Laser-Mikrobestrahlung zur Untersuchung der DNA-Rekrutierung während der S-Phase
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine nicht-invasive Methode zur effizienten Identifizierung von S-Phasen-Zellen für nachgelagerte Mikroskopiestudien, wie z. B. die Messung der Rekrutierung von DNA-Reparaturproteinen durch Lasermikrobestrahlung.
Abstract
Die Reparatur von DNA-Schäden erhält die genetische Integrität der Zellen in einer hochreaktiven Umgebung. Zellen können verschiedene Arten von DNA-Schäden aufgrund endogener und exogener Quellen wie Stoffwechselaktivitäten oder UV-Strahlung ansammeln. Ohne DNA-Reparatur wird der genetische Code der Zelle beeinträchtigt, was die Strukturen und Funktionen von Proteinen untergräbt und möglicherweise Krankheiten verursacht.
Das Verständnis der raumzeitlichen Dynamik der verschiedenen DNA-Reparaturwege in verschiedenen Zellzyklusphasen ist im Bereich der DNA-Schadensreparatur von entscheidender Bedeutung. Aktuelle Fluoreszenzmikroskopie-Techniken bieten großartige Werkzeuge, um die Rekrutierungskinetik verschiedener Reparaturproteine nach DNA-Schadensinduktion zu messen. Die DNA-Synthese während der S-Phase des Zellzyklus ist ein besonderer Punkt im Zellschicksal in Bezug auf die DNA-Reparatur. Es bietet ein einzigartiges Fenster, um das gesamte Genom auf Fehler zu überprüfen. Gleichzeitig stellen DNA-Synthesefehler auch eine Bedrohung für die DNA-Integrität dar, die in nicht teilenden Zellen nicht anzutreffen ist. Daher unterscheiden sich DNA-Reparaturprozesse in der S-Phase signifikant von anderen Phasen des Zellzyklus, und diese Unterschiede sind schlecht verstanden.
Das folgende Protokoll beschreibt die Herstellung von Zelllinien und die Messung der Dynamik von DNA-Reparaturproteinen in der S-Phase an lokal induzierten DNA-Schadensstellen mit einem laserscannenden konfokalen Mikroskop, das mit einer 405-nm-Laserlinie ausgestattet ist. Tagged PCNA (mit mPlum) wird als Zellzyklusmarker in Kombination mit einem AcGFP-markierten Reparaturprotein von Interesse (dh EXO1b) verwendet, um die DNA-Schadensrekrutierung in der S-Phase zu messen.
Introduction
Mehrere DNA-Reparaturwege haben sich entwickelt, um die verschiedenen Arten von DNA-Läsionen anzugehen, die in Zellen auftreten können, die alle sowohl läsin als auch zeitlich stark reguliert sind. Eine der anfälligsten Perioden des Zellzyklus ist die S-Phase, in der die DNA-Synthese stattfindet. Während die Proliferation für das Leben von grundlegender Bedeutung ist, stellt sie auch eine große Herausforderung dar. Zellen müssen eine originalgetreue Replikation ihres Genoms sicherstellen, um zu vermeiden, dass Mutationen an zukünftige Generationen weitergegeben werden. Folglich bietet die Proliferation einen therapeutischen Interventionspunkt, der für die Entwicklung therapeutischer Ansätze im Bereich der Onkologie eingesetzt wurde.
Alle wichtigen Techniken, die zur Untersuchung der Proteinrekrutierung bei DNA-Läsionen verwendet werden, haben ihre Stärken und Grenzen. Die Mikrobestrahlung hat eine bessere räumliche und zeitliche Auflösung1 als die meisten alternativen Methoden wie immunfluoreszierende Bildgebung von ionisierenden strahlungsinduzierten Herden (IRIF), Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) oder biochemische Fraktionierung. Die Mikrobestrahlung schnürt jedoch die Robustheit der oben genannten Techniken, die eine große Anzahl von Zellen gleichzeitig abtasten können.
Um die DNA-Reparatur in der S-Phase zu untersuchen, muss man in der Lage sein, S-Phasen-Zellen in einer asynchronen Zellkulturpopulation zu unterscheiden. Es gibt viele bekannte Methoden, um dies anzugehen, entweder die Synchronisation von Zellen oder die Visualisierung der verschiedenen Zellzyklusphasen. Beide Ansätze bringen jedoch erhebliche Herausforderungen und mögliche Artefakte mit sich. Chemische Synchronisationsmethoden, die häufig zur Anreicherung von Zellen in der frühen S-Phase verwendet werden (z. B. Doppeltymidinblock, Aphidicolin und Hydroxyharnstoffbehandlung), erreichen eine Synchronisation durch die Induktion von Replikationsstress und schließlich DNA-Schäden selbst. Dies schränkt den Einsatz dieser Methoden zur Untersuchung von DNA-Reparaturprozessen in S-Phase2 ein. Die Synchronisation durch Serummangel und -freisetzung ist nur auf eine begrenzte Anzahl von Zelllinien anwendbar, wobei Krebszelllinien weitgehend ausgeschlossen sind, die im Vergleich zu nicht transformierten Zelllinien weniger auf Wachstumsfaktoren für die Zellzyklusprogression angewiesen sind. Das Fluorescence Ubiquitin Cell Cycle Indicator (FUCCI) System ist ein besonders nützliches Werkzeug zur Untersuchung des Zellzyklus, hat aber eine grundlegende Einschränkung bei der Unterscheidung zwischen S- und G2-Zellzyklusphasen3.
Hier wird gezeigt, dass die Verwendung von fluoreszierend markiertem PCNA als nicht-invasiver Marker für die S-Phase die Nachteile chemischer Zellzyklus-Synchronisationsmethoden begrenzt und gleichzeitig mehr Spezifität und Flexibilität als das FUCCI-System ermöglicht. Als einzelner Marker kann PCNA nicht nur S-Phasen-Zellen in einer asynchronen Population hervorheben, sondern auch die genaue Progression von Zellen innerhalb der S-Phase (d. H. Frühe, Mittlere oder späte S-Phase)4anzeigen. Niedrige Expressionsniveaus von exogener, markierter PCNA sorgen für minimale Interferenzen sowohl bei der Zellzyklusprogression als auch bei DNA-Reparaturprozessen. Wichtig ist, dass PCNA auch als interne Kontrolle für die ordnungsgemäße DNA-Schadensinduktion dient, da es an der Reparatur mehrerer DNA-Läsionen beteiligt ist und an lokal induzierten DNA-Schadensstellen rekrutiert wird1,4.
Die hier vorgestellten Experimente zeigen, wie die Rekrutierungsdynamik von EXO1b in der S-Phase gemessen werden kann und wie diese durch den etablierten PARP-Inhibitor Olaparib beeinflusst wird. Die EXO1b-Nukleaseaktivität ist für eine Vielzahl von DNA-Reparaturwegen relevant, einschließlich Mismatch Repair (MMR), Nukleotid-Exzisionsreparatur (NER) und Doppelsträngenbruchreparatur (DSB). In der S-Phase spielt EXO1b eine wichtige Rolle bei der homologen Rekombination (HR) durch die Bildung von 3′ ssDNA-Überhängen während der DNA-Resektion5. EXO1b wurde weiter in die DNA-Replikation involviert, mit Rollen bei der Checkpoint-Aktivierung, um blockierte DNA-Gabeln neu zu starten, sowie die Primerentfernung und okazaki-Fragmentreifung am verzögerten Strang während der Strangverschiebung in der Replikation5. Die EXO1b-Rekrutierung an beschädigten DNA-Stellen wird durch die direkte Interaktion mit Poly (ADP-Ribose) (PAR)6,7reguliert. Aufgrund der zahlreichen zellzyklusspezifischen Implikationen von EXO1b ist es eine ausgezeichnete Wahl für S-Phasen-spezifische Rekrutierungsstudien mit PCNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische Schritte und mögliche Protokollfehlerbehebung/-änderungen
Das richtige Gewebekulturgefäß für die Mikrobestrahlung ist entscheidend für den Erfolg. Die meisten hochauflösenden Bildgebungssysteme sind für eine Deckglasstärke von 0,17 mm optimiert. Die Verwendung von Bildgebungskammern mit höherer oder geringerer Dicke oder aus Kunststoffpolymeren (nicht für die 405-nm-Bildgebung optimiert) kann die Bildqualität erheblich reduzieren. Wenn Sie Glasoberflächen verwenden, stellen Sie sicher, dass sie gewebekulturbehandelt sind, um die Zelladhäsion zu verbessern. Wenn sie nicht mit Gewebekultur behandelt werden, müssen diese Kammern beispielsweise mit Poly-D-Lysin beschichtet werden, bevor die Zellen ausgesät werden. Beim Plattieren von Zellen in das kammerbewältigte Deckglas ist eine ideale Zelldichte von größter Bedeutung, um Unregelmäßigkeiten im Zellzyklus und zusätzliche Belastung der Zellen zu vermeiden. Die richtige thermische Gleichgewichtierung der Mikroskopkomponenten vor dem Experimentieren, um eine stabile Temperatur aufrechtzuerhalten, ist entscheidend für die Aufrechterhaltung des Fokus während der gesamten Zeitrafferaufnahme und ist auch notwendig, um eine homogene DDR über Zeit und Proben hinweg zu gewährleisten.
Es ist wichtig, dass sich die Zellen vor der Mikrobestrahlung in einem gesunden Zustand befinden, um die artefaktischen Daten zu reduzieren. Wenn Zellen nach der Infektion/ Selektion eine unregelmäßige Morphologie aufweisen, lassen Sie die Zellen durch mehrere Passagen fortschreiten, bis sich die Morphologie wieder normalisiert. Achten Sie immer darauf, dass die verwendeten Zelllinien frei von Mykoplasmenkontamination sind. Unter den vielen Nebenwirkungen der Mykoplasmeninfektion verursacht es auch DNA-Schäden an den Wirtszellen und könnte ihre DDR-Signalwege beeinflussen14,15. Der empfindlichste Weg, Mykoplasmen in der Zellkultur nachzuweisen, ist die PCR (versus. Nachweis mit DAPI oder Hoechst).
Eine optimale Überexpression des interessierenden Reparaturproteins sollte mit endogenen Werten vergleichbar sein, jedoch hoch genug für den Nachweis. Der auf den viralen Vektoren verwendete Promotor, der virale Titer während der Infektion und die Länge der Infektionszeit können alle für ideale Expressionsniveaus angepasst werden. Für konsistente Ergebnisse isolieren Sie einzelne Zellklone, um homogene Expressionsniveaus und eine normale Zellmorphologie zu gewährleisten. Es wird empfohlen, Vektorkonstrukte zu verwenden, die markierte PCNA nicht in höheren als endogenen Konzentrationen überexprimieren, um den richtigen Zellzyklus und die DNA-Reparaturmarkerfunktion zu erreichen. Selbst geringe PCNA-Überexpressionsraten reichen aus, um S-Phasen-Zellen zu unterscheiden. Zu diesem Zweck wurden erfolgreich retrovirale pBABE-Vektoren eingesetzt (Addgene #1764, #1765, #1766, #1767). PCNA kann mit beliebigen monomeren roten(z. B. mPlum, mCherry, mRuby usw.) oder monomeren grün fluoreszierenden Proteinen (z. B. mEGFP, AcGFP, mWasabi, mNeonGreen, mEmerald usw.) markiert werden, die dann mit einem abwechselnd markierten POI kombiniert werden können. Die Überexpressierung eines fluoreszierend markierten POI hat einige Einschränkungen und Überlegungen. Fluoreszierende Tags können die normale Proteinfunktion und -lokalisation stören. Somit muss die Position des Tags (N- oder C-Terminal) berücksichtigt werden. Verwenden Sie immer monomere fluoreszierende Proteine, da die Oligomerisierung nicht-monomerer Varianten die Funktion des POI beeinflussen kann.
Die Lasereinstellungen müssen für jedes Bildgebungssystem bestimmt werden, da viele Komponenten des optischen Pfades die tatsächliche Leistung der Zellen beeinflussen. Die Lasermikrobestrahlung kann verschiedene Arten von DNA-Läsionen verursachen, abhängig von der Anregungswellenlänge, der Leistungsabgabe des FRAP-Lasers und ob vorsensibilisierende Mittel (wie Bromodeoxyuridin oder Hoechst) verwendet wurden. 405 nm Laser können oxidative DNA-Schäden verursachen, einzel- und doppelsträngigeBrüche 16,17. Durch die Verwendung höherer Laserausgabeeinstellungen erhöht sich die Anzahl der DSBs. In diesem Protokoll wurden keine Vorsensibilisierungsmethoden verwendet, aber diese Techniken werden in der Literatur ausführlich behandelt und in der folgenden Diskussion erneut behandelt. Unserer Meinung nach ist der beste Weg, um zu testen, ob die gewünschte Läsion erzeugt wird, die Rekrutierung bekannter DNA-Schadensweg-spezifischer Gene. Die Rekrutierung von NTHL1 oder OGG1, Komponenten des BER-Signalwegs, deutet auf die Induktion von oxidierten DNA-Basen10,11,17,18,19hin, während FBXL10 oder XRCC5 das Vorhandensein von DSBs8,20,21anzeigen . Die Rekrutierung von XRCC1 kann sowohl auf das Vorhandensein von oxidierten DNA-Basen als auch auf einzelsträngige Brüche (SSB)hinweisen 22,23. XPC (d.h. RAD4) ist ein guter Indikator für NER, der die sperrigen DNA-Addukte entfernt, die durch ultraviolettes Licht (UV) erzeugt werden17,24. Da die Rekrutierung exogener Proteine zu bestimmten Unregelmäßigkeiten führen kann, kann die immunfluoreszierende Färbung von endogenen DNA-Reparaturproteinen oder Markern (wie γH2A.X für doppelsträngige Brüche) das Vorhandensein spezifischer DNA-Läsionen bestätigen. Alternativ könnten auch Antikörper gegen bestimmte Arten von DNA-Läsionen verwendet werden. Um die gelieferte Laserleistung einzustellen, können sowohl die Verweilzeit als auch die Laserleistung verändert werden.
Mit Hilfe der mathematischen Modellierung konnte eine detaillierte kinetische Analyse durchgeführt werden, die wertvolle Einblicke in die Rekrutierungseigenschaften des POI liefern kann (z. B. Beitrag mehrerer DNA-Bindungsdomänen, Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen Signalereignissen usw.). Automatisierte Rekrutierungsauswertung und Zellverfolgung könnten kombiniert werden, um robuste Workflows zu schaffen 1,25.
Vorteile und Grenzen der DNA-Vorsensibilisierung
Die Vorsensibilisierung der DNA vor der Mikrobestrahlung ist ein häufig verwendetes Werkzeug zur Rekrutierung von DNA-Reparaturproteinen16,17. Die Sensibilisierung der DNA vor der Mikrobestrahlung macht sie anfälliger für DSBs. Die beiden gebräuchlichsten Methoden zur DNA-Vorsensibilisierung sind die Vorbehandlung von Zellen mit Bromodeoxyuridin (BrdU) oder Hoechst-Farbstoff. Für Systeme, die bei hohen Laserleistungen nicht mikrobestrahlen können, können diese Methoden notwendig sein, um DNA-Läsionen wie DSBs zu induzieren. Darüber hinaus fungiert Hoechst in Ermangelung eines Durchlichtdetektors oder eines fluoreszierenden Signals, das den Zellkern hervorhebt (z. B. bei der Untersuchung der Rekrutierung von nicht markierten endogenen DNA-Reparaturproteinen), sowohl als vorsensibilisierendes Werkzeug als auch als fluoreszierender Kernfleck. Eine DNA-Vorsensibilisierung kann jedoch zu erheblichen Komplikationen führen. BrdU (verwendet in einer Endkonzentration von 10 μM) muss den Zellen 24 Stunden (oder einer Zeit, die einem vollständigen Zellzyklus in der verwendeten Zelllinie entspricht) zugesetzt werden, um sie ordnungsgemäß in die DNA einzubauen, und kann Zellzyklusinterferenz verursachen26. Hoechst 33342 (verwendet in einer Endkonzentration von 1 μg/ml) ist nach langen Inkubationszeitzeiten zytotoxisch, benötigt aber ausreichend Zeit, um den Zellkern mit dem Farbstoff zu sättigen. Daher sollte es nur 15-20 Minuten vor der Mikrobestrahlung angewendet werden; Andernfalls sind die Rekrutierungsdaten nicht konsistent. Die auf diese Weise gefärbten Zellen können nicht länger als ein paar Stunden in Kultur gehalten werden27,28. Achten Sie darauf, Hoechst 33358 nicht zu verwenden, das nicht so zelldurchlässig ist wie der Farbstoff Hoechst 33342. Die Vorsensibilisierung kann auch zu unnötigen Abweichungen zwischen den Experimenten führen und macht das Experiment noch empfindlicher gegenüber Unterschieden in der Zelldichte (da dies die Menge des eingearbeiteten Farbstoffs / der Zelle beeinflusst).
Vorteile und Grenzen der konfokalen Mikroskopie
Die Bildgebungsgeschwindigkeit der konfokalen Mikroskopie kann im Vergleich zur Weitfeldmikrokopie einschränkend sein. Ein konfokales Mikroskop, das mit einem Resonanzscanner ausgestattet ist, kann jedoch die Bildgeschwindigkeit (auf Kosten der Auflösung) enorm verbessern und den Geschwindigkeiten der Spinnscheibenmikroskopie nahe kommen. Drei Eigenschaften machen das konfokale System A1R HD25 zu einer ausgezeichneten Wahl für das hier vorgestellte Protokoll. Erstens ermöglicht das 25-mm-Sichtfeld des Systems die Abbildung von 15-20 Zellen in einem einzigen gescannten Feld (im Vergleich zu 5-10 Zellen in normalen Setups), wodurch die Anzahl der Erfassungen begrenzt wird, die erforderlich sind, um genügend Zellen für die statistische Analyse zu erhalten. Zweitens ermöglichen das FRAP-Modul und zwei Scanheads die gleichzeitige Abbildung und Mikrobestrahlung der Zellen, nicht nur nacheinander. Schließlich bietet die Flexibilität, sowohl den Resonanz- als auch den Galvano-Scanner zu haben, die Möglichkeit, einfach zwischen hochauflösender Bildgebung mit außergewöhnlicher Geschwindigkeit, die das Abschrecken von Fluorophoren minimiert, und hochauflösender Bildgebung, die langsamere Scangeschwindigkeiten verwendet, um Bilder mit einem höheren Signal-Rausch-Verhältnis zu erzeugen, zu wechseln. Während das verwendete System die oben genannte Flexibilität ermöglichte, um weiter verbreiteten konfokalen Mikroskopkonfigurationen zu ähneln, wurde in den vorgestellten Experimenten nur der Galvano-Scanner verwendet (sowohl für die Mikrobestrahlung als auch für die anschließende Bildgebung).
Vorteile und Grenzen der Mikrobestrahlung
Die Mikrobestrahlung bietet zwar eine konkurrenzlose räumliche und zeitliche Auflösung, ist aber nicht ohne Einschränkungen. DNA-Schäden durch Laser-Mikrobestrahlung sind im Vergleich zu natürlich vorkommenden schädlichen Wirkstoffen stark auf bestimmte Teile des Kerns konzentriert. Daher kann sich die Chromatinreaktion aufgrund von Mikrobestrahlung von homogen verteilten Schäden unterscheiden. Darüber hinaus ist die Mikrobestrahlung zeitaufwendig und kann nur an einigen Dutzend Zellen durchgeführt werden, während große populationsbasierte biochemische Methoden (Chromatinfraktionierung, Immunpräzipitation, ChIP) eine erhöhte Robustheit bieten können, indem Tausende von Zellen gleichzeitig untersucht werden. Die Überprüfung von Beobachtungen durch Mikrobestrahlung mit traditionellen biochemischen Techniken ist eine effektive Strategie für zuverlässige Schlussfolgerungen. Obwohl die gleichzeitige Mikrobestrahlung vieler Zellen in einem bestimmten Sichtfeld möglich ist, benötigt das Bildgebungssystem mehr Zeit, um die Aufgabe auszuführen. Daher begrenzt die Messung der Dynamik von Proteinen, die sich sehr schnell zu DNA-Läsionen rekrutieren, die Anzahl der möglichen ROIs für die Mikrobestrahlung, die gleichzeitig verwendet werden. Auf dem für dieses Protokoll verwendeten Bildgebungssystem dauert die Mikrobestrahlung eines einzelnen 1024 Pixel langen ROI 1032 ms mit 1000 μs Verweilzeit und 3088 ms mit 3000 μs Verweilzeit. Die Verwendung mehrerer RoIs-Linien erhöht die Zeit, die für die Mikrobestrahlung benötigt wird, erheblich (z. B. dauert der ROI von 7 x 1024 Pixeln 14402 ms bei 1000 μs Verweilzeit und 21598 ms bei 3000 μs Verweilzeit). Diese Zeit geht durch die Bildaufnahme verloren und muss berücksichtigt werden. Verwenden Sie bei der Abbildung von schnellen Rekrutierungsereignissen den kürzest möglichen ROI und bestrahlen Sie nur eine Zelle gleichzeitig mit Mikrobestrahlung.
Vorteile und Einschränkungen gegenüber Synchronisationsmethoden
Für zellzyklusspezifische Studien beinhalten die bestehenden Methoden entweder die Synchronisation von Zellen in bestimmte Zellzyklusphasen oder die Verwendung von fluoreszierenden Reportern, um die spezifische Zellzyklusphase der Zelle zu identifizieren. Jede dieser Methoden bietet jedoch ihre eigenen Herausforderungen und Grenzen.
Das FUCCI-System3 (basierend auf fluoreszierenden Protein-markierten verkürzten Formen von CDT1 und Geminin) ist ein besonders nützliches Werkzeug für Zellzyklusstudien, hat aber Einschränkungen, wenn es darum geht, zwischen S- und G2-Phasen des Zellzyklus zu unterscheiden. Die Gemininspiegel sind bereits ab der mittleren S-Phase hoch und bleiben bis zur M-Phase hoch, was es schwierig macht, diese Phasen zu trennen. Die Verwendung des FUCCI-Systems bedeutet auch, dass zwei optische Kanäle des Mikroskops nicht für die Abbildung des POI verwendet werden können.
Nicht-Krebszelllinien könnten durch die Entfernung von Wachstumsfaktoren im Serum (Serummangel) in G0 synchronisiert werden, was zu geringen oder keinen DNA-Schäden an den Zellen führt. Die meisten Krebszelllinien werden jedoch teilweise auch ohne ausreichende Mengen an Serum in ihren Medien durch den Zellzyklus fortschreiten. Darüber hinaus beginnen Zellen teilweise die Synchronisation durch die späte G1-, frühe S-Phase zu verlieren. Neben dem Serummangel gibt es zahlreiche chemische Methoden, um eine Zellzyklussynchronisation zu erreichen. Hydroxyharnstoff-, Aphidicolin- und Thymidinblöcke sind Methoden, um die DNA-Replikation zu stoppen, um Zellen in die frühe S-Phase zu synchronisieren. Während diese Methoden billig und einfach sind, führen sie zu Replikationsstress, der zu DNA-Schäden führt. Es wurde gezeigt, dass diese DNA-Replikationsinhibitoren die Phosphorylierung von H2A induzieren. X, ein bekannter Marker von DSBs2,29. Die Methode, Tagged-PCNA als Marker für S-Phasen-Zellen zu verwenden, reduziert das Potenzial für Artefakte, die durch chemische Synchronisation verursacht werden, und kann im Vergleich zum Serummangel auf eine Vielzahl von Zelllinien angewendet werden.
Schlussfolgerung
DNA-Schäden sind eine treibende Kraft für genetische Erkrankungen, bei denen mutagene Läsionen zur bösartigen Transformation von Zellen führen können. Das Targeting der DNA-Synthesemaschinerie ist eine grundlegende therapeutische Strategie bei der Behandlung von hyperproliferativen Erkrankungen wie Krebs. Um diese Krankheiten gezielter behandeln zu können, brauchen wir ein besseres Verständnis der Proteine, die DNA-Läsionen reparieren. Das hier beschriebene Protokoll hilft mikrobestrahlungsbasierten Studien in der S-Phase, indem es die Herausforderungen herkömmlicher Synchronisationsmethoden minimiert, um mögliche Artefakte zu reduzieren und die Reproduzierbarkeit der Experimente zu erhöhen.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken M. Pagano für seine kontinuierliche Unterstützung sowie D. Simoneschi, A. Marzio und G. Tang für ihre kritische Durchsicht des Manuskripts. B. Miwatani-Minter dankt R. Miwatani und B. Minter für ihre anhaltende Unterstützung. G. Rona dankt K. Ronane Jurasz und G. Rona für ihre anhaltende Unterstützung.
Materials
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434-500G | For quenching formaldehyde |
| Anti-EXO1 Rabbit Polyclonal Antibody | Proteintech | 16253-1-AP | primary antibody |
| Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301 | Millipore | 05-636 | primary antibody |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | 3117332001 | BSA for blocking |
| BrdU (5-Bromo-2'-deoxyuridine) | Merck | 19-160 | pre-sensitizing agent |
| Citifluor™ Mountant Solution AFR3 | Electron Microscopy Sciences | 17973-10 | antifade containing PBS solution for imaging |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | nucleic acid stain |
| DMEM Medium | Thermo Fisher Scientific | 10569010 | Cell culture medium for HEK293T cells |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Vehichle control and dissolution solvent |
| EGFP-FBXL10 | Addgene | #126542 | viral expression vector for EGFP-FBXL10 |
| EXO1b-AcGFP (in pRetroQ) | custom cloning | na | EXO1b cDNA was cloned in the NheI, BamHI sites of pRetroQ-AcGFP1-N1 vector. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140071 | Media supplement |
| FluoroBrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1896701 | Phenol red free medium for microscopy |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher Scientific | A32723 | secondary antibody |
| HEK293T cells | ATCC | ATCC CRL-3216 | Cell line for viral packaging |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | Buffering agent to supplement live cell imaging medium |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | pre-sensitizing agent |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | Transfection reagent |
| McCoy’s 5A (Modified) Medium | Life Technologies | 16600-108 | Cell culture medium for U-2 OS cells |
| mCherry-PCNA | Addgene | #55117 | non-viral PCNA construct suitable for cell cycle marker |
| mPlum-PCNA | Addgene | #55994 | non-viral PCNA construct suitable for cell cycle marker |
| mPlum-PCNA (in pBABE) | custom cloning | na | mPlum-PCNA cDNA was cloned from Addgene #55994 in the BamHI, SalI sites of pBABE (puro) |
| Nikon A1R-HD25 Confocal Scanhead and Controller | Nikon | na | confocal imaging system |
| Nikon LUN4 laser unit | Nikon | na | excitation system |
| Nikon LUN-F 50 mW 405 nm FRAP laser unit | Nikon | na | FRAP laser unit |
| Nikon NIS Elements Confocal Controller Software | Nikon | na | Confocal controlling software |
| Nikon Ti2-E Inverted Microscope | Nikon | na | inverted epifluorescent microscope base |
| Nikon Ti2-LAPP Modular Illumination System | Nikon | na | illumination system |
| NTHL1-mCherry (in pRetroQ) | custom cloning | na | NTHL1 cDNA was cloned in the NheI, SalI sites of pRetroQ-mCherry-N1 vector. |
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass (4 well) | Thermo Fisher Scientific | 155382PK | Live cell microscopy cell culture chamber |
| Olaparib | Selleck Chemicals | S1060 | PARP inhibitor |
| Opti-MEM reduced serum media | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | Dilution medium for transient transfection |
| Paraformaldehyde aqueous solution (32%) | Thermo Fisher Scientific | 50-980-494 | Fixative |
| pBABE (hygro) | Addgene | #1765 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
| pBABE (neo) | Addgene | #1767 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
| pBABE (puro) | Addgene | #1764 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
| pBABE (zeo) | Addgene | #1766 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
| PCNA Antibody (PC10) | Santa Cruz | sc-56 | primary antibody |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Gibco | 10378016 | Media supplement |
| polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003 | Increase viral infection efficiency |
| pRetroQ-AcGFP-C1 | Takara | 632506 | retroviral expression vector |
| pRetroQ-AcGFP-N1 | Takara | 632505 | retroviral expression vector |
| pRetroQ-mCherry-C1 | Takara | 632567 | retroviral expression vector |
| pRetroQ-mCherry-N1 | Takara | 632568 | retroviral expression vector |
| pUMVC | Addgene | #8449 | Viral packaging vector |
| Sodium-pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | Supplement for live cell imaging medium |
| Triton X-100 aqueous solution (10%) | Sigma-Aldrich | 11332481001 | Dilute in PBS for cell permeabilization buffer |
| Trypsin-EDTA Solution 10X | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | Dilute in PBS to split cells |
| U-2 OS Cells | ATCC | HTB-96 | Optimal cell line for microscopy experiments |
| Universal Mycoplasma Detection Kit | ATCC | 30-1012K | PCR based Mycoplasma detection kit |
| VSV-G | Addgene | #8454 | Viral protein envelope vector |
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