제브라피쉬에서 비알코올성 지방간 질환 관련 간세포암의 초기 진행 중 간 미세환경 분석

동물 연구는 알버트 아인슈타인 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에서 승인 한 절차에 따라 수행됩니다. 프로토콜에 사용된 완충액 및 용액에 대한 레시피는 보충 표 1을 참조하십시오. 1. 급성 콜레스테롤 과잉을위한 10 % 콜레스테롤 풍부식이 요법 준비. 두 개의 25mL 유리 비커에 2 x 4g의 골든 펄 다이어트 5-50nm 활성 구체(GPAS)의 무게를 측정합니다(하나는 일반 다이어트(ND)용이고 다른 하나는 10% 고콜레스테롤 다이어트(HCD)용).참고 : 제브라 피쉬 유충을위한 모든 상업용 건조 식품 식단을 사용할 수 있습니다. 10mL 유리 비커에 0.4g의 콜레스테롤을 계량합니다. 비커를 호일로 덮으십시오. 20g 바늘이 있는 10mL 주사기를 사용하여 5mL의 디에틸 에테르를 측정합니다. 다음으로 ND 비커에 디 에틸 에테르를 넣고 주걱을 사용하여 즉시 건조 식품과 혼합합니다.주의: 디에틸 에테르는 눈, 피부 및 호흡기 자극을 유발합니다. 화학 흄 후드에서만 사용하십시오. 20G 바늘이 있는 10mL 주사기를 사용하여 5mL의 디에틸 에테르를 다시 측정하고 콜레스테롤이 든 10mL 비커에 넣고 주사기로 즉시 위아래로 흡인하여 혼합합니다. 콜레스테롤 용액을 HCD 비커에 빠르게 넣고 용액이 균일해질 때까지 주걱으로 즉시 혼합하십시오. 다이에틸 에테르를 완전히 증발시키기 위해 최대 24시간 동안 후드에 비커를 두십시오. 다음날, 유봉과 박격포를 사용하여 GPAS 다이어트를 미세 입자로 분쇄하십시오.알림: 식단을 분쇄하는 것은 중요한 단계이며, 유충은 50nm보다 큰 입자를 먹을 수 없습니다. 각 식단을 라벨이 붙은 작은 비닐 봉지 또는 50mL 원심분리 튜브에 옮기고 -20°C에서 보관합니다. 2. 콜레스테롤이 풍부한식이 요법을 먹이는 단기 유충으로 NASH 유도 – 정적 조건. -1 일에 형질 전환 물고기 라인을 설정하십시오 (표 1). 다음날 아침 (0 일차), 물고기가 산란 한 후 메쉬 스트레이너에 알을 모으십시오. 배아 물 (E3)이 담긴 세척 병을 사용하여 계란을 철저히 헹구고 조심스럽게 계란을 E3 배지가있는 10cm 페트리 접시에 옮깁니다. 죽은 알이나 수정되지 않은 알을 포함하여 번식 상자에 쌓였을 수있는 모든 파편의 판을 청소하십시오.알림: 계란을 헹구고 접시를 청소하는 것은 미생물의 통제되지 않은 성장과 그에 따른 유충 발달 결함을 방지하는 데 중요합니다. 계란을 10cm 페트리 접시 당 70/80의 밀도로 나눕니다 (E3 25mL). 1 일째에, 조명베이스가 장착 된 해부 스코프에서 죽은 배아 또는 발달 결함이있는 배아를 확인하고 청소하십시오.참고: 투과 베이스 암시야 모드를 사용하여 발달 효과가 있는 배아를 식별하고 플레이트에서 미생물의 성장을 확인합니다. 시설마다 시스템에서 미생물 수확량이 다릅니다. 부정적인 영향을 피하기 위해 필요한 경우 E3 매체 및/또는 접시를 변경하십시오. 5 일째에 모든 접시의 유충을 15cm 페트리 접시에 넣고 메틸렌 블루없이 E3를 첨가하십시오. 다음으로, 유충을 다음과 같이 먹이 상자에 나눕니다 (표 2).알림: 통제 조건에서 전신 만성 염증을 유발하지 않고 건강한 유충을 생성하려면 유충에게 하루에 유충 당 약 0.1mg의 음식을 먹여야합니다. 음식의 총량 (표 2)은 하루에 두 번 먹이로 균등하게 나뉩니다. 유충을 28°C의 인큐베이터에 암광 주기(예: 14시간 빛/10시간 다크 주기)로 보관하고 5일에서 12일까지 하루에 두 번 유충에게 먹이를 줍니다. 1mL 피펫 팁에 부착 된 진공 시스템을 사용하여 음식물 찌꺼기와 배지의 90-95 %를 매일 흡인합니다. 다음으로 유충의 손상을 피하기 위해 메틸렌 블루가없는 새로운 E3를 먹이 상자의 한쪽 모서리에 조심스럽게 붓습니다.알림: 먹이 상자를 매일 청소하는 것은 미생물의 통제되지 않은 성장을 방지하는 데 중요합니다. 3. 먹이 상자에서 수정 후 13 일 유충 수집. 13 일째에 설정된 실험 조건의 수에 따라 수집 요리를 준비하십시오. 영구 마커 펜을 사용하여 샘플 전환을 피하기 위해 접시 측면 (뚜껑 및 바닥)에 표시를하십시오 (예 : 일반 다이어트 (ND) 용 검은 색 줄무늬 1 개와 HCD 용 검은 색 줄무늬 2 개). 각 접시의 바닥을 덮을 수 있도록 메틸렌 블루없이 충분한 E3를 붓습니다. 조심스럽게 진공 시스템을 사용하여 먹이 상자에서 물을 흡입하고, 바닥에서 파편이나 죽은 유충을 흡인하여 이러한 물질을 수집 접시로 옮기지 않도록하십시오. 수위가 낮아지기 시작하면 먹이 상자를 천천히 들어 올려 유충이 모서리 중 하나로 수영 한 다음 반대 방향으로 흡인합니다.알림: 물을 흡입할 때 다른 직경을 허용하기 위해 절단 팁이 있는 1mL 피펫을 다른 높이로 사용하십시오. 다른 크기를 번갈아 가며 더 큰 직경으로 시작하여 물의 양이 감소하고 유충 밀도가 증가함에 따라 더 작은 직경으로 변경하십시오. 액체가 약 20-30mL 밖에 없으면 유충을 1 단계에서 준비한 수집 페트리 접시에 조심스럽게 따라 내립니다. 먹이 상자에서 라벨이 붙은 테이프를 접시 뚜껑에 놓습니다. 모든 급지 상자에 대해 3.2-3.4 단계를 반복하십시오. 4. 식이 유발 간 지방증에 대한 대조 분석 – 오일 레드 O (ORO) 염색, 이미징 및 스코어링. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 15-20마리의 유충을 2mL 둥근 바닥 튜브에 옮기고 약 15-30분 동안 얼음 위에 놓습니다. 튜브에서 대부분의 미디어를 제거합니다. 유충을 고정하기 위해 4% 파라포름알데히드(PFA) 2mL를 추가하고 4°C에서 밤새 배양합니다. 다음날 아침, 4 % PFA 용액을 제거하고 2mL의 1x PBS로 유충을 3 회 세척하십시오. 하나의 메쉬 웰 인서트로 조건당 12웰 플레이트(그림 2A)를 준비합니다. 유리 피펫을 사용하여 유충을 2mL 튜브에서 이전에 웰에 놓인 삽입물로 옮기고 1x PBS 5mL를 추가합니다. 염색 후 샘플 보관을 위해 2mL 튜브를 보관하십시오.주의 :이 단계에서 유충은 매우 끈적 거리며 플라스틱 피펫을 사용하지 마십시오. 유충과 함께 삽입물을 60% 이소프로판올 용액 5mL를 사용하여 다른 웰로 옮깁니다. 유충을 30 분 실온 (RT) 동안 배양하십시오. 한편, 60 % 이소프로판올 용액에서 0.3 % 오일 레드 O를 준비하십시오. 0.45 μm 주사기 필터를 사용하여 0.3% Oil Red 용액을 2회 여과한다.알림: 이소프로판올에 0.5% 오일 레드 O 3mL를 증류수 2mL와 혼합하여 웰당 5mL의 용액을 준비합니다. 60 % 이소프로판올 용액의 0.3 % 오일 레드 O는 새로 준비해야합니다. 다음으로, 유충이있는 메쉬 삽입물을 60 % 이소프로판올 용액에 새로 만든 0.3 % 오일 레드 O 5mL를 사용하여 다른 웰로 옮깁니다. 부드러운 흔들림으로 RT에서 3 시간 동안 배양 된 유충. ORO 염색 후, 60 % 이소프로판올로 다른 웰에 삽입물을 옮겨 유충을 헹구십시오. 유충을 60% 이소프로판올로 30분 동안 매번 60% 이소프로판올로 두 번 세척하고 삽입물을 60% 이소프로판올이 있는 웰로 순차적으로 옮깁니다. 삽입물을 1x PBS-0.1% 트윈으로 웰에 순차적으로 옮겨 1x PBS-0.1% 트윈에서 5분 동안 유충을 3회 세척합니다. 유충을 2mL 튜브로 옮깁니다. PBST를 제거하고 1mL의 80% 글리세롤을 추가하고 이미징이 나타날 때까지 4°C에서 보관합니다. 더 나은 이미징을 위해 유충을 1x PBS-0.1% 트윈으로 옮기고 해부 범위 아래에서 두 개의 #55 집게를 사용하여 조직을 조심스럽게 당겨 간을 해부합니다.참고: 캐스퍼를 사용하는 경우 배경 이미징은 전체 유충을 사용하여 수행할 수 있습니다. 유리 피펫을 사용하여 간을 50 % 글리세롤이 함유 된 도자기 스팟 플레이트의 우물로 조심스럽게 옮깁니다. 유충을 조작하기 위해 작은 도구를 사용하여 간을 배치합니다(예: 속눈썹 도구 – 그림 2B). 컬러 카메라가 장착 된 실체 현미경의 이미지 간. 간 지방증 점수 (ORO 염색 없음 = 없음, 밝은 빨간색 ORO 염색 = 경증, 빨간색-진한 빨간색 ORO 염색 = 중간 / 중증). 5. 성장 및 이미징을위한 제브라 피쉬 상처 및 포착 장치 (zWEDGI)를 사용한 비 침습적 컨포칼 이미징. 바닥을 덮을만큼 15-20mL의 1x Tricaine-E3로 10cm 페트리 접시를 준비하십시오.참고: 1x 트리카인-E3 작업 용액(0.16mg/mL)은 25x 트리카인 스톡 용액(48mg/mL)을 48mL의 E3에 희석하여 얻을 수 있습니다. 트리카인 농도는 유충이 이 발달 단계에서 마취에 매우 민감하기 때문에 0.16mg/mL를 초과해서는 안 됩니다. 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 15-20 마리의 유충을 1x Tricaine-E3가 들어있는 페트리 접시에 옮기고 유충을 5 분 동안 마취시킵니다. 웰당 메틸렌 블루가 없는 2-3mL의 E3가 있는 6웰 플레이트를 준비합니다. 형광 실체 현미경 상에서, 원하는 형광 마커에 대해 마취된 유충을 스크리닝합니다(표 1). 선별된 유충을 E3에서 최소량의 트리카인으로 옮기고 이미지화할 시간이 될 때까지 6웰 플레이트에서 회복되도록 합니다.참고: 이중, 삼중 및 사중 형질전환 유충의 스크리닝에는 시간이 걸리고 유충을 E3에 배치하고 트리카인에 대한 불필요한 노출을 줄이기 위해 6웰 플레이트에서 배지를 자주 변경합니다. 또한이 발달 단계의 유충은 떠 다니므로 속눈썹 도구를 사용하여 조직 손상을 유발하지 않고 선별 할 수 있도록 유충을 배치합니다. 스크리닝 후 25mL의 1x Tricaine-E3로 10cm 페트리 접시를 준비합니다. 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 15-20 마리의 유충을 1x Tricaine-E3가 들어있는 페트리 접시에 옮기고 유충을 5 분 동안 마취시킵니다. 한편, 실체 현미경으로 1x Tricaine-E3를 상처 및 포착 장치 (예 : zWEDGI)의 챔버에 추가합니다 15,16. P200 마이크로피펫을 사용하여 챔버와 억제 터널에서 기포를 제거합니다. 초과분에 1x Tricaine-E3를 모두 제거하여 챔버를 채우기에 충분한 양만 남겨 둡니다. 마취 된 유충을 zWGGI의 로딩 챔버로 옮기고 실체 현미경 아래의 속눈썹 도구를 사용하여 배치합니다. 부드럽게 유충의 머리를 두드리고 꼬리가 구속 터널에 들어가도록 밀어 넣으십시오. 또한 마이크로 피펫을 사용하여 상처 챔버에서 1x Tricaine-E3를 제거하여 유충이 터널로 들어갈 수 있도록합니다. 유충이 왼쪽 엽의 이미징을 위해 적절하게 배치되었는지 확인하십시오 – 도립 현미경: 왼쪽이 아래를 향하고 있습니다. 직립 현미경: 왼쪽이 위를 향하고 있습니다.알림: zWEDGI를 사용할 수 없는 경우 물고기를 1x Tricaine-E3의 1% 저융점 아가로스에 장착하고 배치할 수 있지만 빠른 이미징(최대 15분)을 위해서만 아가로스 침지를 사용할 수 있습니다. 간세포 및 핵 형태 분석을 위해 40x 공기 대물렌즈와 2μm 광학 섹션의 z-스택을 사용하여 컨포칼 현미경으로 간을 이미지화합니다. 간 형태학, 혈관신생 및 면역 세포 모집 분석을 위해 20x 공기 대물렌즈와 5μm 광학 섹션의 z-스택을 사용하여 간 이미지를 제공합니다. 간이 큰 유충의 경우 모든 간과 주변 영역의 이미징을 보장하기 위해 2 x 2 타일 이미지를 75μm로 촬영해야합니다. 이미징 후 1x Tricaine-E3가 포함 된 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 억제 터널에서 유충을 끌어 내고 메틸렌 블루가없는 E3가있는 페트리 접시로 옮깁니다. 6. 간 형태 학적 변이 분석. 알림: 아래 나열된 단계는 간 표면적 및 부피 정량화를 위해 수행됩니다. 이미징 소프트웨어를 엽니다. 분석할 이미지 파일이 포함된 폴더를 아레나 에 추가하고 폴더 관찰 아이콘을 선택합니다. 그런 다음 썸네일을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 기본 Imaris 파일 형식으로 변환을 선택하여 파일을 형식(.ims)으로 변환합니다. Surpass 하위 메뉴에서 각 채널의 밝기와 대비를 조정합니다. 다음으로, 파란색 새 표면 추가 버튼을 클릭하여 간에서 표면을 만듭니다. 다음으로, 표면 생성 패널에서 관심 영역만 세그먼트화를 선택하여 간 표면을 수동으로 만듭니다. 자동 생성 | 건너뛰기를 클릭합니다. 수동으로 편집 옵션을 선택합니다. 윤곽선을 선택하고 장면 패널에서 “볼륨”옵션을 선택 취소하십시오.참고: 볼륨 보기 옵션을 선택 해제해야 하며, 그렇지 않으면 다른 z-스택에서 관심 영역을 선택할 수 없습니다. z-stacks를 탐색하고 모드를 선택하여 각 평면에서 관심 영역을 그리고 원하는 그리기 모드를 선택합니다. 그리기를 시작하려면 포인터를 탐색이 아닌 선택 모드로 변경하고 그리기를 클릭 한 다음 간을 통해 포인터를 드래그하여 ROI를 그립니다. 다른 초점면에서 ROI를 선택한 후 표면 만들기를 선택하여 선택한 모든 ROI를 병합하고 간 표면을 만듭니다. 다음으로, 새로 생성 된 표면을 사용하여 간세포 신호의 마스크를 만듭니다. 표면을 클릭하고 편집 탭(연필) 아래에서 모두 마스크를 선택합니다. 나타나는 창에서 간 부피와 표면적을 정량화하는 데 사용할 마스킹하려는 채널을 선택하십시오. 그런 다음 표면 외부 복셀을 0으로 설정하고 마스크를 적용하기 전에 채널 복제 옵션을 선택합니다. 분석을 위해 통계 분석 메뉴의 간 표면적과 간 부피 값을 사용하십시오. 알림: 간 영역 정량화를 위해 다음 단계를 수행하십시오. 피지 소프트웨어를 엽니다. 플러그인 메뉴에서 바이오 형식을 선택한 다음 바이오 형식 가져 오기를 선택하고 채널 분할 옵션을 선택하여 이미지 파일을 엽니 다. 이미지 메뉴에서 속성을 선택하여 이미지의 픽셀 크기와 복셀 깊이가 올바른지 확인합니다(올바른 값이 아닌 경우). 그런 다음 이미지 메뉴로 이동하여 조정을 클릭 한 다음 밝기 및 대비를 클릭하고 이미지 밝기와 대비를 조정합니다. 다음으로, 간세포 채널을 사용하여 간장의 최대 강도 투영을 만듭니다. 이미지 메뉴로 이동하여 스택을 클릭 한 다음 Z 프로젝트를 클릭하십시오. 최대 강도 투영을 선택합니다. 자유형 선택 도구를 사용하여 유충 간을 둘러싼 관심 영역(ROI)을 수동으로 만듭니다. 그런 다음 분석 메뉴에서 측정을 클릭하여 간 영역을 얻습니다. 추가 분석을 위해 결과를 스프레드시트로 저장합니다. 7. 간세포 및 핵 형태 학적 분석. 피지 소프트웨어를 엽니다. 플러그인 메뉴에서 바이오 형식을 선택한 다음 바이오 형식 가져 오기 틱 채널 분할 옵션을 선택하여 이미지 파일을 엽니 다. 이미지 메뉴에서 속성을 선택하여 이미지의 픽셀 크기와 복셀 깊이가 올바른지 확인합니다(올바른 값이 아닌 경우). 그런 다음 이미지 메뉴로 이동하여 조정을 클릭 한 다음 밝기 및 대비를 클릭하고 이미지 밝기와 대비를 조정합니다. 분석 메뉴에서 분석하려는 모든 매개변수(예: 면적, 둘레 및 모양 설명자)에 대해 측정 설정 체크 표시를 선택합니다. 간세포 막 형광 채널을 선택하십시오. Z를 탐색하면서 자유형 선택 도구를 사용하여 하나의 간세포 주위에 완벽한 ROI를 그립니다. 그런 다음 분석 메뉴에서 측정을 클릭하여 간세포 면적을 계산합니다. 15-30 개의 간세포에 대해 7.3 단계를 반복하십시오. 추가 분석을 위해 결과를 스프레드시트로 저장합니다. 다음으로, 핵 형광 채널을 선택하십시오. Z를 탐색하면서 자유형 선택 도구를 사용하여 간세포 핵 주위에 완벽한 ROI를 그립니다. 다음으로 분석 메뉴에서 측정을 클릭하여 핵 면적과 순환도를 계산합니다. 15-30 개의 간세포에 대해 7.5 단계를 반복하십시오. 핵:세포질 비율의 정량화를 포함한 추가 분석을 위해 결과를 스프레드시트로 저장합니다. 다음과 같이 소핵 및 탈장의 존재에 대한 샘플을 채점합니다(표 3). 8. 혈관 신생 분석. 이 프로토콜의 섹션 6에 설명된 대로 간 표면을 수동으로 만듭니다. 이 표면의 이름을 “간 표면”으로 지정합니다. 간 내부의 내피 세포 신호에 대한 마스크를 만듭니다. 표면을 클릭하고 편집 탭(연필) 아래에서 모두 마스크를 선택합니다. 나타나는 창에서 내피 세포 채널을 선택하여 간에서 혈관 신호를 분리합니다. 표면 외부 복셀 설정을 선택하고 마스크를 적용하기 전에 채널 복제 옵션을 선택합니다. 새로운 내피 세포 마스킹 채널의 이름을 간 혈관계로 바꿉니다. 용기 부피와 표면적을 측정하려면 두 번째 표면을 만듭니다. 파란색 새 서피스 추가 버튼을 클릭합니다. 지표면 작성의 첫 번째 단계에서 지표면을 자동으로 작성하도록 모든 옵션이 선택 취소되어 있는지 확인합니다. 두 번째 단계에서는 간 혈관 채널을 선택하여 표면을 만듭니다. 스무딩 옵션을 선택 취소하여 선박에서 가능한 한 많은 세부 정보를 감지하고 임계값 옵션에서 배경 빼기를 활성화합니다. 감지된 표면이 간 혈관 신호와 함께 국소화되도록 임계값을 조정합니다. 통계 분석 메뉴의 표면적과 부피 값을 사용합니다. 다음 방정식을 사용하여 용기 밀도 지수를 계산합니다.혈관 밀도 지수 (간 μm 2 기준) = (혈관 표면적 (μm 2)) / (간 표면적 (μm2))혈관 밀도 지수 (간 μm 3 기준) = (혈관 부피 (μm 3)) / (간 부피 (μm3)) 9. 면역 세포 모집 분석. 피지 소프트웨어를 엽니다. 플러그인 메뉴에서 바이오 형식을 선택한 다음 바이오 형식 가져 오기 틱 채널 분할 옵션을 선택하여 이미지 파일을 엽니 다. 이미지 메뉴에서 속성을 선택하여 이미지의 픽셀 크기와 복셀 깊이가 올바른지 확인합니다(올바른 값이 아닌 경우). 그런 다음 이미지 메뉴로 이동하여 조정을 클릭 한 다음 밝기 및 대비를 클릭하고 이미지 밝기 및 대비를 조정합니다 (예 : 대 식세포 – mCherry 또는 d토마토, 호중구 – BFP; T 세포 – EGFP; 간세포 – EGFP 또는 엠 체리). 다음으로 각 채널에 대한 최대 강도 투영을 만듭니다. 섹션 6 (6.9-6.12 단계)에 설명 된대로 유충 간을 둘러싼 ROI를 만들고 간 영역을 측정합니다. 간 영역과 75μm 주변 영역 ( “모집 영역”)을 포함하는 두 번째 ROI를 만듭니다. 그런 다음 편집 메뉴에서 선택 옵션을 선택한 다음 관리자에 추가를 선택합니다. 선천성 면역 세포 채널 최대 강도 투영을 선택하고 ROI 관리자 창에서 간 ROI를 클릭하여 모집 영역을 설정합니다. 플러그인 메뉴에서 분석 옵션을 선택한 다음 세포 카운터를 선택하고 모집 영역 내의 면역 세포를 계산합니다. 간 영역에 모집 된 면역 세포의 수를 스프레드 시트에 기록하십시오. 간 영역당 면역 세포 수를 정규화하여 호중구, 대식세포 및 T 세포 밀도를 계산합니다.