ゼブラフィッシュにおける非アルコール性脂肪性肝疾患関連肝細胞癌の早期進行過程における肝微小環境の解析

動物実験は、アルバートアインシュタイン医科大学の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認された手順に従って実施されます。プロトコルで使用されるバッファーと溶液のレシピについては、 補足表1を参照してください。 1.急性コレステロール余剰のための10%コレステロール強化食の準備。 2つの25 mLガラスビーカーに2 x 4 gのゴールデンパールダイエット5-50 nmアクティブスフィア(GPAS)を計量します-1つは通常の食事(ND)用、もう1つは10%高コレステロール食(HCD)用です。注:ゼブラフィッシュの幼虫のための市販のドライフードダイエットを使用することができます。 10mLのガラスビーカーに0.4gのコレステロールを量ります。ビーカーをホイルで覆います。 20 Gの針が付いた10 mLシリンジを使用して、5 mLのジエチルエーテルを測定します。次に、ジエチルエーテルをNDビーカーに加え、すぐにスパチュラを使用してドライフードと混ぜます。注意: ジエチルエーテルは、目、皮膚、気道の炎症を引き起こします。.化学ヒュームフードでのみ使用してください。 20 G針付きの10 mLシリンジを使用して5 mLのジエチルエーテルを再度測定し、コレステロールを含む10 mLビーカーに追加し、シリンジですぐに上下に吸引して混合します。 コレステロール溶液をHCDビーカーにすばやく加え、溶液が均一になるまですぐにスパチュラで混ぜます。 ビーカーをフードに最大24時間置いて、ジエチルエーテルを完全に蒸発させます。翌日、乳棒と乳鉢を使用してGPASダイエットを微粒子に粉砕します。注:食事を粉砕することは重要なステップであり、幼虫は50nmを超える粒子を食べることができません。 各食事を小さなラベル付きのビニール袋または50 mLの遠沈管に移し、-20°Cで保存します。 2.コレステロール強化食による短期間の幼虫摂食によるNASH誘導 – 静的条件。 -1日目にトランスジェニックフィッシュラインを設定します(表1)。翌朝(0日目)、魚が産卵した後、メッシュストレーナーで卵を集めます。 胚水(E3)を入れた洗浄ボトルを使用して、卵をよくすすぎ、卵をE3培地で10cmのペトリ皿に慎重に移します。 死んだ卵や未受精の卵を含め、繁殖箱に蓄積した可能性のあるすべての破片のプレートをきれいにします。注:卵をすすぎ、プレートを洗浄することは、微生物の制御されない成長とその結果としての幼虫の発育上の欠陥を回避するために重要です。 卵を10 cmのペトリ皿あたり70/80の密度で分けます(25 mLのE3中)。1日目に、透過照明ベースを備えた解剖スコープの下で、死んだ胚または発生障害のある胚をチェックしてきれいにします。注意: 透過照明ベース暗視野モードを使用して、発生効果のある胚を識別し、プレート内の微生物の成長を確認します。施設が異なれば、システム内の微生物収量も異なります。悪影響を避けるために、必要に応じてE3培地および/または皿を交換してください。 5日目に、すべての皿の幼虫を15 cmのペトリ皿に入れ、メチレンブルーなしでE3を加えます。次に、以下のように給餌箱内の幼虫を分ける(表2)。注:対照条件では、全身性の慢性炎症を引き起こすことなく健康な幼虫を生成するには、幼虫に1日あたり幼虫あたり約0.1mgの食物を与える必要があります。食物の総量(表2)が1日2回の給餌に均等に分割されていることに注意してください。 幼虫を28°Cのインキュベーターに暗光サイクル(例:14時間明/10時間暗サイクル)で保管し、5日目から12日目まで1日2回幼虫に餌を与えます。 1 mLピペットチップに取り付けられた真空システムを使用して、食品の破片、および培地の90〜95%を毎日吸引します。次に、幼虫を傷つけないように、メチレンブルーを含まない新しいE3を給餌ボックスの片隅に慎重に注ぎます。注意: 給餌ボックスの毎日の清掃は、微生物の制御されない成長を避けるために重要です。 3.給餌箱からの受精後13日の幼虫の収集。 13日目に、設定された実験条件の数に応じて収集皿を準備します。パーマネントマーカーペンを使用して、サンプルの切り替えを避けるために皿の側面(蓋と底)にマークを付けます(例:通常の食事(ND)用の1本の黒い縞模様とHCD用の2本の黒い縞模様)。 各皿の底を覆うのに十分なE3をメチレンブルーなしで注ぎます。慎重に真空システムを使用して給餌ボックスから水を吸引し、これらの材料を収集皿に移さないように、底から破片や死んだ幼虫を吸引するようにしてください。 水位が低くなり始めたら、給餌ボックスをゆっくりと持ち上げて幼虫を角の1つまで泳がせ、反対方向に吸引します。注:水を吸引するときに異なる直径を可能にするために、さまざまな高さでカットチップを備えた1mLピペットを使用してください。異なるサイズを交互に使用し、より大きな直径から始めて、水量が減少し幼虫の密度が増加するにつれて、より小さな直径に変更します。 約20〜30 mLの液体しかなくなったら、ステップ1で準備した収集シャーレに幼虫を注意深くデカントします。給餌ボックスからラベルの付いたテープを皿の蓋に置きます。 すべての給餌ボックスに対して手順3.2〜3.4を繰り返します。 4.食事誘発性肝脂肪症の対照アッセイ-オイルレッドO(ORO)染色、イメージング、およびスコアリング。 ガラスパスツールピペットを使用して、15〜20匹の幼虫を2mLの丸底チューブに移し、約15〜30分間氷上に置きます。チューブからほとんどのメディアを取り外します。 幼虫を固定するために4%パラホルムアルデヒド(PFA)を2mL加え、4°Cで一晩インキュベートします。 翌朝、4%PFA溶液を取り除き、幼虫を2 mLの1x PBSで3回洗浄します。 1つのメッシュウェルインサートを備えた条件ごとに12ウェルプレート(図2A)を準備します。 ガラスピペットを使用して、幼虫を2 mLチューブからウェルに予め置いたインサートに移し、5 mLの1x PBSを加える。染色後のサンプル保存用に2 mLチューブを保存してください。注意:幼虫はこの段階で非常に粘着性があり、プラスチック製のピペットを使用しないでください。 幼虫を含むインサートを5mLの60%イソプロパノール溶液を含む別のウェルに移します。幼虫を室温(RT)で30分間インキュベートします。 その間、60%イソプロパノール溶液中の0.3%オイルレッドOを調製する。0.45 μmシリンジフィルターを使用して、0.3%オイルレッド溶液を2回ろ過します。注:イソプロパノール中の3 mLの0.5%オイルレッドOを2 mLの蒸留水と混合することにより、ウェルあたり5 mLの溶液を調製します。60%イソプロパノール溶液中の0.3%オイルレッドOは、新たに調製する必要があります。 次に、幼虫の入ったメッシュインサートを、60%イソプロパノール溶液中の5mLの新しく作られた0.3%オイルレッドOを含む別のウェルに移します。穏やかな揺動でRTで3時間インキュベートされた幼虫。 ORO染色後、60%イソプロパノールを含む別のウェルにインサートを移して幼虫をすすぐ。幼虫を60%イソプロパノールで30分間2回洗浄し、60%イソプロパノールを含むウェルにインサートを順次移します。 1x PBS-0.1%トゥイーンでインサートを順番にウェルに移し、1x PBS-0.1%トゥイーンで幼虫を5分間3回洗浄します。 幼虫を2mLチューブに移します。PBSTを除去し、1 mLの80%グリセロールを加え、イメージングするまで4°Cで保存します。 より良いイメージングのために、幼虫を1x PBS-0.1%トゥイーンに移し、解剖スコープ下で2つの#55鉗子を使用して組織を注意深く引っ張って肝臓を解剖します。注:キャスパーバックグラウンドイメージングを使用する場合は、幼虫全体を使用して実行できます。 ガラスピペットを使用して、肝臓を50%グリセロールを含む磁器スポットプレートのウェルに注意深く移します。幼虫を操作するための小さなツールを使用して肝臓を配置します(たとえば、まつげツール- 図2B)。カラーカメラを備えた実体顕微鏡で肝臓を画像化します。 肝脂肪症のスコア(ORO染色なし=なし、薄赤色ORO染色=軽度、赤-暗赤色ORO染色=中等度/重度)。 5.ゼブラフィッシュ成長イメージングのための創傷および閉じ込めデバイス(zWEDGI)を使用した非侵襲的共焦点イメージング。 底を覆うのに十分な15〜20 mLの1xトリカイン-E3を入れた10 cmのペトリ皿を準備します。注:1xトリカイン-E3作業溶液(0.16 mg / mL)は、2 mLの25xトリカインストック溶液(4 mg / mL)を48 mLのE3で希釈することによって得ることができます。トリカイン濃度は、幼虫がこの発達段階で麻酔に非常に敏感であるため、0.16 mg / mLを超えてはなりません。. プラスチック製のパスツールピペットで15〜20匹の幼虫を1xトリカイン-E3を含むペトリ皿に移し、幼虫を5分間麻酔します。 ウェルあたりメチレンブルーを含まない2〜3 mLのE3を含む6ウェルプレートを準備します。 蛍光実体顕微鏡上で、麻酔をかけた幼虫をスクリーニングして、目的の蛍光マーカーを探します(表1)。スクリーニングされた幼虫をE3の最小量のトリカインに移し、画像化する時間になるまで6ウェルプレートで回復させます。注:二重、三重、および四重のトランスジェニック幼虫のスクリーニングには時間がかかり、幼虫をE3に入れ、6ウェルプレートから培地を頻繁に交換して、トリカインへの不必要な曝露を減らします。また、この発達段階の幼虫は浮遊するので、まつげツールを使用して、組織損傷を誘発することなくスクリーニングのために幼虫を配置します。 スクリーニング後、25 mLの1xトリカイン-E3を含む10 cmのペトリ皿を準備します。プラスチック製のパスツールピペットで15〜20匹の幼虫を1xトリカイン-E3を含むペトリ皿に移し、幼虫を5分間麻酔します。 一方、実体顕微鏡下で、1xトリカイン-E3を創傷および閉じ込め装置のチャンバーに追加します(例:zWEDGI)15,16。P200マイクロピペットを使用して、チャンバーと拘束トンネルから気泡を取り除きます。余分な1xトリカイン-E3をすべて取り除き、チャンバーを満たすのに十分な量だけを残します。 麻酔をかけた幼虫をzWEDGIのローディングチャンバーに移し、まつげツールを使用して実体顕微鏡の下に配置します。幼虫の頭を軽くたたき、尾が拘束トンネルに入るように押します。さらに、マイクロピペットを使用して、幼虫がトンネルに入るのを助けるために、創傷室から1x Tricaine-E3を取り除きます。幼虫が左葉のイメージングに適切に配置されていることを確認してください-倒立顕微鏡:左側を下向きにします。正立顕微鏡:左側を上向き。注:zWEDGIが利用できない場合は、魚を1xトリカイン-E3の1%低融点アガロースに取り付けて配置できますが、アガロース浸漬は迅速なイメージング(最大15分)にのみ使用できます。 肝細胞および核形態解析では、40倍の空気対物レンズと2 μmの光学切片のzスタックを使用して共焦点顕微鏡で肝臓を画像化します。肝臓の形態、血管新生、および免疫細胞動員アッセイでは、20倍の空気対物レンズと5 μmの光学切片のzスタックを使用して肝臓を画像化します。大きな肝臓を持つ幼虫の場合、75μmのすべての肝臓とその周辺領域のイメージングを確実にするために、2 x 2タイル画像を撮影する必要があります。 イメージング後、1x Tricaine-E3を含むプラスチック製パスツールピペットを使用して、拘束トンネルから幼虫を引き出し、メチレンブルーを含まないE3のシャーレに移します。 6.肝臓の形態学的変異の分析。 注:以下の手順は、肝臓の表面積と体積の定量化のために実行されます。 イメージングソフトウェアを開きます。分析する画像ファイルを含むフォルダーを アリーナ に追加し、[ フォルダーの観察 ]アイコンを選択します。次に、サムネイルを右クリックして、[ ネイティブImarisファイル形式に変換 ]を選択して、ファイルを形式(.ims)に変換します。 Surpassサブメニューで、各チャンネルの明るさとコントラストを調整します。次に、青い[ 新しいサーフェスの追加 ]ボタンをクリックして、肝臓からサーフェスを作成します。 次に、表面作成パネルで [関心領域のみをセグメント化 ]を選択して、肝臓の表面を手動で作成します。 [ 自動作成|をスキップ] をクリックします。手動編集 オプション。 輪郭 を選択し、シーンパネルで「ボリューム」オプションの選択を解除します。注:ボリュームビューオプションは選択解除する必要があり、そうしないと、異なるzスタックで関心領域を選択できなくなります。 zスタックをナビゲートし、[モード]を選択して各平面に関心領域を描画し、好みの描画モードを選択します。描画を開始するには、ポインタをナビゲートではなく選択モードに変更し、次に[描画]をクリックし、ポインタを肝臓にドラッグしてROIを描画し始めます。 さまざまな焦点面でROIを選択した後、[サーフェスの作成]を選択して、選択したすべてのROIをマージし、肝臓 サーフェス を作成します。 次に、新しく作成した表面を使用して、肝細胞シグナルのマスクを作成します。サーフェスをクリックし、[ 編集 ]タブ(鉛筆)で [すべてマスク]を選択します。表示されるウィンドウで、肝臓の体積と表面積を定量化するために使用されるマスクするチャネルを選択します。次に、[サーフェスの外側のボクセルを0に設定する]を選択し、マスクを適用する前に[ チャネルを複製 ]オプションにチェックマークを付けます。 分析には、統計分析メニューの肝臓表面積と肝臓体積の値を使用します。 注意: 肝臓面積の定量化には、次の手順を実行します。 フィジーソフトウェアを開きます。[プラグイン]メニューで、[バイオフォーマット]、[バイオフォーマットインポーター]の順に選択し、[チャンネルの分割]オプションにチェックマークを付けて画像ファイルを開きます。 [イメージ] メニューの [ プロパティ ] を選択して、イメージのピクセル サイズとボクセル深度が正しいことを確認します (値が正しくない場合)。次に、[画像] メニューに移動し、[ 調整 ]、[明るさとコントラスト]の順にクリックし、画像の 明るさとコントラストを調整します。 次に、肝細胞チャネルを用いて、肝臓の最大強度投影を作成する。[画像]メニューに移動し、[スタック]、[Zプロジェクト]の順にクリックします。[最大強度投影]を選択します。 フリーハンド選択ツールを使用して、幼虫の肝臓を囲む関心領域(ROI)を手動で作成します。次に、[ 分析 ]メニューで [測定] をクリックして肝臓面積を取得します。結果をスプレッドシートとして保存して、さらに分析します。 7.肝細胞および核形態学的分析。 フィジーソフトウェアを開きます。[プラグイン]メニューで、[バイオフォーマット]を選択し、[バイオフォーマットインポーターの分割チャンネル]オプションにチェックマークを付けて、画像ファイルを開きます。 [イメージ] メニューの [ プロパティ ] を選択して、イメージのピクセル サイズとボクセル深度が正しいことを確認します (値が正しくない場合)。次に、[画像]メニューに移動し、[ 調整 ]、[明るさとコントラスト]の順にクリックし、画像の 明るさとコントラストを調整します。 [分析]メニューで、 分析 するすべてのパラメータ(面積、周長、形状記述子など)の[ 測定値の設定 ]チェックマークを選択します。肝細胞膜蛍光チャネルを選択します。Zをナビゲートし、フリーハンド選択ツールを使用して、1つの肝細胞の周りに完璧なROIを描画します。次に、[ 分析 ]メニューで [測定 ]をクリックして肝細胞面積を計算します。 15〜30個の肝細胞に対してステップ7.3を繰り返します。結果をスプレッドシートとして保存して、さらに分析します。 次に、核蛍光チャネルを選択します。Zをナビゲートし、フリーハンド選択ツールを使用して、肝細胞の核の周りに完璧なROIを描画します。次に、[ 分析 ]メニューで [測定 ]をクリックして、核面積と円形度を計算します。 15〜30個の肝細胞に対してステップ7.5を繰り返します。核:細胞質比の定量化を含むさらなる分析のために、結果をスプレッドシートとして保存します。 小核の存在およびヘルニアについてのサンプルのスコアは以下のようにした(表3)。 8.血管新生分析。 このプロトコルのセクション6で説明されているように、肝臓の表面を手動で作成します。この表面を「肝臓表面」と名付けます。 肝臓内の内皮細胞シグナルのマスクを作成します。サーフェスをクリックし、編集タブ(鉛筆)の下で [すべてマスク]を選択します。表示されるウィンドウで、内皮細胞チャネルを選択して、肝臓から血管信号を分離します。[サーフェスの外側のボクセルを0に設定]を選択し、[マスク]を適用する前に[ チャネルを複製 ]オプションにチェックマークを付けます。 新しい内皮細胞マスクチャネルの名前を 肝血管系に変更します。 容器の体積と表面積を測定するには、2番目のサーフェスを作成します。青い[ 新しいサーフェスの追加 ]ボタンをクリックします。サーフェス作成の最初のステップで、サーフェスを自動的に作成するためにすべてのオプションが選択されていないことを確認します。 2番目のステップでは、肝血管系チャネルを選択して、表面を作成します。スムージングオプションの選択を解除して、船舶からできるだけ多くの詳細を検出し、しきい値オプションでバックグラウンド減算を有効にします。 検出された表面が肝血管系シグナルと共局在していることを確認するために、閾値を調整します。統計分析メニューから表面積と体積の値を使用します。次の式を使用して血管密度指数を計算します。血管密度指数(肝臓によるμm2)=(血管表面積(μm2))/(肝臓表面積(μm2))血管密度指数(肝臓μm3による)=(血管容積(μm3))/(肝臓容積(μm3)) 9.免疫細胞動員分析。 フィジーソフトウェアを開きます。[プラグイン]メニューで、[バイオフォーマット]を選択し、[バイオフォーマットインポーターの分割チャンネル]オプションにチェックマークを付けて、画像ファイルを開きます。 [イメージ] メニューの [プロパティ] を選択して、イメージのピクセル サイズとボクセル深度が正しいことを確認します (値が正しくない場合)。次に、[画像]メニューに移動し、[調整]、[明るさとコントラスト]の順にクリックし、画像の明るさとコントラストを調整します(例:マクロファージ-mCherryまたはdTomato;好中球-BFP;T細胞 – EGFP;肝細胞 – EGFPまたはmチェリー)。 次に、各チャンネルへの最大強度投影を作成します。 セクション6(ステップ6.9-6.12)で説明されているように、幼虫の肝臓を囲むROIを作成し、肝臓面積を測定します。肝臓領域と75μmの周辺領域(「募集領域」)を含む2番目のROIを作成します。 次に、[ 編集 ]メニューで[ 選択] オプションを選択し、[ マネージャーに追加]を選択します。自然免疫細胞チャネルの最大強度投影を選択し、ROIマネージャーウィンドウから肝臓ROIをクリックして、 募集領域を設定します。 [プラグイン]メニューで、[ 分析 ]オプションを選択し、[ セルカウンター ]を選択して、 募集エリア内の免疫細胞をカウントします。肝臓領域に動員された免疫細胞の数をスプレッドシートに記録します。 肝臓面積あたりの免疫細胞の数を正規化することにより、好中球、マクロファージ、およびT細胞密度を計算します。