Undersökning av fagocytos av Leishmania med konfokalmikroskopi
Summary
Mekanismen associerad med fagocytos vid Leishmania-infektion är fortfarande dåligt förstådd. Här beskriver vi metoder för att utvärdera de tidiga händelser som inträffar under Leishmania-interaktion med värdcellerna.
Abstract
Fagocytos är en orkestrerad process som involverar distinkta steg: erkännande, bindning och internalisering. Professionella fagocyter tar upp Leishmania-parasiter genom fagocytos, bestående av att känna igen ligander på parasitytor av flera värdcellreceptorer. Bindning av Leishmania till makrofagmembran sker genom komplementreceptortyp 1 (CR1) och komplementreceptortyp 3 (CR3) och mönsterigenkänningsreceptorer. Lipophosphoglycan (LPG) och 63 kDa glykoprotein (gp63) är de viktigaste liganderna som är involverade i makrofag-Leishmania-interaktioner . Efter det första erkännandet av parasitligander av värdcellreceptorer blir parasiter internaliserade, överlever och multipliceras inom parasitofora vakuoler. Mognadsprocessen av Leishmania-inducerade vakuoler involverar förvärv av molekyler från intracellulära vesiklar, inklusive monomert G-protein Rab 5 och Rab 7, lysosomalt associerat membranprotein 1 (LAMP-1), lysosomalt associerat membranprotein 2 (LAMP-2) och mikrotubuliassocierat protein 1A/1B-ljuskedja 3 (LC3).
Här beskriver vi metoder för att utvärdera de tidiga händelser som inträffar under Leishmania-interaktion med värdcellerna med hjälp av konfokalmikroskopi, inklusive (i) bindning (ii) internalisering och (iii) fagosommognad. Genom att lägga till kunskapen kring dessa determinanter för infektionsresultat hoppas vi kunna förbättra förståelsen för patogenesen av Leishmania-infektion och stödja den eventuella sökningen efter nya kemoterapeutiska mål.
Introduction
Leishmaniasis är en försummad tropisk sjukdom orsakad av protozoa parasiter av släktet Leishmania, vilket resulterar i ett brett spektrum av kliniska manifestationer hos ryggradsdjurens värd, inklusive kutan leishmaniasis, mukokutan leishmaniasis och visceral leishmaniasis1. Världshälsoorganisationen (WHO) uppskattar att över en miljard människor är i riskzonen, med mer än en miljon nya fall rapporterade per år2.
är obligatoriska intracellulära protozoer som överlever inuti värdceller, inklusive monocyter, makrofager och dendritiska celler3. Leishmania-makrofaginteraktion är en komplex process som involverar flera värdcellreceptorer och parasitligander antingen genom direkt interaktion eller genom opsonisering som involverar komplementreceptorer 4,5. Klassiska ytreceptorer, såsom CR1, CR3, mannos-fukos, fibronektin, tollliknande och scavengerreceptorer, förmedlar parasitbindning till makrofager 6,7,8. Dessa receptorer känner igen molekyler på ytan av Leishmania, inklusive 63 kDa glykoprotein (gp63) och glykolipid lipophosphoglycan (LPG)9. Dessa är de vanligaste molekylerna på ytan av promastigotes och spelar en viktig roll i subversionen av värdimmunsvaret, vilket gynnar upprättandet av parasitinfektion i däggdjursceller10. Efter parasitytans ligander binder till makrofagreceptorer ackumuleras F-aktin på däggdjurscellytor, omgivande parasiter när de fagocytoseras. Därefter leder detta till bildandet av ett parasitinducerat fack som kallas parasitoforisk vakuol (PV), som presenterar fagolysosomala egenskaper11. En gång inuti dessa fagolysosomer genomgår parasiter flera förändringar som är väsentliga för överlevnad och multiplikation3.
Biogenesen av PVs är en starkt reglerad membranhandelsprocess som är kritisk för den intracellulära överlevnaden av denna patogen12. Bildandet av detta fack är resultatet av sekventiella fusionshändelser mellan fagosomer och fack i värdens endocytiska väg. Klassiska cellbiologiska studier har visat att mognad av PVs involverar förvärv av monomera G-protein Rab 5 och Rab 7-proteiner, som huvudsakligen är förknippade med tidig respektive sen endosommognad13. Dessutom förvärvar dessa fack lysosomassocierade membranproteiner 1 och 2 (LAMP 1, LAMP 2), de viktigaste proteinbeståndsdelarna i det lysosomala membranet och mikrotubuliassocierat protein 1A/1B-ljuskedja 3 (LC3), en autofagosommarkör14. Trots uppenbara likheter varierar kinetiken för PV-bildning15,16 och morfologin hos dessa fack beroende på Leishmania-arter. Till exempel inducerar infektion orsakad av L. mexicana eller L. amazonensis bildandet av stora fack som innehåller ett stort antal parasiter17. Däremot bildar andra arter, såsom L. braziliensis och L. infantum, mindre vakuoler som normalt bara innehåller en eller två parasiter i varje vakuol18.
Trots denna kunskap kring interaktionen mellan värdcell och leishmania har de initiala händelserna som utlösts av kontakt mellan värdreceptorer och parasitligander inte helt klarlagts. Dessa händelser är kända för att vara determinanter för resultatet av parasitinfektion och är beroende av parasitarter, typen av värdcellreceptorer som rekryteras för att känna igen parasiter och aktiveringen av makrofagsignalvägar19,20. Därför är det viktigt att identifiera de molekyler som är involverade i biogenesen av Leishmania-inducerade PVs och bestämma vilken eller vilka roller dessa molekyler spelar för infektionsetablering och resultat. Här beskriver vi en metod för att övervaka tidiga händelser som inträffar under fagocytosen av Leishmania, inklusive bindning, internalisering, fagosombildning och mognad. Detta arbete kan hjälpa till att klargöra deltagandet av PLC, Akt, Rab5, Rab7 och LC3 i bildandet av PVs inducerade av olika Leishmania-arter. Viktigt är att detta protokoll kan användas för att undersöka deltagandet av andra proteiner som är involverade i PV-mognad. Framtida studier kommer att utöka kunskapen kring mekanismer som är involverade i leishmania-värdcellsinteraktion och bidra till utformningen av nya kemoterapeutiska strategier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Leishmania-makrofaginteraktion är en komplex process och involverar flera steg som kan påverka sjukdomsutveckling5. För att bättre förstå mekanismerna som är involverade i interaktionen mellan oopsoniserad leishmani och värdceller har vi beskrivit ett protokoll som använder konfokal fluorescensmikroskopi för att bedöma fagocytos från tidiga till sena stadier av Leishmania-infektion. Användningen av fluorescenstekniker som involverar två eller flera fluorofo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Gonçalo Moniz Institute, Fiocruz Bahia, Brasilien och avdelningen för mikroskopi för hjälp. Detta arbete stöddes av INOVA-FIOCRUZ nummer 79700287000, P.S.T.V. har ett bidrag för produktivitet i forskning från CNPq (305235/2019-2). Plasmider tillhandahölls vänligen av Mauricio Terebiznik, University of Toronto, CA. Författarna vill tacka Andris K. Walter för engelskspråkig revision och hjälp med redigering av manuskript.
Materials
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | Tem varios no site | |
| anti-LC3 antibody | Novus Biologicals | NB600-1384 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | X | |
| CellStripper | Corning | 25-056-CI | |
| CellTracker Red (CMTPX) Dye | Thermo Fisher Scientific | C34552 | |
| Centrífuga | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ciprofloxacin | Isofarma | X | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Confocal fluorescence microscope (Leica SP8) | Leica | Leica SP8 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | |
| Fluorescence microscope (Olympus Lx73) | Olympus | Olympus Lx73 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750045 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethane-sulfonic acid) | Gibco | X | |
| Histopaque | Sigma | 10771 | |
| M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
| Nucleofector solution | Lonza | VPA-1007 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Phorbol myristate acetate (PMA) | Sigma | P1585 | |
| Phosphate buffer solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade kit | Life Technologies | P36931 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco | 11875-093 | |
| Saponin | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Schneider's Insect medium | Sigma | S0146 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Triton X-100 | Sigma | X |
Referências
- Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A. Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. Infectious Disease Clinics of North America. 26 (2), 293-307 (2012).
- World Health Organization. Control of the leishmaniases. World Health Organization Technical Report Series. (949), 1 (2010).
- Alexander, J., Russell, D. G. The interaction of Leishmania species with macrophages. Advances in Parasitology. 31, 175-254 (1992).
- Mosser, D. M., Rosenthal, L. A. Leishmania-macrophage interactions: multiple receptors, multiple ligands and diverse cellular responses. Seminars in Cell Biology. 4 (5), 315-322 (1993).
- Awasthi, A., Mathur, R. K., Saha, B. Immune response to Leishmania infection. Indian Journal of Medical Research. 119 (6), 238-258 (2004).
- Blackwell, J. M. Role of macrophage complement and lectin-like receptors in binding Leishmania parasites to host macrophages. Immunology Letters. 11 (3-4), 227-232 (1985).
- Mosser, D. M., Edelson, P. J. The mouse macrophage receptor for C3bi (CR3) is a major mechanism in the phagocytosis of Leishmania promastigotes. Journal of Immunology. 135 (4), 2785-2789 (1985).
- Gough, P. J., Gordon, S. The role of scavenger receptors in the innate immune system. Microbes and Infection. 2 (3), 305-311 (2000).
- Russell, D. G., Wilhelm, H. The involvement of the major surface glycoprotein (gp63) of Leishmania promastigotes in attachment to macrophages. Journal of Immunology. 136 (7), 2613-2620 (1986).
- Handman, E., Goding, J. W. The Leishmania receptor for macrophages is a lipid-containing glycoconjugate. EMBO J. 4 (2), 329-336 (1985).
- Holm, A., Tejle, K., Magnusson, K. E., Descoteaux, A., Rasmusson, B. Leishmania donovani lipophosphoglycan causes periphagosomal actin accumulation: correlation with impaired translocation of PKCalpha and defective phagosome maturation. Cellular Microbiology. 3 (7), 439-447 (2001).
- Vergne, I., et al. Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (11), 4033-4038 (2005).
- Courret, N., Lang, T., Milon, G., Antoine, J. C. Intradermal inoculations of low doses of Leishmania major and Leishmania amazonensis metacyclic promastigotes induce different immunoparasitic processes and status of protection in BALB/c mice. International Journal for Parasitology. 33 (12), 1373-1383 (2003).
- Gutierrez, M. G., et al. Autophagy induction favours the generation and maturation of the Coxiella-replicative vacuoles. Cellular Microbiology. 7 (7), 981-993 (2005).
- Dermine, J. F., Scianimanico, S., Prive, C., Descoteaux, A., Desjardins, M. Leishmania promastigotes require lipophosphoglycan to actively modulate the fusion properties of phagosomes at an early step of phagocytosis. Cellular Microbiology. 2 (2), 115-126 (2000).
- Desjardins, M., Descoteaux, A. Inhibition of phagolysosomal biogenesis by the Leishmania lipophosphoglycan. Journal of Experimental Medicine. 185 (12), 2061-2068 (1997).
- Antoine, J. C., Prina, E., Lang, T., Courret, N. The biogenesis and properties of the parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine macrophages. Trends in Microbiology. 6 (10), 392-401 (1998).
- Alexander, J., et al. An essential role for IL-13 in maintaining a non-healing response following Leishmania mexicana infection. European Journal of Immunology. 32 (10), 2923-2933 (2002).
- Aderem, A., Underhill, D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annual Review of Immunology. 17, 593-623 (1999).
- Olivier, M., Gregory, D. J., Forget, G. Subversion mechanisms by which Leishmania parasites can escape the host immune response: a signaling point of view. Clinical Microbiology Reviews. 18 (2), 293-305 (2005).
- English, D., Andersen, B. R. Single-step separation of red blood cells. Granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradients of Ficoll-Hypaque. Journal of Immunology Methods. 5 (3), 249-252 (1974).
- Petersen, A. L., et al. 17-AAG kills intracellular Leishmania amazonensis while reducing inflammatory responses in infected macrophages. PLoS One. 7 (11), 49496 (2012).
- Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).
- Berges, R., et al. End-binding 1 protein overexpression correlates with glioblastoma progression and sensitizes to Vinca-alkaloids in vitro and in vivo. Oncotarget. 5 (24), 12769-12787 (2014).
- Franco, L. H., et al. The Ubiquitin Ligase Smurf1 Functions in Selective Autophagy of Mycobacterium tuberculosis and Anti-tuberculous Host Defense. Cell Host & Microbe. 22 (3), 421-423 (2017).
- Corbett-Nelson, E. F., Mason, D., Marshall, J. G., Collette, Y., Grinstein, S. Signaling-dependent immobilization of acylated proteins in the inner monolayer of the plasma membrane. Journal of Cell Biology. 174 (2), 255-265 (2006).
- Yeung, T., et al. Receptor activation alters inner surface potential during phagocytosis. Science. 313 (5785), 347-351 (2006).
- Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cellular Microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).
- Vieira, O. V., et al. Modulation of Rab5 and Rab7 recruitment to phagosomes by phosphatidylinositol 3-kinase. Molecular and Cellular Biology. 23 (7), 2501-2514 (2003).
- Roberts, R. L., Barbieri, M. A., Ullrich, J., Stahl, P. D. Dynamics of rab5 activation in endocytosis and phagocytosis. Journal of Leukocyte Biology. 68 (5), 627-632 (2000).
- Vitelli, R., et al. Role of the small GTPase Rab7 in the late endocytic pathway. Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4391-4397 (1997).
- Matte, C., et al. Leishmania major Promastigotes Evade LC3-Associated Phagocytosis through the Action of GP63. PLoS Pathogens. 12 (6), 1005690 (2016).
- Dias, B. R. S., et al. Autophagic Induction Greatly Enhances Leishmania major Intracellular Survival Compared to Leishmania amazonensis in CBA/j-Infected Macrophages. Frontiers in Microbiology. 9, 1890 (2018).
- Babcock, G. F. Quantitation of phagocytosis by confocal microscopy. Methods in Enzymology. 307, 319-328 (1999).
- Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 071795 (2014).
- Lennartz, M. R. Phospholipases and phagocytosis: the role of phospholipid-derived second messengers in phagocytosis. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 31 (3-4), 415-430 (1999).
- Rashidfarrokhi, A., Richina, V., Tafesse, F. G. Visualizing the Early Stages of Phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. (120), e54646 (2017).
- Ramarao, N., Meyer, T. F. Helicobacter pylori resists phagocytosis by macrophages: quantitative assessment by confocal microscopy and fluorescence-activated cell sorting. Infection and Immunity. 69 (4), 2604-2611 (2001).
- Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 131-139 (2015).
