הקרנת מיקרו לייזר לחקר גיוס DNA במהלך שלב S
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה לא פולשנית לזיהוי יעיל של תאי S-phase למחקרי מיקרוסקופיה במורד הזרם, כגון מדידת גיוס חלבונים לתיקון דנ”א באמצעות הקרנת מיקרו-קרינה בלייזר.
Abstract
תיקון נזקי DNA שומר על השלמות הגנטית של תאים בסביבה תגובתית מאוד. תאים עשויים לצבור סוגים שונים של נזק DNA בשל מקורות אנדוגניים ואקסוגניים כגון פעילויות מטבוליות או קרינת UV. ללא תיקון DNA, הקוד הגנטי של התא הופך לפגום, מערער את המבנים והפונקציות של חלבונים ועלול לגרום למחלות.
הבנת הדינמיקה spatiotemporal של מסלולי תיקון DNA שונים בשלבי מחזור תאים שונים היא חיונית בתחום של תיקון נזק DNA. טכניקות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות נוכחיות מספקות כלים נהדרים למדידת קינטיקה של גיוס חלבונים שונים לאחר אינדוקציה נזק DNA. סינתזת DNA במהלך שלב S של מחזור התא היא נקודה מוזרה בגורל התא לגבי תיקון DNA. הוא מספק חלון ייחודי כדי לסנן את הגנום כולו לטעויות. יחד עם זאת, שגיאות סינתזת DNA גם להוות איום על שלמות ה- DNA כי הוא לא נתקל בתאים שאינם מתחלקים. לכן, תהליכי תיקון DNA שונים באופן משמעותי בשלב S בהשוואה לשלבים אחרים של מחזור התא, והבדלים אלה מובנים היטב.
הפרוטוקול הבא מתאר את הכנת קווי התא ואת מדידת הדינמיקה של חלבוני תיקון DNA בשלב S באתרי נזק לדנ”א הנגרמים באופן מקומי, באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר המצויד בקו לייזר של 405 ננומטר. PCNA מתויג (עם mPlum) משמש כסמן מחזור תא בשילוב עם חלבון תיקון תווית AcGFP של עניין (כלומר, EXO1b) כדי למדוד את גיוס נזקי ה- DNA בשלב S.
Introduction
מספר מסלולי תיקון DNA התפתחו כדי לטפל בסוגים שונים של נגעי DNA שיכולים להתעורר בתאים, שכולם מוסדרים מאוד הן במרחב והן בזמן. אחת התקופות הפגיעות ביותר של מחזור התא היא שלב S, כאשר מתרחשת סינתזת DNA. בעוד שהתפשטות היא בסיסית לחיים, היא גם מספקת אתגר גדול. תאים צריכים להבטיח שכפול נאמן של הגנום שלהם כדי למנוע מוטציות שיועברו לדורות הבאים. כתוצאה מכך, ההתפשטות מספקת נקודת התערבות טיפולית שהופעלה לפיתוח גישות טיפוליות בתחום האונקולוגיה.
לכל הטכניקות העיקריות המשמשות לחקר גיוס חלבונים נגעי DNA יש את נקודות החוזק והמגבלות שלהם. מיקרו-הקרנה יש רזולוציה מרחבית וטמפורלית טובה יותר1 מאשר רוב השיטות החלופיות כמו הדמיה חיסונית של מוקדים מייננת הנגרמת על ידי קרינה (IRIF), כרומטין-אימונופרציפיטציה (ChIP), או פירוק ביוכימי. עם זאת, מיקרו-הקרנה משתליבה את החוסן של הטכניקות הנ”ל שיכולות לדגום מספר גדול של תאים בו זמנית.
כדי לחקור תיקון DNA בשלב S, יש להיות מסוגל להבחין בין תאי פאזה S באוכלוסיית תרבית תאים אסינכרונית. קיימות שיטות ידועות רבות לטיפול בכך, הכוללות סינכרון תאים או הדמיה של שלבי מחזור התא השונים. עם זאת, שתי הגישות מציגות אתגרים משמעותיים וחפצים אפשריים. שיטות סנכרון כימיות בשימוש נרחב כדי להעשיר תאים בשלב S מוקדם (למשל, בלוק תימידין כפול, aphidicolin, וטיפול hydroxyurea) להשיג סנכרון באמצעות אינדוקציה של מתח שכפול ובסופו של דבר נזק DNA עצמו. זה מגביל את השימוש בשיטות אלה כדי ללמוד תהליכי תיקון DNA בשלבS 2. סנכרון באמצעות רעב בסרום ושחרור חל רק על מספר מוגבל של קווי תאים, בעיקר למעט קווי תאים סרטניים המסתמכים פחות על גורמי גדילה להתקדמות מחזור התא בהשוואה לקווי תאים שאינם שעברו שינוי. מערכת מחוון מחזור תא אוביקוויטין פלואורסצנטין (FUCCI) היא כלי שימושי במיוחד לחקר מחזור התא, אך יש לה מגבלה בסיסית בעת הבחנה בין S ו- G2 שלבים מחזור התא3.
כאן הוא מוצג כי באמצעות PCNA מתויג פלואורסצנטית כסמן לא פולשני עבור שלב S מגביל את החסרונות של שיטות סינכרון מחזור תאים כימיים, תוך מתן אפשרות יותר ספציפיות וגמישות מאשר מערכת FUCCI. כסמן יחיד, לא רק PCNA יכול להדגיש תאי S-פאזה באוכלוסייה אסינכרונית, אבל זה יכול גם להראות את ההתקדמות המדויקת של תאים בתוך שלב S (כלומר, מוקדם, באמצע, או מאוחר S-שלב)4. רמות ביטוי נמוכות של PCNA אקסוגני, מתויג מבטיח הפרעה מינימלית הן התקדמות מחזור התא ותהליכי תיקון DNA. חשוב לציין, PCNA משמש גם כבקרה פנימית עבור אינדוקציה נזק DNA תקין כפי שהוא מעורב בתיקון של כמה נגעים DNA והוא מגויס לאתרי נזק DNA המושרההמקומית 1,4.
הניסויים המוצגים כאן מדגימים כיצד למדוד את דינמיקת הגיוס של EXO1b בשלב S וכיצד זה מושפע ממעכב PARP מבוסס היטב, olaparib. פעילות נוקלאז EXO1b רלוונטית למגוון רחב של מסלולי תיקון DNA כולל תיקון אי התאמה (MMR), תיקון כריתת נוקלאוטיד (NER) ותיקון הפסקה כפולה (DSB). בשלב S, EXO1b ממלא תפקיד מרכזי רקומבינציה הומולוגית (HR) באמצעות היווצרות של 3 ‘ ssDNA overhangs במהלך כריתת DNA5. EXO1b כבר מעורב עוד יותר בשכפול DNA עם תפקידים בהפעלת נקודת ביקורת כדי להפעיל מחדש מזלגות DNA תקוע, כמו גם הסרת פריימר והבשלת שבר Okazaki בגדיל הפיגור במהלך עקירת גדיל בשכפול5. גיוס EXO1b לאתרי DNA פגומים מוסדר על ידי האינטראקציה הישירה עם פולי (ADP-ריבוז) (PAR)6,7. בשל ההשלכות הספציפיות הרבות של מחזור התא של EXO1b, זוהי בחירה מצוינת עבור מחקרי גיוס ספציפיים S-phase באמצעות PCNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלבים קריטיים ופתרון בעיות/שינויים פוטנציאליים בפרוטוקול
כלי תרבית רקמות נכון עבור הקרנה מיקרו הוא קריטי להצלחה. רוב מערכות ההדמיה ברזולוציה גבוהה מותאמות לעובי זכוכית כיסוי של 0.17 מ”מ. שימוש בתאי הדמיה בעובי גבוה או נמוך יותר או בתאים העשויים מפולימרים מפלסטיק (שאינם מותאמים להדמיה של 405 ננומטר), יכולים להפחית באופן משמעותי את איכות התמונה. בעת שימוש במשטחי זכוכית, ודא כי הם תרבית רקמות מטופלים כדי לשפר את הידבקות התא. אם הם אינם מטופלים בתרבית הרקמות, יהיה צורך לצפות תאים אלה, למשל, בפולי-די-ליסין לפני זריעת התאים. כאשר ציפוי תאים לתוך שעון כיסוי התא, צפיפות התא האידיאלית היא בעלת חשיבות עליונה כדי למנוע אי סדרים במחזור התא ומתח נוסף לתאים. שיווי משקל תרמי נכון של רכיבי המיקרוסקופ לפני הניסויים כדי לשמור על טמפרטורה יציבה חיוני הן לשמירה על המיקוד לאורך כל הזמן הדמיה לשגות והוא גם הכרחי כדי להבטיח DDR הומוגני לאורך זמן ודגימות.
זה קריטי כי תאים נמצאים במצב בריא לפני מיקרו הקרנה כדי להפחית נתונים חפצניים. אם לתאים יש מורפולוגיה לא סדירה לאחר זיהום/בחירה, אפשר לתאים להתקדם במעברים מרובים עד שהמורפולוגיה תחזור לשגרה. ודא תמיד כי קווי התאים המשמשים נקיים מזיהום mycoplasma. בין ההשפעות השליליות הרבות של זיהום mycoplasma, זה גם גורם נזק DNA לתאים המארחים יכול להשפיע על מסלולי DDR שלהם14,15. הדרך הרגישה ביותר לזהות mycoplasma בתרבות התא היא באמצעות PCR (לעומת זיהוי עם DAPI או Hoechst).
ביטוי יתר אופטימלי של חלבון התיקון של עניין צריך להיות דומה לרמות אנדוגני, עם זאת, גבוה מספיק לגילוי. המקדם המשמש על הווקטורים הנגיפיים, טיטר ויראלי במהלך זיהום, ואת אורך זמן ההדבקה ניתן להתאים את כל לרמות הביטוי האידיאליות. לקבלת תוצאות עקביות, בודד שיבוטים של תאים בודדים כדי להבטיח רמות ביטוי הומוגניות ומורפולוגיה רגילה של תאים. מומלץ להשתמש במבנים וקטוריים שאינם מגזמים ב- PCNA מתויג ברמות אנדוגניות גבוהות יותר עבור מחזור תאים תקין ותפקוד סמן תיקון DNA. אפילו רמות נמוכות של ביטוי יתר של PCNA מספיקות כדי להפלות תאים של פאזה S. וקטורים רטרו-ויראליים pBABE שימשו בהצלחה למטרה זו (Addgene #1764, #1765, #1766, #1767). PCNA ניתן לתייג עם כל אדום מונומרי(למשל, mPlum, mCherry, mRuby, וכו ‘) או חלבונים פלואורסצנטיים ירוקים מונומריים (למשל, mEGFP, AcGFP, mWasabi, mNeonGreen, mEmerald, וכו ‘) אשר לאחר מכן ניתן לשלב עם POI מתויג לסירוגין. להבעשת יתר של POI מתויג פלואורסצנטי יש כמה מגבלות ושיקולים. תגי פלורסנט עלולים לשבש את תפקוד החלבון הרגיל ואת לוקליזציה. לכן, יש לקחת בחשבון את מיקום התג (N או C-terminal). השתמש תמיד בחלבונים פלואורסצנטיים מונומריים, כמו אוליגומריזציה של וריאנטים שאינם מונומריים יכול להשפיע על הפונקציה של POI.
יש לקבוע את הגדרות הלייזר עבור כל מערכת הדמיה, שכן רכיבים רבים של הנתיב האופטי ישפיעו על הכוח הממשי המועבר לתאים. הקרנה מיקרו-הקרנה לייזר יכול לגרום מספר סוגים של נגעים DNA בהתאם אורך גל העירור, תפוקת הכוח של לייזר FRAP ואם כל סוכנים רגישים מראש (כמו ברומודוקסיורידין או Hoechst) שימשו. לייזרים 405 ננומטר יכול לגרום נזק DNA חמצוני, שברים בודדים וכפולתקועים 16,17. באמצעות הגדרות פלט לייזר גבוהות יותר, כמות ה- DSBs גדלה. בפרוטוקול זה שיטות טרום רגישות לא נוצלו, אך טכניקות אלה מכוסות מאוד בספרות ומכוסות מחדש בדיון שלהלן. לדעתנו, הדרך הטובה ביותר לבדוק אם הנגע הרצוי נוצר היא על ידי בדיקה לגיוס של גנים ספציפיים למסלול נזקי DNA ידועים. גיוס של NTHL1 או OGG1, רכיבים של מסלול BER, מציע את האינדוקציה של בסיסי DNA מחומצן10,11,17,18,19, בעוד FBXL10 או XRCC5 מצביעים על נוכחות של DSBs8,20,21. גיוס של XRCC1 יכול להצביע הן על נוכחות של בסיסי DNA מחומצנים והן הפסקות בודדות תקועות (SSB)22,23. XPC (כלומר, RAD4) הוא אינדיקטור טוב של NER המסיר את תוספות ה- DNA המגושמים הנוצרות על ידי אור אולטרה סגול (UV)17,24. מכיוון שגיוס חלבונים אקסוגניים עלול לגרום לאי סדרים מסוימים, כתמים אימונופלואורסצנטיים של חלבונים או סמנים לתיקון דנ”א אנדוגני (כמו γH2A.X להפסקות כפולות) יכולים לאשר את נוכחותם של נגעים ספציפיים ב- DNA. לחלופין, נוגדנים שהועלו נגד סוגים מסוימים של נגעי DNA יכולים לשמש גם. כדי לכוונן את כוח הלייזר המועבר, ניתן לשנות הן את זמן ההשתהות והן את כוח הלייזר.
בעזרת מודלים מתמטיים, ניתן לבצע ניתוח קינטי מפורט שיכול לספק תובנות חשובות על תכונות הגיוס של POI (למשל, תרומה של תחומים כריכי DNA מרובים, רגישות לאירועי איתות שונים וכו ‘). ניתן לשלב הערכת גיוס אוטומטית ומעקב אחר תאים כדי ליצור זרימות עבודה חזקות 1,25.
יתרונות ומגבלות של רגישות מוקדמת DNA
רגישות מוקדמת של DNA לפני מיקרו-הקרנה הוא כלי נפוץ לתיקון DNAגיוס חלבון 16,17. רגישות DNA לפני מיקרו הקרנה משאירה אותו רגיש יותר DSBs. שתי השיטות הנפוצות ביותר עבור DNA טרום רגישות הם טרום טיפול בתאים עם ברומודוקסיורידין (BrdU) או צבע Hoechst. עבור מערכות שאינן מסוגלות מיקרו-הקרנה בכוחות לייזר גבוהים, שיטות אלה עשויות להיות נחוצות לזירוז נגעי DNA כמו DSBs. בנוסף, בהיעדר גלאי אור מועבר או אות פלואורסצנטי המדגיש את גרעין התא (לדוגמה, כאשר לומדים את הגיוס של חלבוני תיקון DNA אנדוגני לא מתויג), Hoechst פועל הן ככלי רגיש מראש וכתם גרעיני פלואורסצנטי. עם זאת, DNA מראש רגישות יכול להציג סיבוכים משמעותיים. BrdU (בשימוש בריכוז סופי של 10 מיקרומטר) יש להוסיף לתאים 24 שעות (או זמן שווה ערך למחזור תא מלא בקו התא המשמש) כדי לשלב כראוי ב- DNA ויכול לגרום להפרעות מחזור התא26. Hoechst 33342 (בשימוש בריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / מ”ל) הוא ציטוטוקסי לאחר תקופות דגירה ארוכות, אך דורש מספיק זמן כדי להרוות את הגרעין עם הצבע. לכן, זה צריך להיות מיושם רק 15-20 דקות לפני מיקרו הקרנה; אחרת, נתוני הגיוס לא יהיו עקביים. התאים מוכתמים בדרך זו לא ניתן לשמור בתרבות במשך יותר מכמה שעות27,28. הקפד לא להשתמש Hoechst 33358, אשר אינו חדיר תא כמו צבע Hoechst 33342. רגישות מוקדמת יכולה גם להכניס שונות מיותרת בין ניסויים והופכת את הניסוי לרגיש עוד יותר להבדלים בצפיפות התאים (שכן זה ישפיע על כמות הצבע / התא המשולב).
יתרונות ומגבלות של מיקרוסקופיה קונפוקלית
מהירות ההדמיה של מיקרוסקופיה קונפוקלית יכולה להיות מוגבלת בהשוואה למיקרוסקופיה רחבת שדה. עם זאת, מיקרוסקופ קונפוקל המצויד בסורק מהדהד יכול לשפר מאוד את מהירות ההדמיה (במחיר הרזולוציה) מתקרב למהירויות של מיקרוסקופיה של דיסק מסתובב. שלוש תכונות הופכות את מערכת הקונפוקלית A1R HD25 לבחירה מצוינת עבור הפרוטוקול המוצג כאן. ראשית, FOV 25 מ”מ של המערכת מאפשר תמונה בין 15-20 תאים בשדה סרוק יחיד (לעומת 5-10 תאים בכיוונונים רגילים), הגבלת מספר הרכישות הדרושות כדי לקבל מספיק תאים לניתוח סטטיסטי. שנית, מודול FRAP ושני ראשי סריקה מאפשרים לדמיין ולהקרין את התאים בו זמנית, לא רק ברצף. לבסוף, הגמישות שיש הן סורקי מהדהד והן סורק galvano מספק את היכולת לעבור בקלות בין הדמיה ברזולוציה גבוהה-זמנית עם מהירות יוצאת דופן אשר ממזערת מרווה של פלואורופורים, הדמיה ברזולוציה מרחבית גבוהה המשתמשת במהירויות סריקה איטיות יותר כדי לייצר תמונות עם יחס אות לרעש גבוה יותר. בעוד שהמערכת המשומשת אפשרה את הגמישות הנ”ל, להידמות לתצורות מיקרוסקופ קונפוקליות זמינות יותר, רק סורק גלוונו שימש בניסויים שהוצגו (הן עבור מיקרו-הקרנה והן עבור הדמיה עוקבת).
יתרונות ומגבלות של הקרנה מיקרו
בעוד מיקרו-הקרנה מספקת רזולוציה מרחבית וטמפורלית ללא תחרות, זה לא ללא מגבלות. נזק לדנ”א על ידי הקרנת מיקרו לייזר מקובצים מאוד לחלקים מסוימים של הגרעין בהשוואה לסוכנים מזיקים טבעיים. לכן, תגובת הכרומטין עקב הקרנה מיקרו עשוי להיות שונה לעומת נזק מופץ הומוגני. בנוסף, מיקרו-הקרנה גוזלת זמן ויכולה להתבצע רק על כמה עשרות תאים, בעוד ששיטות ביוכימיות גדולות המבוססות על אוכלוסייה (שבר כרומטין, אימונופרציפיטציה, ChIP) יכולות לספק חוסן מוגבר על ידי לימוד אלפי תאים בכל פעם. אימות תצפיות שנעשו על ידי הקרנה מיקרו עם טכניקות ביוכימיות מסורתיות היא אסטרטגיה יעילה למסקנות אמינות. למרות הקרנה מיקרו בו זמנית של תאים רבים ב- FOV מסוים אפשרי, מערכת ההדמיה תצטרך יותר זמן כדי לבצע את המשימה. לכן, מדידת הדינמיקה של חלבונים המגייסים במהירות רבה נגעי DNA מגבילה את מספר ROIs אפשרי עבור מיקרו הקרנה בשימוש בו זמנית. במערכת ההדמיה המשמשת לפרוטוקול זה, הקרנה זעירה של ROI יחיד באורך 1024 פיקסלים אורכת 1032 אלפיות שניה תוך שימוש בזמן השתהות של 1000 מיקרו ו- 3088 אלפיות שניים באמצעות זמן השתהות של 3000 מיקרו μs כדי להשלים. שימוש בקווים מרובים של ROIs יגדיל באופן משמעותי את הזמן הדרוש כדי לסיים הקרנה מיקרו (למשל, 7 x 1024 פיקסלים ארוך ROI לוקח 14402 אלפיות שני באמצעות 1000 μs זמן השתהות ו 21598 אלפיות שני באמצעות זמן השתהות 3000 מיקרו). הפעם הוא אבד מרכישת תמונה ויש לקחת בחשבון. בעת הדמיה של אירועי גיוס מהירים, השתמש בהחזר ההבשלה הקצר ביותר האפשרי ורק מיקרו-הקרנה תא אחד בכל פעם.
יתרונות ומגבלות על-פני שיטות סינכרון
עבור מחקרים ספציפיים למחזור התא, השיטות הקיימות כוללות סינכרון של תאים לשלבי מחזור תאים ספציפיים או באמצעות כתבים פלואורסצנטיים כדי לזהות את שלב מחזור התא הספציפי של התא. עם זאת, כל אחת משיטות אלה מספקת אתגרים ומגבלות משלה.
מערכת FUCCI3 (הסתמכות על חלבון פלואורסצנטי מתויג צורות חתוכים של CDT1 ו Geminin) הוא כלי שימושי במיוחד עבור מחקרי מחזור התא אבל יש מגבלות כשמדובר להבדיל בין S ו- G2 שלבים של מחזור התא. רמות Geminin כבר גבוהות משלב S באמצע ולהישאר גבוה עד שלב M, מה שהופך שלבים אלה קשה להפריד. שימוש במערכת FUCCI פירושו גם כי שני ערוצים אופטיים של המיקרוסקופ לא ניתן להשתמש עבור הדמיה POI.
קווי תאים שאינם סרטניים יכולים להיות מסונכרנים לתוך G0 על ידי הסרת גורמי גדילה שנמצאו בסרום (רעב בסרום) הגורמים נזק DNA קטן או ללא נזק לתאים. עם זאת, רוב קווי התא הסרטני ימשיכו להתקדם חלקית במחזור התאים גם ללא כמויות נאותות של סרום במדיה שלהם. בנוסף, תאים מתחילים חלקית לאבד סינכרון על ידי סוף G1, שלב S מוקדם. בנוסף לרעב בסרום, ישנן שיטות כימיות רבות להשגת סנכרון מחזור התא. הידרוקסיאוריה, אפידיקולין, ותימידין בלוקים הם שיטות לעצור שכפול DNA כדי לסנכרן תאים לשלב S מוקדם. בעוד שיטות אלה הן זולות ופשוטות, הם מציגים מתח שכפול אשר גורם נזק DNA. מעכבי שכפול DNA אלה הוכחו לגרום זרחן של H2A. X, סמן ידוע של DSBs2,29. שיטת השימוש ב- PCNA מתויג כסמן לתאי S-phase מפחיתה את הפוטנציאל לחפצים הנגרמים על ידי סנכרון כימי וניתן להחיל אותה על מגוון רחב של קווי תאים בהשוואה לרעב בסרום.
מסקנה
נזק לדנ”א הוא כוח מניע למחלות גנטיות שבהן נגעים מוטגניים יכולים להוביל לשינוי ממאיר של תאים. מיקוד מכונות סינתזת DNA היא אסטרטגיה טיפולית בסיסית בטיפול במחלות היפרפרוliferative כמו סרטן. על מנת לטפל במחלות אלה בצורה ממוקדת יותר, אנו זקוקים להבנה טובה יותר של החלבונים המתקנים נגעי DNA. הפרוטוקול המתואר כאן מסייע למחקרים מבוססי הקרנה זעירה בשלב S על ידי מזעור האתגרים המוצגים בשיטות סנכרון מסורתיות כדי להפחית חפצים אפשריים ולהגדיל את יכולת הרבייה של הניסויים.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים למ. פגאנו על תמיכתו המתמשכת, כמו גם לד’ סימונצ’י, א. מרציו וג’י טאנג על הביקורת הביקורתית שלהם על כתב היד. ב. מיוואטני-מינטר מודה לר’ מיוואטני וב. מינטר על תמיכתם המתמשכת. ג. רונה מודה ל-ק. רונאן ג’ורה וג’ רונה על תמיכתם המתמשכת.
Materials
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434-500G | For quenching formaldehyde |
| Anti-EXO1 Rabbit Polyclonal Antibody | Proteintech | 16253-1-AP | primary antibody |
| Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301 | Millipore | 05-636 | primary antibody |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | 3117332001 | BSA for blocking |
| BrdU (5-Bromo-2'-deoxyuridine) | Merck | 19-160 | pre-sensitizing agent |
| Citifluor™ Mountant Solution AFR3 | Electron Microscopy Sciences | 17973-10 | antifade containing PBS solution for imaging |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | nucleic acid stain |
| DMEM Medium | Thermo Fisher Scientific | 10569010 | Cell culture medium for HEK293T cells |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Vehichle control and dissolution solvent |
| EGFP-FBXL10 | Addgene | #126542 | viral expression vector for EGFP-FBXL10 |
| EXO1b-AcGFP (in pRetroQ) | custom cloning | na | EXO1b cDNA was cloned in the NheI, BamHI sites of pRetroQ-AcGFP1-N1 vector. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140071 | Media supplement |
| FluoroBrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1896701 | Phenol red free medium for microscopy |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher Scientific | A32723 | secondary antibody |
| HEK293T cells | ATCC | ATCC CRL-3216 | Cell line for viral packaging |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | Buffering agent to supplement live cell imaging medium |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | pre-sensitizing agent |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | Transfection reagent |
| McCoy’s 5A (Modified) Medium | Life Technologies | 16600-108 | Cell culture medium for U-2 OS cells |
| mCherry-PCNA | Addgene | #55117 | non-viral PCNA construct suitable for cell cycle marker |
| mPlum-PCNA | Addgene | #55994 | non-viral PCNA construct suitable for cell cycle marker |
| mPlum-PCNA (in pBABE) | custom cloning | na | mPlum-PCNA cDNA was cloned from Addgene #55994 in the BamHI, SalI sites of pBABE (puro) |
| Nikon A1R-HD25 Confocal Scanhead and Controller | Nikon | na | confocal imaging system |
| Nikon LUN4 laser unit | Nikon | na | excitation system |
| Nikon LUN-F 50 mW 405 nm FRAP laser unit | Nikon | na | FRAP laser unit |
| Nikon NIS Elements Confocal Controller Software | Nikon | na | Confocal controlling software |
| Nikon Ti2-E Inverted Microscope | Nikon | na | inverted epifluorescent microscope base |
| Nikon Ti2-LAPP Modular Illumination System | Nikon | na | illumination system |
| NTHL1-mCherry (in pRetroQ) | custom cloning | na | NTHL1 cDNA was cloned in the NheI, SalI sites of pRetroQ-mCherry-N1 vector. |
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass (4 well) | Thermo Fisher Scientific | 155382PK | Live cell microscopy cell culture chamber |
| Olaparib | Selleck Chemicals | S1060 | PARP inhibitor |
| Opti-MEM reduced serum media | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | Dilution medium for transient transfection |
| Paraformaldehyde aqueous solution (32%) | Thermo Fisher Scientific | 50-980-494 | Fixative |
| pBABE (hygro) | Addgene | #1765 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
| pBABE (neo) | Addgene | #1767 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
| pBABE (puro) | Addgene | #1764 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
| pBABE (zeo) | Addgene | #1766 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
| PCNA Antibody (PC10) | Santa Cruz | sc-56 | primary antibody |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Gibco | 10378016 | Media supplement |
| polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003 | Increase viral infection efficiency |
| pRetroQ-AcGFP-C1 | Takara | 632506 | retroviral expression vector |
| pRetroQ-AcGFP-N1 | Takara | 632505 | retroviral expression vector |
| pRetroQ-mCherry-C1 | Takara | 632567 | retroviral expression vector |
| pRetroQ-mCherry-N1 | Takara | 632568 | retroviral expression vector |
| pUMVC | Addgene | #8449 | Viral packaging vector |
| Sodium-pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | Supplement for live cell imaging medium |
| Triton X-100 aqueous solution (10%) | Sigma-Aldrich | 11332481001 | Dilute in PBS for cell permeabilization buffer |
| Trypsin-EDTA Solution 10X | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | Dilute in PBS to split cells |
| U-2 OS Cells | ATCC | HTB-96 | Optimal cell line for microscopy experiments |
| Universal Mycoplasma Detection Kit | ATCC | 30-1012K | PCR based Mycoplasma detection kit |
| VSV-G | Addgene | #8454 | Viral protein envelope vector |
Referências
- Aleksandrov, R., et al. Protein dynamics in complex DNA lesions. Molecular Cell. 69 (6), 1046-1061 (2018).
- Darzynkiewicz, Z., Halicka, H. D., Zhao, H., Podhorecka, M. Cell synchronization by inhibitors of DNA replication induces replication stress and DNA damage response: Analysis by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 761, 85-96 (2011).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Herce, H. D., Rajan, M., Lattig-Tunnemann, G., Fillies, M., Cardoso, M. C. A novel cell permeable DNA replication and repair marker. Nucleus. 5 (6), 590-600 (2014).
- Keijzers, G., et al. Human exonuclease 1 (EXO1) regulatory functions in dna replication with putative roles in cancer. International Journal of Molecular Sciences. 20 (1), (2018).
- Cheruiyot, A., et al. Poly(ADP-ribose)-binding promotes Exo1 damage recruitment and suppresses its nuclease activities. DNA Repair (Amsterdam). 35, 106-115 (2015).
- Zhang, F., Shi, J., Chen, S. H., Bian, C., Yu, X. The PIN domain of EXO1 recognizes poly(ADP-ribose) in DNA damage response. Nucleic Acids Research. 43 (22), 10782-10794 (2015).
- Rona, G., et al. PARP1-dependent recruitment of the FBXL10-RNF68-RNF2 ubiquitin ligase to sites of DNA damage controls H2A.Z loading. elife. 7, (2018).
- Young, L. M., et al. TIMELESS forms a complex with PARP1 distinct from its complex with TIPIN and plays a role in the dna damage response. Cell Reports. 13 (3), 451-459 (2015).
- Kong, X., et al. Laser microirradiation to study in vivo cellular responses to simple and complex dna damage. Journal of Visualized Experiments. (131), e56213 (2018).
- Kong, X., et al. Condensin I recruitment to base damage-enriched DNA lesions is modulated by PARP1. PLoS One. 6 (8), 23548 (2011).
- Lan, L., et al. Novel method for site-specific induction of oxidative DNA damage reveals differences in recruitment of repair proteins to heterochromatin and euchromatin. Nucleic Acids Research. 42 (4), 2330-2345 (2014).
- Zerjatke, T., et al. Quantitative cell cycle analysis based on an endogenous all-in-one reporter for cell tracking and classification. Cell Reports. 19 (9), 1953-1966 (2017).
- Ji, Y., Karbaschi, M., Cooke, M. S. Mycoplasma infection of cultured cells induces oxidative stress and attenuates cellular base excision repair activity. Mutation Research. 845, 403054 (2019).
- Sun, G., et al. Mycoplasma pneumoniae infection induces reactive oxygen species and DNA damage in A549 human lung carcinoma cells. Infection and Immunity. 76 (10), 4405-4413 (2008).
- Gassman, N. R., Wilson, S. H. Micro-irradiation tools to visualize base excision repair and single-strand break repair. DNA Repair (Amsterdam). 31, 52-63 (2015).
- Muster, B., Rapp, A., Cardoso, M. C. Systematic analysis of DNA damage induction and DNA repair pathway activation by continuous wave visible light laser micro-irradiation. AIMS Genetics. 4 (1), 47-68 (2017).
- Ikeda, S., et al. Purification and characterization of human NTH1, a homolog of Escherichia coli endonuclease III. Direct identification of Lys-212 as the active nucleophilic residue. Journal of Biological Chemistry. 273 (34), 21585-21593 (1998).
- Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 94 (14), 7429-7434 (1997).
- Reid, D. A., et al. Organization and dynamics of the nonhomologous end-joining machinery during DNA double-strand break repair. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (20), 2575-2584 (2015).
- Taccioli, G. E., et al. Ku80: product of the XRCC5 gene and its role in DNA repair and V(D)J recombination. Science. 265 (5177), 1442-1445 (1994).
- Marsin, S., et al. Role of XRCC1 in the coordination and stimulation of oxidative DNA damage repair initiated by the DNA glycosylase hOGG1. Journal of Biological Chemistry. 278 (45), 44068-44074 (2003).
- Thompson, L. H., Brookman, K. W., Jones, N. J., Allen, S. A., Carrano, A. V. Molecular cloning of the human XRCC1 gene, which corrects defective DNA strand break repair and sister chromatid exchange. Molecular and Cell Biology. 10 (12), 6160-6171 (1990).
- Scharer, O. D. Nucleotide excision repair in eukaryotes. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 5 (10), 012609 (2013).
- Oeck, S., et al. High-throughput evaluation of protein migration and localization after laser micro-irradiation. Science Reports. 9 (1), 3148 (2019).
- Mistrik, M., et al. Cells and stripes: A novel quantitative photo-manipulation technique. Science Reports. 6, 19567 (2016).
- Durand, R. E., Olive, P. L. Cytotoxicity, mutagenicity and dna damage by hoechst 33342. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 30 (2), 111-116 (1982).
- Tobey, R. A., Oishi, N., Crissman, H. A. Cell cycle synchronization: reversible induction of G2 synchrony in cultured rodent and human diploid fibroblasts. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 87 (13), 5104-5108 (1990).
- Podhorecka, M., Skladanowski, A., Bozko, P. H2AX phosphorylation: Its role in DNA damage response and cancer therapy. Journal of Nucleic Acids. 2010, (2010).
