Análisis del microambiente hepático durante la progresión temprana del carcinoma hepatocelular asociado a la enfermedad del hígado graso no alcohólico en pez cebra

Los estudios en animales se llevan a cabo siguiendo procedimientos aprobados por el comité institucional de cuidado y uso de animales (IACUC) de Albert Einstein College of Medicine. Para obtener recetas de tampones y soluciones utilizadas en el protocolo, consulte la Tabla suplementaria 1. 1. Preparación de una dieta enriquecida con colesterol al 10% para el excedente agudo de colesterol. Pese 2 x 4 g de Golden Pearl Diet 5-50 nm Active Spheres (GPAS) en dos vasos de vidrio de 25 ml, uno para la dieta normal (ND) y el otro para la dieta alta en colesterol al 10% (HCD).NOTA: Se puede utilizar cualquier dieta comercial de alimentos secos para larvas de pez cebra. Pesar 0,4 g de colesterol en un vaso de precipitados de vidrio de 10 ml. Cubra el vaso de precipitados con un poco de papel de aluminio. Mida 5 ml de éter dietílico con una jeringa de 10 ml con una aguja de 20 g. A continuación, agregue el éter dietílico al vaso de precipitados ND e inmediatamente mézclelo con el alimento seco con una espátula.PRECAUCIÓN: El éter dietílico causa irritación de los ojos, la piel y el tracto respiratorio. Usar solo en una campana extractora de humos químicos. Mida de nuevo 5 ml de éter dietílico con una jeringa de 10 ml con una aguja de 20 g y agréguelo al vaso de precipitados de 10 ml con colesterol, mezcle inmediatamente aspirando hacia arriba y hacia abajo con la jeringa. Agregue rápidamente la solución de colesterol al vaso de precipitados HCD e inmediatamente mézclela con una espátula hasta que la solución esté uniforme. Deje los vasos de precipitados en la capucha durante un máximo de 24 h para evaporar completamente el éter dietílico. Al día siguiente, muele las dietas GPAS en partículas finas usando un mortero.NOTA: Moler las dietas es un paso crucial, las larvas no podrán comer partículas mayores de 50 nm. Transfiera cada dieta a una pequeña bolsa de plástico etiquetada o a un tubo de centrífuga de 50 ml y guárdela a -20 °C. 2. Inducción de NASH con larvas a corto plazo alimentándose con dieta enriquecida con colesterol – condiciones estáticas. Establecer líneas de peces transgénicos el día -1 (Tabla 1). A la mañana siguiente (Día 0), después de que los peces hayan desovado, recolecte los huevos en un colador de malla. Usando una botella de lavado con agua embrionaria (E3), enjuague bien los huevos y transfiera cuidadosamente los huevos a placas de Petri de 10 cm con medio E3. Limpie las placas de todos los desechos que puedan haberse acumulado en las cajas de reproducción, incluidos los huevos muertos o no fertilizados.NOTA: Enjuagar los huevos y limpiar las placas es crucial para evitar el crecimiento incontrolado de microorganismos y los consiguientes defectos en el desarrollo de las larvas. Dividir los huevos en una densidad de 70/80 por placas de Petri de 10 cm (en 25 mL de E3). En el día 1, bajo un alcance de disección equipado con una base de transiluminación, verifique y limpie embriones muertos o embriones con defectos de desarrollo.NOTA: Utilice el modo de campo oscuro de base de transiluminación para identificar embriones con efectos de desarrollo y para verificar el crecimiento de microorganismos en las placas. Diferentes instalaciones tienen diferentes rendimientos de microorganismos en sus sistemas. Cambie el medio E3 y / o platos si es necesario, para evitar efectos negativos. En el día 5, combine las larvas de todos los platos en una placa de Petri de 15 cm, agregue E3 sin azul de metileno. A continuación, divida las larvas en las cajas de alimentación de la siguiente manera (Tabla 2).NOTA: En condiciones de control, para generar larvas sanas sin desencadenar inflamación crónica sistémica, las larvas deben ser alimentadas con alrededor de 0,1 mg de alimento por larva por día. Observe que la cantidad total de alimentos (Tabla 2) se divide en partes iguales en dos comidas por día. Mantener las larvas en una incubadora a 28 °C, en un ciclo de luz oscura (por ejemplo, 14 h de luz/10 h de oscuro), y alimentar a las larvas dos veces al día desde el día 5 hasta el día 12. Aspire diariamente cualquier residuo de alimentos, así como el 90-95% del medio utilizando un sistema de vacío conectado a una punta de pipeta de 1 ml. A continuación, vierta cuidadosamente el nuevo E3 sin azul de metileno en una esquina de la caja de alimentación para evitar dañar las larvas.NOTA: La limpieza diaria de las cajas de alimentación es crucial para evitar el crecimiento descontrolado de microorganismos. 3. Recolección de larvas de 13 días después de la fertilización de cajas de alimentación. En el día 13, prepare platos de recolección de acuerdo con la cantidad de condiciones experimentales que se establecieron. Con un rotulador permanente, haga una marca en el costado de los platos (tapa e inferior) para evitar cambiar las muestras, por ejemplo, una franja negra para la dieta normal (ND) y dos rayas negras para HCD. Vierta suficiente E3 sin azul de metileno para cubrir el fondo de cada plato. Usando cuidadosamente el sistema de vacío aspirar el agua de las cajas de alimentación, trate de aspirar cualquier residuo o larva muerta del fondo para evitar transferir estos materiales a los platos de recolección. Cuando el nivel del agua comience a bajar, levante lentamente la caja de alimentación para hacer que las larvas naden hacia una de las esquinas, luego aspire en la dirección opuesta.NOTA: Utilice una pipeta de 1 ml con puntas cortadas, a diferentes alturas, para permitir diferentes diámetros al aspirar el agua. Alterne entre los diferentes tamaños, comience con un diámetro más grande y cambie a uno más pequeño a medida que el volumen de agua se reduce y aumenta la densidad de larvas. Una vez que solo haya alrededor de 20-30 ml de líquido, decanta cuidadosamente las larvas en la placa de Petri de recolección preparada en el Paso 1. Coloque la cinta etiquetada de la caja de alimentación en la tapa del plato. Repita los pasos 3.2-3.4 para todas las cajas de alimentación. 4. Ensayo de control para esteatosis hepática inducida por la dieta: tinción, imágenes y puntuación de Oil Red O (ORO). Con una pipeta de vidrio Pasteur, transfiera 15-20 larvas a un tubo de fondo redondo de 2 ml y colóquelas en hielo durante unos 15-30 minutos. Retire la mayor parte del medio del tubo. Añadir 2 ml de 4% de paraformaldehído (PFA) para fijar las larvas e incubar a 4 °C durante la noche. A la mañana siguiente, retire la solución de PFA al 4% y lave las larvas tres veces con 2 ml de 1x PBS. Prepare una placa de 12 pocillos (Figura 2A) por condición con un inserto de pozo de malla. Usando una pipeta de vidrio, transfiera la larva del tubo de 2 ml al inserto previamente colocado en el pozo, agregue 5 ml de 1x PBS. Guarde los tubos de 2 ml para almacenar la muestra después de la tinción.PRECAUCIÓN: Las larvas son extremadamente pegajosas en esta etapa, no use pipetas de plástico. Transfiera el inserto con larvas a otro pocillo con 5 mL de solución de isopropanol al 60%. Incubar las larvas durante 30 min de temperatura ambiente (RT). Mientras tanto, prepare un 0.3% de aceite rojo O en una solución de isopropanol al 60%. Filtrar la solución de Oil Red al 0,3% dos veces con un filtro de jeringa de 0,45 μm.NOTA: Prepare 5 ml de solución por pocillo mezclando 3 ml de aceite rojo al 0,5% en isopropanol con 2 ml de agua destilada. La solución de 0,3% de aceite rojo O en isopropanol al 60% debe estar recién preparada. A continuación, transfiera el inserto de malla con larvas a otro pocillo con 5 ml de aceite rojo al 0,3% recién hecho en una solución de isopropanol al 60%. Larvas incubadas durante 3 h en RT con balanceo suave. Después de la tinción ORO, enjuague las larvas transfiriendo el inserto a otro pocillo con isopropanol al 60%. Lave las larvas dos veces en isopropanol al 60% durante 30 minutos cada vez transfiriendo el inserto secuencialmente a pocillos con isopropanol al 60%. Lave las larvas tres veces durante 5 min en 1x PBS-0.1% Tween transfiriendo el inserto secuencialmente a pocillos con 1x PBS-0.1% Tween. Transfiera las larvas a los tubos de 2 ml. Retire PBST, agregue 1 ml de glicerol al 80% y guárdelo a 4 °C hasta obtener imágenes. Para obtener mejores imágenes, transfiera las larvas a 1x PBS-0.1% Tween y bajo un alcance de disección diseccione los hígados tirando cuidadosamente de los tejidos usando dos pinzas # 55.NOTA: Si se utiliza una imagen de fondo Casper se puede realizar utilizando las larvas enteras. Usando una pipeta de vidrio, transfiera cuidadosamente los hígados a un pocillo de una placa puntual de porcelana con 50% de glicerol. Coloque los hígados usando una herramienta pequeña para manipular las larvas (p. ej., herramienta para pestañas- Figura 2B). Imágenes de hígados en un microscopio estereoscópico equipado con una cámara a color. Puntuación esteatosis hepática (sin tinción de ORO = ninguna; tinción de ORO de color rojo claro = leve; tinción de ORO rojo-rojo oscuro = moderada/grave). 5. Imágenes confocales no invasivas utilizando el dispositivo de herida y atrapamiento del pez cebra para el crecimiento y la imagen (zWEDGI). Prepare una placa de Petri de 10 cm con 15-20 ml de 1x Tricaine-E3, lo suficiente para cubrir el fondo.NOTA: Se puede obtener una solución de trabajo 1x Tricaine-E3 (0.16 mg/mL) diluyendo 2 mL de una solución madre de Tricaine 25x (4 mg/mL) en 48 mL de E3. La concentración de tricocaína no debe exceder 0.16 mg / ml ya que las larvas son extremadamente sensibles a la anestesia en esta etapa de desarrollo. Transfiera 15-20 larvas con una pipeta de plástico Pasteur a la placa de Petri que contiene 1x Tricaine-E3 y anestesie las larvas durante 5 min. Prepare una placa de 6 pocillos con 2-3 mL de E3 sin azul de metileno por pocillo. En un microscopio estereoscópico fluorescente, examinar las larvas anestesiadas para detectar los marcadores fluorescentes deseados (Tabla 1). Transfiera las larvas seleccionadas en la cantidad mínima de tricocaína en E3 y déjelas recuperarse en la placa de 6 pocillos hasta que sea el momento de obtener la imagen.NOTA: La detección de larvas transgénicas dobles, triples y cuádruples lleva tiempo, coloque las larvas en E3 y cambie los medios de la placa de 6 pocillos a menudo para disminuir la exposición innecesaria a Tricaine. Además, las larvas en esta etapa de desarrollo flotan, así que use una herramienta de pestañas para posicionar las larvas para la detección sin inducir daño tisular. Después del cribado, prepare una placa de Petri de 10 cm con 25 ml de 1x Tricaine-E3. Transfiera 15-20 larvas con una pipeta de plástico Pasteur a la placa de Petri que contiene 1x Tricaine-E3 y anestesiar las larvas durante 5 min. Mientras tanto, bajo el microscopio estereoscópico, agregue 1x tricocaína-E3 en las cámaras del dispositivo de herida y atrapamiento (por ejemplo, zWEDGI)15,16. Retire las burbujas de aire de las cámaras y del túnel de sujeción con una micropipeta P200. Retire todo el exceso de 1x Tricaine-E3 dejando solo el volumen suficiente para llenar las cámaras. Transfiera una larva anestesiada a la cámara de carga del zWEDGI y colóquela con una herramienta de pestañas debajo del microscopio estereoscópico. Suavemente, golpee la cabeza de las larvas y empújela para que la cola entre en el túnel de restricción. Además, usando la micropipeta elimine 1x Tricaine-E3 de la cámara de heridas para ayudar a la larva a entrar en el túnel. Asegúrese de que la larva esté colocada adecuadamente para obtener imágenes del lóbulo izquierdo – Microscopio invertido: lado izquierdo hacia abajo; Microscopio vertical: lado izquierdo hacia arriba.NOTA: Si un zWEDGI no está disponible, los peces se pueden montar y colocar en agarosa de bajo punto de fusión al 1% en 1x Tricaine-E3, sin embargo, la inmersión en agarosa se puede usar solo para obtener imágenes rápidas (hasta 15 min). Para el análisis de morfología de hepatocitos y nucleares, se obtienen imágenes de hígados con un microscopio confocal utilizando un objetivo de aire 40x y pilas z de secciones ópticas de 2 μm. Para la morfología hepática, la angiogénesis y los ensayos de reclutamiento de células inmunes, los hígados de imagen utilizan un objetivo de aire 20x y pilas z de secciones ópticas de 5 μm. Para las larvas con hígados grandes, se deben tomar imágenes de baldosas de 2 x 2 para asegurar imágenes de todo el hígado y el área circundante de 75 μm. Después de la obtención de imágenes, use una pipeta de plástico Pasteur con 1x tricocaína-E3 para extraer la larva del túnel de restricción y transferirla a una placa de Petri con E3 sin azul de metileno. 6. Análisis de variaciones morfológicas hepáticas. NOTA: Los pasos enumerados a continuación se realizan para la cuantificación del área de superficie hepática y el volumen: Software de imagen abierto. Agregue la carpeta que contiene archivos de imagen para analizar a Arena seleccionando el icono de carpeta Observar . A continuación, haciendo clic derecho en las miniaturas, seleccione Convertir al formato de archivo nativo de Imaris para convertir los archivos al formato (.ims). En el submenú Superar, ajuste el brillo y el contraste de cada canal. A continuación, cree una superficie a partir del hígado haciendo clic en el botón azul Agregar nuevas superficies . A continuación, en el panel de creación de superficies, seleccione Segmentar solo una región de interés para crear manualmente una superficie del hígado. Haga clic en Omitir | creación automática Opción Editar manualmente . Seleccione Contorno y anule la selección de la opción “Volumen” en el panel de escena.NOTA: La opción de vista de volumen debe no estar seleccionada, de lo contrario, la selección de la región de interés en diferentes pilas z no podrá hacerlo. Navegue a través de pilas z y dibuje la región de interés en cada plano seleccionando Modo, elija el modo de dibujo que prefiera. Para comenzar a dibujar, cambie el puntero al modo Seleccionar y no a Navegar, haga clic en Dibujar y comience a arrastrar el puntero a través del hígado para dibujar un ROI. Después de seleccionar un ROI en los diferentes planos focales, seleccione Crear una superficie para fusionar todos los ROI seleccionados y crear una superficie hepática. A continuación, utilizando la superficie recién creada crear una máscara de la señal de los hepatocitos. Haga clic en la superficie y, en la pestaña Editar (el lápiz), elija Enmascarar todo. En la ventana que aparece, elija el canal que desea enmascarar que se utilizará para cuantificar el volumen hepático y el área de superficie. Luego, elija establecer vóxeles fuera de la superficie en 0 y marque la opción Duplicar canal antes de aplicar la máscara. Utilice el área de superficie hepática y los valores de volumen hepático del menú de análisis estadístico para el análisis. NOTA: Realice los siguientes pasos para la cuantificación del área hepática. Abra el software Fiji. En el menú Plugins, seleccione Bio-formatos seguido de Bio-formatos Importador, marque la opción Dividir canales para abrir el archivo de imagen. En el menú Imagen, seleccione Propiedades para comprobar que la imagen tiene el tamaño de píxel y la profundidad de vóxel correctos, si no los valores correctos. A continuación, vaya al menú Imágenes, haga clic en Ajustar seguido de Brillo y contraste, ajuste el brillo y el contraste de la imagen. A continuación, el uso de hepatocitos del canal crea una proyección de máxima intensidad del hígado. Vaya al menú Imágenes, haga clic en Pilas seguido de Proyecto Z. Seleccione Proyección de intensidad máxima. Usando la herramienta de selección a mano alzada, cree manualmente una región de interés (ROI) que rodea el hígado larval. A continuación, en el menú Analizar , haga clic en Medir para obtener el área del hígado. Guarde los resultados como hoja de cálculo para su posterior análisis. 7. Análisis morfológico de hepatocitos y nucleares. Abra el software Fiji. En el menú Plugins, seleccione Bio-formatos seguido de Bio-formatos Importador marque la opción Dividir canales para abrir el archivo de imagen. En el menú Imagen, seleccione Propiedades para comprobar que la imagen tiene el tamaño de píxel y la profundidad de vóxel correctos, si no los valores correctos. A continuación, vaya al menú Imágenes, haga clic en Ajustar seguido de Brillo y contraste, ajuste el brillo y el contraste de la imagen. En el menú Analizar , seleccione Establecer medidas y marque todos los parámetros que desee analizar (por ejemplo, descriptores de área, perímetro y forma). Seleccione el canal fluorescente de la membrana de los hepatocitos. Navegando a través de Z, use la herramienta de selección a mano alzada para dibujar un ROI perfecto alrededor de un hepatocito. A continuación, en el menú Analizar , haga clic en Medir para calcular el área de los hepatocitos. Repita el paso 7.3 para 15-30 hepatocitos. Guarde los resultados como hoja de cálculo para su posterior análisis. A continuación, seleccione el canal fluorescente del núcleo. Navegando a través de Z, use la herramienta de selección a mano alzada para dibujar un ROI perfecto alrededor del núcleo de los hepatocitos. A continuación, en el menú Analizar , haga clic en Medir para calcular el área nuclear y la circularidad. Repita el paso 7.5 para 15-30 hepatocitos. Guarde los resultados como una hoja de cálculo para su posterior análisis, incluida la cuantificación de la relación nuclear: citoplasmática. Puntúe las muestras para la presencia de micronúcleos y hernia de la siguiente manera (Tabla 3). 8. Análisis de angiogénesis. Crear manualmente una superficie para el hígado como se describe en la sección 6 de este protocolo. Nombra esta superficie como “Superficie del hígado”. Crear una máscara para la señal de las células endoteliales dentro del hígado. Haga clic en la superficie y debajo de la pestaña de edición (el lápiz) elija Enmascarar todo. En la ventana que aparece, elija el canal de células endoteliales para aislar las señales de los vasos solo del hígado. Elija establecer vóxeles fuera de la superficie en 0 y marque la opción Duplicar canal antes de aplicar la máscara. Cambiar el nombre del nuevo canal enmascarado de células endoteliales como vasculatura hepática. Para medir el volumen del recipiente y el área de superficie, cree una segunda superficie. Haga clic en el botón azul Agregar nuevas superficies . En el primer paso de la creación de la superficie, asegúrese de que todas las opciones no estén seleccionadas para crear automáticamente una superficie. En el segundo paso, elija el canal de vasculatura hepática para crear una superficie encima. Anule la selección de la opción de suavizado para detectar tantos detalles de los recipientes como sea posible y habilite la sustracción de fondo en la opción de umbral. Ajuste el umbral asegurando que la superficie detectada se está colocalizando con la señal de vasculatura hepática. Utilice los valores de área de superficie y volumen del menú de análisis estadístico. Calcule el índice de densidad del vaso utilizando las siguientes ecuaciones:Índice de densidad de vasos (por hígado μm 2) = (área de superficie del vaso (μm 2)) / (área de superficie hepática (μm2))Índice de densidad de vasos (por hígado μm 3) = (Volumen del vaso (μm 3)) / (Volumen hepático (μm3)) 9. Análisis de reclutamiento de células inmunes. Abra el software Fiji. En el menú Plugins, seleccione Bio-formatos seguido de Bio-formatos Importador marque la opción Dividir canales para abrir el archivo de imagen. En el menú Imagen , seleccione Propiedades para comprobar que la imagen tiene el tamaño de píxel y la profundidad de vóxel correctos, si no los valores correctos. A continuación, vaya al menú Imágenes , haga clic en Ajustar seguido de Brillo y contraste, ajuste el brillo y el contraste de la imagen (por ejemplo, macrófagos – mCherry o dTomato; neutrófilos – BFP; Células T – EGFP; hepatocitos – EGFP o mCherry). A continuación, cree proyecciones de intensidad máxima para cada canal. Como se describe en la sección 6 (Pasos 6.9-6.12), cree un ROI que rodea el hígado larvario y mida el área del hígado. Crear un segundo ROI que incluya el área hepática y el área circundante de 75 μm (“Área de reclutamiento”). A continuación, en el menú Editar , seleccione la opción Selección seguida de Agregar al administrador. Al seleccionar una proyección de intensidad máxima del canal de células inmunes innatas, haga clic en el ROI del hígado desde la ventana del Administrador de ROI para establecer el área de reclutamiento. En el menú Plugins, seleccione la opción Analizar seguida de Cell Counter y cuente las células inmunes dentro del área de reclutamiento. Número récord de células inmunes reclutadas en el área del hígado en una hoja de cálculo. Calcule las densidades de neutrófilos, macrófagos y células T normalizando el número de células inmunitarias por área hepática.