Исследование фагоцитоза лейшмании с помощью конфокальной микроскопии
Summary
Механизм, связанный с фагоцитозом при инфекции Leishmania , остается плохо изученным. Здесь мы описываем методы оценки ранних событий, происходящих во время взаимодействия лейшмании с клетками-хозяевами.
Abstract
Фагоцитоз — это организованный процесс, который включает в себя различные этапы: распознавание, связывание и интернализацию. Профессиональные фагоциты поглощают паразитов Лейшмании путем фагоцитоза, состоящего из распознавания лигандов на поверхностях паразитов несколькими рецепторами клеток-хозяев. Связывание лейшмании с мембранами макрофагов происходит через рецептор комплемента типа 1 (CR1) и рецептор комплемента типа 3 (CR3) и рецепторы распознавания образов. Липофосфогликан (LPG) и гликопротеин 63 кДа (gp63) являются основными лигандами, участвующими во взаимодействиях макрофагов и лейшмании . После первоначального распознавания лигандов паразитов рецепторами клеток-хозяев паразиты интернализируются, выживают и размножаются в паразитофорных вакуолях. Процесс созревания вакуолей, индуцированных лейшманией, включает в себя приобретение молекул из внутриклеточных везикул, включая мономерный G-белок Rab 5 и Rab 7, лизосомально-ассоциированный мембранный белок 1 (LAMP-1), лизосомно-ассоциированный мембранный белок 2 (LAMP-2) и микротрубочко-ассоциированный белок 1A/1B-легкая цепь 3 (LC3).
Здесь мы описываем методы оценки ранних событий, происходящих во время взаимодействия лейшмании с клетками-хозяевами с использованием конфокальной микроскопии, включая (i) связывание,ii) интернализацию и (iii) созревание фагосом. Добавляя к совокупности знаний, окружающих эти детерминанты исхода инфекции, мы надеемся улучшить понимание патогенеза инфекции Leishmania и поддержать возможный поиск новых химиотерапевтических целей.
Introduction
Лейшманиоз является запущенным тропическим заболеванием, вызываемым простейшими паразитами рода Leishmania, приводящим к широкому спектру клинических проявлений у позвоночного хозяина, включая кожный лейшманиоз, слизисто-кожный лейшманиоз и висцеральный лейшманиоз1. По оценкам Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), более одного миллиарда человек находятся в группе риска, причем более одного миллиона новых случаев регистрируются в год2.
Leishmania spp. являются облигатными внутриклеточными простейшими, которые выживают внутри клеток-хозяев, включая моноциты, макрофаги и дендритные клетки3. Взаимодействие лейшмании и макрофагов представляет собой сложный процесс, который включает в себя несколько рецепторов клеток-хозяев и лигандов паразитов либо путем прямого взаимодействия, либо путем опсонизации с участием рецепторов комплемента 4,5. Классические поверхностные рецепторы, такие как CR1, CR3, манноза-фукоза, фибронектин, толл-подобные и поглотители рецепторов, опосредуют прикрепление паразитов к макрофагам 6,7,8. Эти рецепторы распознают молекулы на поверхности лейшмании, включая гликопротеин 63 кДа (gp63) и гликолипидный липофосфогликан (LPG)9. Это наиболее распространенные молекулы на поверхности промастиготов и играют важную роль в подрыве иммунного ответа хозяина, способствуя установлению паразитарной инфекции в клетках млекопитающих10. После того, как поверхностные лиганды паразитов связываются с рецепторами макрофагов, F-актин накапливается на клеточных поверхностях млекопитающих, окружающих паразитов по мере их фагоцитоза. Впоследствии это приводит к образованию паразитарно-индуцированного компартмента, называемого паразитофорной вакуолей (PV), который представляет фаголисосомальные признаки11. Попав внутрь этих фаголизосом, паразиты претерпевают несколько изменений, необходимых для выживания и размножения3.
Биогенез PV представляет собой высоко регулируемый процесс мембранного трафика, критически важный для внутриклеточной выживаемости этого патогена12. Образование этого компартмента происходит в результате последовательных слияний между фагосомами и компартментами эндоцитарного пути хозяина. Классические исследования клеточной биологии показали, что созревание PV включает в себя приобретение мономерного G-белка Rab 5 и rab 7 белков, которые в основном связаны с ранним и поздним созреванием эндосом соответственно13. Кроме того, эти компартменты приобретают лизосомно-ассоциированные мембранные белки 1 и 2 (LAMP 1, LAMP 2), основные белковые составляющие лизосомальной мембраны и микротрубочки-ассоциированный белок 1A/1B-световая цепь 3 (LC3), аутофагосомный маркер14. Несмотря на кажущееся сходство, кинетика PV-образования15,16 и морфология этих компартментов варьируются в зависимости от вида Leishmania. Например, инфекция, вызванная L. mexicana или L. amazonensis, вызывает образование крупных компартментов, содержащих большое количество паразитов17. Напротив, другие виды, такие как L. braziliensis и L. infantum, образуют более мелкие вакуоли, которые обычно содержат только одного или двух паразитов в каждой вакуоле18.
Несмотря на эти знания, связанные с взаимодействием клетки-хозяина и лейшмании, первоначальные события, вызванные контактом между рецепторами хозяина и лигандами паразитов, не были полностью выяснены. Эти события, как известно, являются детерминантами исхода заражения паразитами и зависят от видов паразитов, типа рецепторов клеток-хозяев, набираемых для распознавания паразитов, и активации сигнальных путей макрофагов19,20. Поэтому важно идентифицировать молекулы, участвующие в биогенезе Индуцированных Лейшманией ПВ, и определить роль (роли), которую играют эти молекулы в установлении инфекции и исходе. Здесь мы описываем метод мониторинга ранних событий, происходящих во время фагоцитоза лейшмании, включая связывание, интернализацию, образование и созревание фагосом. Эта работа может помочь прояснить участие PLC, Akt, Rab5, Rab7 и LC3 в формировании PV, индуцированных различными видами Leishmania. Важно отметить, что этот протокол может быть использован для исследования участия других белков, участвующих в pv-созревании. Будущие исследования расширят знания, связанные с механизмами, участвующими во взаимодействии клеток лейшмании и хозяина, и внесут вклад в разработку новых химиотерапевтических стратегий.
Protocol
Representative Results
Discussion
Взаимодействие лейшмании и макрофага является сложным процессом и включает в себя несколько этапов, которые могут влиять на развитие заболевания5. Чтобы лучше понять механизмы, участвующие во взаимодействии неопсонизированной лейшмании и клеток-хозяев, мы опис?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Институт Гонсалу Мониса, Фиокрус Баия, Бразилия и отдел микроскопии за помощь. Эта работа была поддержана INOVA-FIOCRUZ номером 79700287000, P.S.T.V. владеет грантом на продуктивность в исследованиях от CNPq (305235/2019-2). Плазмиды были любезно предоставлены Маурисио Теребизником, Университет Торонто, Калифорния. Авторы хотели бы поблагодарить Андриса К. Уолтера за редактирование на английском языке и помощь в редактировании рукописей.
Materials
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | Tem varios no site | |
| anti-LC3 antibody | Novus Biologicals | NB600-1384 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | X | |
| CellStripper | Corning | 25-056-CI | |
| CellTracker Red (CMTPX) Dye | Thermo Fisher Scientific | C34552 | |
| Centrífuga | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ciprofloxacin | Isofarma | X | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Confocal fluorescence microscope (Leica SP8) | Leica | Leica SP8 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | |
| Fluorescence microscope (Olympus Lx73) | Olympus | Olympus Lx73 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750045 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethane-sulfonic acid) | Gibco | X | |
| Histopaque | Sigma | 10771 | |
| M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
| Nucleofector solution | Lonza | VPA-1007 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Phorbol myristate acetate (PMA) | Sigma | P1585 | |
| Phosphate buffer solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade kit | Life Technologies | P36931 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco | 11875-093 | |
| Saponin | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Schneider's Insect medium | Sigma | S0146 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Triton X-100 | Sigma | X |
Referências
- Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A. Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. Infectious Disease Clinics of North America. 26 (2), 293-307 (2012).
- World Health Organization. Control of the leishmaniases. World Health Organization Technical Report Series. (949), 1 (2010).
- Alexander, J., Russell, D. G. The interaction of Leishmania species with macrophages. Advances in Parasitology. 31, 175-254 (1992).
- Mosser, D. M., Rosenthal, L. A. Leishmania-macrophage interactions: multiple receptors, multiple ligands and diverse cellular responses. Seminars in Cell Biology. 4 (5), 315-322 (1993).
- Awasthi, A., Mathur, R. K., Saha, B. Immune response to Leishmania infection. Indian Journal of Medical Research. 119 (6), 238-258 (2004).
- Blackwell, J. M. Role of macrophage complement and lectin-like receptors in binding Leishmania parasites to host macrophages. Immunology Letters. 11 (3-4), 227-232 (1985).
- Mosser, D. M., Edelson, P. J. The mouse macrophage receptor for C3bi (CR3) is a major mechanism in the phagocytosis of Leishmania promastigotes. Journal of Immunology. 135 (4), 2785-2789 (1985).
- Gough, P. J., Gordon, S. The role of scavenger receptors in the innate immune system. Microbes and Infection. 2 (3), 305-311 (2000).
- Russell, D. G., Wilhelm, H. The involvement of the major surface glycoprotein (gp63) of Leishmania promastigotes in attachment to macrophages. Journal of Immunology. 136 (7), 2613-2620 (1986).
- Handman, E., Goding, J. W. The Leishmania receptor for macrophages is a lipid-containing glycoconjugate. EMBO J. 4 (2), 329-336 (1985).
- Holm, A., Tejle, K., Magnusson, K. E., Descoteaux, A., Rasmusson, B. Leishmania donovani lipophosphoglycan causes periphagosomal actin accumulation: correlation with impaired translocation of PKCalpha and defective phagosome maturation. Cellular Microbiology. 3 (7), 439-447 (2001).
- Vergne, I., et al. Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (11), 4033-4038 (2005).
- Courret, N., Lang, T., Milon, G., Antoine, J. C. Intradermal inoculations of low doses of Leishmania major and Leishmania amazonensis metacyclic promastigotes induce different immunoparasitic processes and status of protection in BALB/c mice. International Journal for Parasitology. 33 (12), 1373-1383 (2003).
- Gutierrez, M. G., et al. Autophagy induction favours the generation and maturation of the Coxiella-replicative vacuoles. Cellular Microbiology. 7 (7), 981-993 (2005).
- Dermine, J. F., Scianimanico, S., Prive, C., Descoteaux, A., Desjardins, M. Leishmania promastigotes require lipophosphoglycan to actively modulate the fusion properties of phagosomes at an early step of phagocytosis. Cellular Microbiology. 2 (2), 115-126 (2000).
- Desjardins, M., Descoteaux, A. Inhibition of phagolysosomal biogenesis by the Leishmania lipophosphoglycan. Journal of Experimental Medicine. 185 (12), 2061-2068 (1997).
- Antoine, J. C., Prina, E., Lang, T., Courret, N. The biogenesis and properties of the parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine macrophages. Trends in Microbiology. 6 (10), 392-401 (1998).
- Alexander, J., et al. An essential role for IL-13 in maintaining a non-healing response following Leishmania mexicana infection. European Journal of Immunology. 32 (10), 2923-2933 (2002).
- Aderem, A., Underhill, D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annual Review of Immunology. 17, 593-623 (1999).
- Olivier, M., Gregory, D. J., Forget, G. Subversion mechanisms by which Leishmania parasites can escape the host immune response: a signaling point of view. Clinical Microbiology Reviews. 18 (2), 293-305 (2005).
- English, D., Andersen, B. R. Single-step separation of red blood cells. Granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradients of Ficoll-Hypaque. Journal of Immunology Methods. 5 (3), 249-252 (1974).
- Petersen, A. L., et al. 17-AAG kills intracellular Leishmania amazonensis while reducing inflammatory responses in infected macrophages. PLoS One. 7 (11), 49496 (2012).
- Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).
- Berges, R., et al. End-binding 1 protein overexpression correlates with glioblastoma progression and sensitizes to Vinca-alkaloids in vitro and in vivo. Oncotarget. 5 (24), 12769-12787 (2014).
- Franco, L. H., et al. The Ubiquitin Ligase Smurf1 Functions in Selective Autophagy of Mycobacterium tuberculosis and Anti-tuberculous Host Defense. Cell Host & Microbe. 22 (3), 421-423 (2017).
- Corbett-Nelson, E. F., Mason, D., Marshall, J. G., Collette, Y., Grinstein, S. Signaling-dependent immobilization of acylated proteins in the inner monolayer of the plasma membrane. Journal of Cell Biology. 174 (2), 255-265 (2006).
- Yeung, T., et al. Receptor activation alters inner surface potential during phagocytosis. Science. 313 (5785), 347-351 (2006).
- Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cellular Microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).
- Vieira, O. V., et al. Modulation of Rab5 and Rab7 recruitment to phagosomes by phosphatidylinositol 3-kinase. Molecular and Cellular Biology. 23 (7), 2501-2514 (2003).
- Roberts, R. L., Barbieri, M. A., Ullrich, J., Stahl, P. D. Dynamics of rab5 activation in endocytosis and phagocytosis. Journal of Leukocyte Biology. 68 (5), 627-632 (2000).
- Vitelli, R., et al. Role of the small GTPase Rab7 in the late endocytic pathway. Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4391-4397 (1997).
- Matte, C., et al. Leishmania major Promastigotes Evade LC3-Associated Phagocytosis through the Action of GP63. PLoS Pathogens. 12 (6), 1005690 (2016).
- Dias, B. R. S., et al. Autophagic Induction Greatly Enhances Leishmania major Intracellular Survival Compared to Leishmania amazonensis in CBA/j-Infected Macrophages. Frontiers in Microbiology. 9, 1890 (2018).
- Babcock, G. F. Quantitation of phagocytosis by confocal microscopy. Methods in Enzymology. 307, 319-328 (1999).
- Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 071795 (2014).
- Lennartz, M. R. Phospholipases and phagocytosis: the role of phospholipid-derived second messengers in phagocytosis. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 31 (3-4), 415-430 (1999).
- Rashidfarrokhi, A., Richina, V., Tafesse, F. G. Visualizing the Early Stages of Phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. (120), e54646 (2017).
- Ramarao, N., Meyer, T. F. Helicobacter pylori resists phagocytosis by macrophages: quantitative assessment by confocal microscopy and fluorescence-activated cell sorting. Infection and Immunity. 69 (4), 2604-2611 (2001).
- Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 131-139 (2015).
