于衍射的优化，并将科学家从与结晶，晶体处理和光束线操作相关的复杂操作中解放出来，使非专家组更容易获得晶体学。它还可用于快速探索结晶添加剂、相位剂或通过共结晶实验进行化合物筛选。虽然大多数晶体学项目可能从这种方法中受益，但一些样品可能需要不适合自动化或此处介绍的管道的特殊方案，例如那些需要微流体系统或高度专业化的结晶装置或极其不稳定且不能容忍运输的样品。

CrystalDirect技术还支持自动晶体浸泡17，用于表征小分子靶标配合物。为此，在收获过程之前用激光产生一个小孔径，并在顶部添加一滴含有所需化学物质（即相位剂或潜在配体）的溶液，使其与晶体接触并扩散到结晶溶液中，最终到达晶体。化学溶液可以在水，DMSO或其他有机溶剂中配制。经过一定的孵育时间后，可以如上所述通过衍射收获和分析晶体。这种方法已应用于基于结构的药物设计背景下配体 – 蛋白质复合物的快速表征以及大规模化合物和片段筛选。在后一种情况下，可以快速分析具有数百到一千个片段的片段库。此处未介绍的特定CRIMS接口有助于晶体浸泡实验的设计和自动跟踪，而由Global Phasing Ltd（英国）开发的CRIMS软件和Pipedream软件套件之间的集成可实现对数百个数据集的并行数据处理，相位，配体鉴定和结构细化，简化数据分析和解释32，33.例如，该管道最近被应用于鉴定与 布鲁氏锥虫 法呢基焦磷酸合酶的活性位点和几个变构位点结合的片段，这是引起人类非洲锥虫病的寄生虫的关键酶。

这里介绍的管道有助于加快结构生物学的发现步伐，并使更多的研究小组更容易获得大分子晶体学。此外，通过促进大规模的化合物和片段筛选，它们有助于促进转化研究并加快药物发现过程，有助于促进针对更多靶标开发更好，更安全的药物。

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我们要感谢EMBL-ESRF结构生物学联合小组（JSBG）对ESRF大分子束线的使用和操作的支持。我们感谢Matthew Bowler在ESRF的MASSIF-1光束线上为数据收集提供支持，Thomas Schneider和EMBL汉堡团队在PetraIII同步加速器（德国汉堡DESY）的P14数据收集方面提供了出色的支持。CrystalDirect收割机是与EMBL格勒诺布尔的仪器团队合作开发的。该项目得到了欧洲共同体2020年上半年计划的资金支持，这些项目包括iNEXT（赠款No 653706）和iNEXT发现（赠款871037）以及奥弗涅-罗纳-阿尔卑斯地区通过助推器计划。

Materials

CrystalDirect harvester Arinax Automated crystal mounting and cryocooling
CrystalDirect Crystallization plate Mitegen SKU: M-XDIR-96-2 96-well crytsallization microplate
Formulator 16 Formulatrix For the autoamted preparation of crystallization screens
Mosquito crystallization Robot SPT Labtech For the preparation of crystallization experiments
Tecan Evo Liquid handling station Tecan For the preparation of crystallization solutions
Spine Pucks Mitegen SKU: M-SP-SC3-1 SPINE-compatible cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers
UniPucks Mitegen SKU: M-CP-111-021 Universal cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers
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Referências

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Cornaciu, I., Bourgeas, R., Hoffmann, G., Dupeux, F., Humm, A., Mariaule, V., Pica, A., Clavel, D., Seroul, G., Murphy, P., Márquez, J. A. The Automated Crystallography Pipelines at the EMBL HTX Facility in Grenoble. J. Vis. Exp. (172), e62491, doi:10.3791/62491 (2021).
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