Det här protokollet innehåller detaljerade steg för en objekt plats uppgift med fyra upprepningar med samma kohort av råttor. Svag och stark kodning kan ge kort- och långtidsminnen. Protokollets flexibilitet med upprepning kan vara fördelaktigt för studier som involverar kirurgiska operationer genom att spara tid och arbete.
Objekt plats erkännande är en framträdande metod som används för att undersöka rumsligt minne hos gnagare. Det här objektets igenkänningsminne ligger till grund för objektplatsaktiviteten. Detta dokument ger ett omfattande protokoll för att vägleda upprättandet av en objektplatsuppgift med möjlighet till upp till fyra repetitioner med samma kohort av råttor. Både svaga och starka kodningsprotokoll kan användas för att studera rumsliga minnen på kort och lång sikt av varierande styrka och för att möjliggöra implementering av relevanta minneshämmande eller -förbättrande manipuleringar. Dessutom tillåter upprepning av testet med den motvikt som presenteras här kombinationen av resultat från två eller flera tester för jämförelse inom försökspersoner för att minska variationen mellan råttor. Denna metod hjälper till att öka statistisk kraft och rekommenderas starkt, särskilt när du kör experiment som ger hög variation i individuellt beteende. Detta förfinar direkt studien genom att öka de data som erhålls från varje djur och minska det totala antalet djur som behövs. Slutligen ökar genomförandet av den upprepade objektlokaliseringsuppgiften effektiviteten i studier som involverar kirurgiska ingrepp genom att spara tid och arbete.
Spontana erkännande uppgifter(t.ex. objekt erkännande, objekt plats erkännande) har använts i stor utsträckning i undersökningen av minne hos gnagare. Dessa tester är till skillnad från de olika tester som används för att bedöma minne som baseras på antingen rädsla konditionering eller belöning motivation, genom att spontana erkännande uppgifter baseras enbart på spontana undersökande beteende mot nya stimuli. Detta beteende, som kallas “neotisk preferens”1, är inneboende hos gnagare såväl som hos andra däggdjursarter och vissa icke-däggdjursdjur som fåglar och fisk2. Objektplatsigenkänning, som beror på rumsligt minne, kan observeras med hjälp av objektplatsuppgiften (kallas även spatial objektigenkänningsuppgift)3. Lesion studier har visat att objekt plats erkännande kräver en intakt hippocampus4,5. På grund av det relativt enkla träningsprotokollet och frånvaron av någon förstärkning är denna uppgift att föredra i många studier. Frånvaron av både positiv och negativ förstärkning minimerar de ytterligare parametrar och hjärnregioner som kan driva beteendet. Därför är beteendet här neutralt och bygger på nyfikenhet och rumsligt minne, vilket möjliggör undersökning av mekanismer som är involverade i kodning, konsolidering och hämtning av det rumsliga minnet.
Protokollet för objektplatsuppgift består vanligtvis av tillvänjningssessioner följt av en enda session med kodnings- och testförsök, åtskilda av en fördröjningsperiod, som varierar från flera minuter till timmar. Det rekommenderas starkt att råttor hanteras i förväg för att minimera djurens stressnivå, och därmed beteende som kan påverka erkännandeminnet, såsom motvilja mot nyhet. På samma sätt spelar ett väl utformat habituation-protokoll en viktig roll för att förhindra stress som kan hindra råttans naturliga beteende under uppgiften. Omfattningen av hantering och tillvänjning varierar dock till stor del mellan laboratorier och experimenterare, vilket kan bidra till låg replicability6,7,8. I kodningsförsöket ges råttan tid att utforska en arena med två identiska föremål belägna i två utsedda hörn. I testförsöket, som försenas av en period, ges råttan tid att utforska arenan med samma par föremål, men den här gången har en av dem flyttats till en ny plats. Den spontana preferensen som råttorna uppvisar och den resulterande ökningen av tiden som spenderas på att utforska objektet på den nya platsen är vägledande för rumslig igenkänning och minnet av objektplatserna3. Ändring av kodningsstudien (varaktighet och antal upprepningar) påverkar minnets styrka.
Beroende på studiens syfte kan längden på förseningen mellan kodning och testförsök ändras för att modellera proteinsyntesoberoende korttidsminne eller proteinsyntesberoende långtidsminne. Därför kan objekt plats uppgiften användas för en mängd olika studier genom att anpassa protokollet efter behov. Vidare är implementering av experimentella manipuleringar, såsom farmakologiska och optogenetiska interventioner, också möjliga mellan dessa prövningar, liksom in vivo-avbildning. Det finns flera studier9,10 som rapporterar upprepade iterationer av objektplatsuppgiften inom samma råttkohort. Detta kontrasterar den traditionella användningen där ett djur har en session utan upprepningar. Dessa paradigms effektivitet har dock inte undersökts grundligt, och det finns inte heller några metoddokument som beskriver dessa. Så gott vi vet är detta den första rapporterade beskrivningen av ett protokoll som i detalj beskriver en objektplatsuppgift med upp till fyra repetitioner med samma råttkohort, som också systematiskt jämför resultaten från varje upprepning. Upprepningar kan användas för att balansera experimentella tillstånd för att möjliggöra jämförelse inom försökspersoner med minskad variabilitet mellan testerna. Den tillförlitliga upprepningen av uppgiften gör det möjligt att samla in data, vilket innebär att tillräckligt stor mängd data kan genereras med hjälp av ett relativt litet antal råttor. Slutligen kan upprepningar med samma råtta vara fördelaktiga i experiment som involverar kirurgiska operationer och implantationer genom att minska antalet råttor som krävs som följaktligen sparar tid och arbetskraftskostnader.
Denna studie presenterar ett omfattande protokoll som beskriver hur man utför en objektplatsuppgift hos vuxna råttor med hjälp av starka och svaga kodningsförsök följt av testförsök med 1-h och 24-h förseningar. Det starka kodningsprotokollet producerar statistiskt signifikant igenkänningsminne när det testas med 1-h och 24-h förseningar och kan därför användas för att studera både kortsiktiga och långsiktiga minnen vid implementering av manipuleringar för att hämma dessa minnen11. Däremot producerar det svaga kodningsprotokollet endast betydande korttidsminne när det testas med en 1-h-fördröjning. Frånvaron av långtidsminne kan användas för att studera manipuleringar för att förbättra kvarhållningen av minne11,12. Det här protokollet innehåller också detaljerade hanterings- och tillvänjningssessioner, som syftar till att öka replicerbarheten för objektplatsuppgiften. Detta dokument visar också upprepning av uppgiften i fyra distinkta sammanhang med samma kohort av råttor med hjälp av det svaga kodningsprotokollet, som bekräftas att producera reproducerbara och konsekventa resultat varje gång.
Objektplatsuppgiften kan användas i en mängd olika studier för att undersöka rumsligt minne enligt beskrivningen tidigare. Flexibiliteten i installationen möjliggör modellering av korttids- och långtidsminne av olika styrkor, och det kan enkelt implementeras till en låg kostnad. Men eftersom det finns många parametrar i protokollet som kan påverka resultaten, och olika studier varierar något i dessa parametrar6, kan man möta svårigheter att framgångsrikt genomföra uppgiften för första gången. Ovanstående protokoll är avsett att vägleda läsarna genom denna process smidigt. Ytterligare avgörande åtgärder som kan vara betydande för ett framgångsrikt genomförande av uppgiften med hög replicability kommer att diskuteras nedan.
Även om kodnings-/testsessionen ofta är i fokus när du kör objektplatsexperiment, har hanterings- och habituationprotokoll en djupgående effekt på resultatet av denna typ av beteendetester där resultatet beror på ostört naturligt råttbeteende14,15. Som sådan bör stegen före kodnings-/testsessionen utformas med försiktighet, eftersom de kan påverka råttas beteende och minne och följaktligen påverka slutresultatet. En bra nivå av hantering och tillvänjning så att råttor blir bekanta med experimenteraren och uppgiften kommer att minimera effekten av stressfaktorer samtidigt som sannolikheten för att uppvisa naturligt beteendeökar 8. Som nämnts i protokollet kan hanteringen börja så tidigt som avröjning av valpar om råttstammen bibehålls i hemanläggningen. Baserat på tidigare erfarenheter (data som inte visats) och från flera tidigare studier16,17, resulterar denna tidiga hantering i låg ångest och ökad nyfikenhet under månaderna som följer.
Eftersom objektplatsuppgiften enbart beror på råttornas inneboende undersökande drivkraft, kan förväntat beteende lätt hindras om råttor inte är ivriga att utforska eller ovilliga att närma sig nyhet, som kallas “neofobiskt beteende”1. Som sådan rekommenderas det starkt att inkludera ett grundligt hanterings- och habituationprotokoll enligt studiens specifika behov. Detta protokoll kan användas som en minimikravsguide, och ytterligare steg kan genomföras (t.ex.om studien ska inkludera injektioner i ett senare skede krävs tillvänjning till injektionsförfaranden och specifik hållposition). Stammen och åldern på de experimentella råttorna är två andra inflytelserika faktorer och bör övervägas innan man planerar ett experiment för att undvika suboptimala resultat. Olika råttstammar kan ha olika beteenden och baslinjeångestnivåer 18,19,20 och därför kan specifik justering av protokollet krävas beroende på den belastning som används.
Detta protokoll bekräftas fungera bra med Th-Cre transgena råttor med Long-Evans stam backcrossed fyra gånger till Lister Hooded stam och vild typ Lister Hooded råttor. En logiskt idealisk startålder för råttor i beteendeexperiment är cirka 12veckor 20, men variabilitet mellan stammar och de specifika kraven för uppgiften bör beaktas. Det kan också vara möjligt att använda utvecklande råttor om det är av intresse för studien, även om justeringar av protokollet kan krävas och inte omfattas här. Det är dock viktigt att överväga om råttan vid en viss ålder har utvecklat de kognitiva funktioner som krävs för att framgångsrikt utföra denna uppgift. En studie21 som undersöker detta har rapporterat att endast de tonåriga råttorna vid postnatal dag 38 och inte tidigare, visade allocentric rumsligt minne återspeglas i preferens för objekt på den nya platsen, som observerats hos vuxna råttor. Protokollet som presenteras här var framgångsrikt med råttor som var 15-16 veckor gamla i början av den första kodning / testsessionen. Tidigare producerade samma starka kodningsprotokoll suboptimala till negativa resultat när man använde 23 veckor gamla råttor som inte hade nått den optimala nivån av tillvänjning på grund av brist på hantering och tillvänjning i en ung ålder. Dessa råttor misslyckades antingen med att prestera annorlunda än chansnivå eller i själva verket uppvisade aversion mot nyhet som observerats i termer av preferens för de stabila objekten istället för de förskjutna objekten (data visas inte). Dessa resultat ger bevis för att åldern och tidpunkten för hanteringsvana kan ha en inverkan på effektiviteten av tillvänjning och som ett resultat bidra till observation av oroligt och neofobiskt beteende i testerna.
Här beskrivs två olika protokoll som säkerställer stark eller svag kodning i objekt plats aktiviteten. Under upprättandet av dessa protokoll observerades att intresset för föremålen minskade efter 5-10 minuters utforskning under enstaka långa prövningar(t.ex. 20 minuters kodning) och råttor slutade så småningom utforska. Detta resulterar i svagare minne av objektplatserna. Ett kodningsprotokoll som sammanflätar kodningsförsök med korta viloperioder(t.ex. 3 x 5 minuters kodning) övervinner detta och leder till hög utforskning under hela försöken. Således påverkar den aktiva utforskningstiden och den olika layouten för dessa två kodningsprotokoll minnets styrka, som är starkare efter 3 x 5 min kodning än efter 20-minuters kodningsprotokoll. Liknande resultat kan också uppnås med något olika varaktigheter med enstaka försök kontra interfolierade prövningsprotokoll, och justeringar kan göras för att passa studiens och råttstammens behov.
I motsats till protokoll som använder ett vanligt vitt öppet fält med endast externa ledtrådar i rummet, använder protokollet som presenteras här en arena med distinkta sammanhang och intra-maze-signaler som sannolikt kräver mer tid att lära sig. Därför rekommenderas tillägg av ett kontext tillvänjningssteg i protokollet före kodningsstudien. Detta gör det möjligt för råttor att bilda en rumslig karta över varje sammanhang under tillvänjning och minska varaktigheten för följande kodningsstudie, eftersom råttorna bara behöver koda objektens platser i förhållande till denna karta. Dessutom kommer kontextvana att göra det möjligt för råttor att vana vid alla möjliga distraktorer i varje sammanhang, till exempel 3D-rumsliga signaler, vilket minimerar beteenden annat än objektutforskning i kodnings-/testsessionen att följa. Med implementeringen av en grundlig motviktsmetodsom består av flera nivåer (dvs. ett brett utbud av objektplatskombinationer (räknare) och riktning på objektförskjutningen minimeras oönskade preferenser som kan stiga på grund av variationer i ljusintensitet och väggfärger /mönster i hörnen av arenan.
Flera faktorer bör beaktas när du upprepar uppgiften för att öka replicability mellan kodning / testsessioner och minimera påverkan av upprepning. För det första måste distinkta sammanhang (så många som antalet upprepningar av kodnings-/testsessioner) utformas för att undvika ackumulering av rumsligt minne som kan orsakas av att de upprepade sessionerna utförs med samma kontext. För att uppnå detta användes en apparat med utbytbara väggar av olika färger och mönster (Figur 1B, C). De distinkta väggarna och 3D-objekten (t.ex. leksaker eller små vardagliga föremål med distinkta färger och former, se protokoll och figur 1C)som hänger på väggarna är de rumsliga signaler och landmärken som råttorna potentiellt använder för att lära sig objektplatser i förhållande till sina sammanhang. Om ett test inte ger företräde för det flyttade objektet kan du överväga att ändra dessa parametrar för kontexten (väggdesign och rumsliga signaler). Alternativt kan en rektangulär eller cirkelformad arena användas för objektplatsuppgifter i stället för en fyrkantig arena som i detta protokoll. Cirkulära arenor rapporteras eliminerahörnpreferenser 22 som ofta observeras på arenor med hörn, och därför kan det vara fördelaktigt när man hanterar en särskilt hög ångest råtta eller musstam. Även om kraven på att skapa fyra distinkta sammanhang i detta protokoll fungerar optimalt med en kvadratisk form, kan en cirkulär arena också göras funktionell efter vissa justeringar.
För det andra bör intervallen mellan varje kodnings-/testsession fastställas så att råttorna behåller samma intressenivå varje gång, samtidigt som risken för kumulativt lärande som följer av ett tätt repetitionsschema undviks. Vanligtvis är ett intervall på minst dubbelt så lång tid som fördröjningstiden mellan kodning och testförsök tillräckligt, med längre intervaller som är mer gynnsamma för mer än två repetitioner. Detta innebär att även om minst 48-timmarsintervall efter ett 24-timmarstest är tillräckligt för en eller två repetitioner, rekommenderas med hjälp av ett 1-veckorsintervall för fyra repetitioner. Som resultaten i figur 5 och jämförelsen med ANOVA visar kan uppgiften upprepas fyra gånger. Baserat på detta kan det etablerade protokollet användas för att balansera upp till fyra experimentella tillstånd. Antalet experimentella grupper avgör antalet upprepningar av kodnings-/utvärderingssessioner i olika sammanhang. Resultaten i figur 5 representerar ett möjligt sätt att använda protokollet med två experimentella grupper. Grupperna balanserades upp i två sessioner och samma villkor upprepades i ytterligare två sessioner (för valideringsändamål). Den andra uppsättningen motviktssessioner kan också användas för att balansera nya villkor. På samma sätt kan tre eller fyra experimentella tillstånd jämföras med tre eller fyra motviktssessioner.
I dessa fall bör sammanhangen utformas så att de passar kontrasterande egenskaper som beskrivs i protokollet. Det är anmärkningsvärt att den motviktskonstruktionen kanske inte är lämplig för experiment där ytterligare manipuleringar, såsom ett farmakologiskt ingrepp som kan lämna en långvarig effekt eller skada, ska användas. För att bibehålla testernas effektivitet och replicability bör försöket utformas i enlighet därmed. Data från upprepade tester kan presenteras och analyseras på flera sätt, vilket visas i figur 5. För en första analys kan försöksgrupperna i varje sammanhang jämföras individuellt med slumpnivå med hjälp av ett urval t-test för att fastställa någon signifikant preferens(figur 5B,D). Detta kan vara till hjälp för att få en snabb förståelse för data, men det säkerställer bara en indirekt jämförelse av grupperna. Så för att jämföra två eller flera grupper bör data analyseras med två-prov t-tester (parat eller oparat) respektive ANOVA. Detta kan ske i form av jämförelse mellan grupperna mellan försökspersonerna inom en enda kodnings-/testsession(figur 4A och figur 5B,D)eller jämförelse inom ämnet av grupperna från två (eller flera) motviktssammanhang (figur 5C,E). Den senare metoden rekommenderas starkt, särskilt när man hanterar svaga minnesförhållanden, vilket, som förklarats tidigare, resulterar i hög varians på grund av slumpmässighet i beteendet.
Att kombinera de motbalanserade kontexterna leder till större grupper som krävs för att på ett tillförlitligt sätt visualisera gruppens beteende med minimal variation. Med hjälp av ett protokoll med upprepningar i motviktssessioner kan man förvänta sig en minskning av antalet råttor till cirka en tredjedel av det antal som skulle krävas med hjälp av ett enda test med samma statistiska effekt. Vanligtvis är provstorlekar i ett intervall av 7 till 15 råttor (totalt) för motviktssessioner och i ett intervall av 20 till 50 råttor (10 till 25 per grupp) för en enda session med en effektstorlek och effekt som båda är större än 0,8 tillräckliga. Minskningen av antalet djur som behövs och ökningen av den information vi får från varje djur som använder detta protokoll förfinar både studien och tjänar 3R-principerna om etisk användning av djur i forskning. Det är viktigt i detta steg att komma ihåg att slumpmässigt råttbeteende, som inte åtföljs av ett starkt minne, kan resultera i individuella starka preferenser både under och över chansen, men gruppgenomsnittet bör ge en preferens som inte skiljer sig väsentligt från slumpen. Enskilda uppgifter bör tolkas noggrant. Fördelningen av enskilda datapunkter inom en grupp kan också vara informativ för tolkning av resultat. Som ses i figur 4 och figur 5ändras fördelningen beroende på minnets styrka. Sammantaget kan protokollet som presenteras här enkelt följas för att implementera objektplatsuppgiften med upprepningar för att modellera kortvarig och/eller långsiktig rumsligt minne. Det enkla och flexibla utbildningsprotokollet och möjligheten att genomföra ytterligare manipuleringar gör denna uppgift till ett populärt val. Dessa ändringar av protokollet möjliggör undersökning av särskilda steg som minneshämtning, konsolidering och återkallande.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Antonios Asiminas, Dorothy Tse, Kiichi O’Hara och David Bett för insiktsfulla kommentarer och förslag. Denna studie stöddes av Erasmus+ (till G.B. och L.N.); Forskarskolan för hälsa, Århus universitet (till K.H.); Novo Nordisk Foundation Young Investigator Award 2017 (NNF17OC0026774), Lundbeckfonden (DANDRITE-R248-2016-2518) och PROMEMO – Center for Proteins in Memory, ett center för excellens finansierat av DNRF133 (till T.T.).
Open-field/experimental box | O'Hara & Co (Japan) | OF-3001 | Open-field box for the object location task |
Object 1: cones | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RR | |
Object 2: footballs | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RB | |
Object 3: rectangular blocks | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RC | Rectangular blocks were modified after purchase |
Object location task apparatus | O'Hara & Co (Japan) | SPP-4501 | Sound attenuating box that contains the open-field box for the object location task |
Tracking software | O'Hara & Co (Japan) | TimeSSI | For movement tracking and automated camera functions |
Wild-type Lister Hooded rats | Charles River | 603 |