ניתוח של מיקרו-סביבה של הכבד במהלך התקדמות מוקדמת של קרצינומה הפטוצלולרית שאינה אלכוהולית הקשורה למחלת הכבד השומני בדגי זברה
Summary
במאמר זה אנו מציגים כיצד ליצור מודל של דגי זברה הקשורים למחלת כבד שומני שאינו אלכוהולי (NAFLD) כדי לחקור את ההשפעה של עודף כולסטרול על המיקרו-סביבה של הכבד ועל הנוף של תאי מערכת החיסון.
Abstract
סרטן הכבד הוא כיום הגורם השלישי המוביל למוות הקשור לסרטן ברחבי העולם, וקרצינומה הפטוצלולרית (HCC) מהווה 75-90% מכלל מקרי סרטן הכבד. עם כניסתם של טיפולים יעילים למניעה וטיפול בהפטיטיס B/C, מחלת כבד שומני לא אלכוהולית (NAFLD), והצורה האגרסיבית יותר הידועה בשם סטאטוהפטיטיס לא אלכוהולית (NASH), הופכים במהירות לגורמי הסיכון מספר אחת לפתח HCC בחברות מודרניות. כדי להבין טוב יותר את התפקיד שיש ל-NASH בפיתוח HCC, עיצבנו דג זברה HCC הקשור ל-NASH. הבהירות האופטית והמתיחה הגנטית של זחלי דגי הזברה הופכות אותם למודל מושך ורב עוצמה לחקר המיקרו-סביבה של הכבד והרכב תאי מערכת החיסון באמצעות הדמיה חיה פלואורסצנטית לא פולשנית. פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במודל דגי זברה HCC הקשור ל-NASH כדי לחקור את ההשפעה של עודף כולסטרול במיקרו-סביבה של הכבד ואת השפעתו על הרכב תאי מערכת החיסון בשלבים המוקדמים של המחלה. ראשית, אנו מזינים זחלי HCC (s704Tg), המבטאים בטא-קטנין פעיל ספציפי להפטוציטים, עם תזונה של 10% כולסטרול גבוה במשך 8 ימים כדי לפתח מודל HCC הקשור ל-NASH. כאן נתאר כיצד לעשות שימוש בקווים מהונדסים שונים כדי להעריך מספר תכונות ממאירות מוקדמות בכבד על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית לא פולשנית, כגון אזור הכבד, התא והמורפולוגיה הגרעינית (אזור הפטוציטים, אזור גרעיני, יחס גרעיני:ציטופלסמי (יחס N:C), מעגליות גרעינית, ניקוד מיקרו-גרעיני/פריצה גרעינית) ואנגיוגנזה. לאחר מכן, באמצעות קווים מהונדסים עם תאי חיסון מתויגים (נויטרופילים, מקרופאגים ותאי T) אנו מראים כיצד לנתח את הרכב תאי מערכת החיסון בכבד בזחלי HCC הקשורים ל-NASH. הטכניקות המתוארות שימושיות להערכת מיקרו-סביבה של הכבד והרכב תאי מערכת החיסון בשלבים מוקדמים של הפטוקרצינוגנזה, אך ניתן גם לשנות אותן כדי לחקור תכונות כאלה במודלים אחרים של מחלות כבד.
Introduction
קרצינומה הפטוצלולרית (HCC) היא סרטן אגרסיבי עם אפשרויות טיפוליות מוגבלות. נמצא כי למעלה מ-30% מכלל החולים עם HCC סובלים מהשמנת יתר וסובלים מ-NASH, צורה אגרסיבית של NAFLD 1,2,3,4. צריכת דיאטות עשירות בקלוריות מגדילה באופן דרסטי את זמינות חומצות השומן הגורמת לשינויים מטבוליים מקומיים ומערכתיים ומעוררת סטאטוזיס, פגיעה בהפטוציטים, דלקת ופיברוזיס – כולם מאפיינים מרכזיים של NASH. התקדמות NASH ל-HCC כרוכה בהצטברות של שומנים בכבד, מה שמעורר דלקת ושינוי בהרכב תאי מערכת החיסון 5,6,7. מעניין וחשיבות מיוחדת להבין כיצד המיקרו-סביבה של הכבד ונוף תאי מערכת החיסון משתנים במהלך התקדמות מחלת הכבד, וכיצד היא משתנה עקב גורמים אטיולוגיים מסוימים. כדי לזהות טוב יותר את ההשפעה שיש לעודף כולסטרול על מיקרו-סביבה של הכבד ועל הנוף של תאי מערכת החיסון, פיתחנו מודל ייחודי של דגי זברה הקשורים ל-HCC הקשור ל-NASH. השימוש במודל זה נתן לנו הבנה טובה יותר של ההשפעה של תזונה ותזונת יתר על מיקרו-סביבה של הכבד ועל התקדמות מחלות כבד.
מודלים של יונקים, כגון עכברים ודגימות רקמות אנושיות, היו חיוניים להבנת הפתוגנזה של סטאטוהפטיטיס וסטאטוזיס8. עכברים הם המודל המועדף למחלות כבד וסרטן, אך הם חסרים בהירות אופטית ברמה התאית, בעוד שדגימות רקמה אנושיות חסרות לעתים קרובות את הסביבה התלת-ממדית שמודלים של בעלי חיים מסוגלים לחקות. מכשולים אלה הפכו את דג הזברה למודל רב עוצמה בקהילת המחקר. לדגי זברה יש קווי דמיון מדהימים לבני אדם, עם לפחות 70% שימור גנים. הם שומרים על מיקרו-סביבה של הכבד, הרכב תאי הכבד, תפקוד, איתות ותגובה לפציעות 9,10. באמצעות תזונה עתירת כולסטרול (HCD) בשילוב עם מודל מבוסס של דגי זברה מהונדסים של HCC, פיתחנו מודל דגי זברה של HCC הקשור ל-NASH.
כאן אנו מציגים פרוטוקול המסביר כיצד ליצור מודל דג זברה HCC הקשור ל-NASH וכיצד לחקור את המיקרו-סביבה של הכבד ולטפל בתכונות ממאירות מוקדמות in vivo. באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לא פולשנית בשילוב עם קווים מהונדסים של דגי זברה עם קרום וגרעין הפטוציטים המתויגים באופן פלואורסצנטי, אנו יכולים לטפל בתכונות ממאירות מוקדמות על ידי ניתוח מורפולוגיה של הכבד (שטח, נפח ושטח פנים), מורפולוגיה של תאים וגרעינים (אזור הפטוציטים, שטח גרעיני, יחס N:C, מעגליות גרעינית, ניקוד מיקרו-גרעיני/פריצה גרעינית) ואנגיוגנזה (צפיפות כלי דם). מיקרו-סביבה של תאי מערכת החיסון היא גם תכונה חשובה בהפטוקרצינוגנזה 11,12,13,14, ולכן אנו גם מראים כיצד לנתח את הרכב תאי מערכת החיסון בכבד בזחלי HCC הקשורים ל-NASH, תוך שימוש בקווי דגי זברה מהונדסים עם תאי חיסון מתויגים (נויטרופילים, מקרופאגים ותאי T). הטכניקות המתוארות הן ייחודיות למודל ושימושיות ביותר להערכת מיקרו-סביבה של הכבד והרכב תאי מערכת החיסון בהתקדמות מחלות כבד.
Protocol
Representative Results
Discussion
עם שכיחות מוגברת של HCC, במיוחד HCC המושרה על ידי NASH, יש חשיבות רבה למודלים יעילים יותר לחקר המנגנונים התאיים והמולקולריים המעורבים ב- HCC הקשור ל- NASH. פירוק של אינטראקציות בין תאים בכבד הוא חיוני כדי להבין טוב יותר את התקדמות מחלת הכבד ואת ההפטוקרצינוגנזה. הגישה המתוארת בפרוטוקול זה מציעה דרך ייחודית לנתח את התקדמות מחלת הכבד in vivo ולא פולשנית.
הכנת דיאטה היא קריטית להצלחה של הקמת מודל HCC הקשור ל-NASH. חשוב לתת לאתר דיאתיל להתאדות לחלוטין בתוך מכסה האדים כדי למנוע השפעות מזיקות, תוך הכנת דיאטות לדגי זברה. כדי להשתמש בדיאטות אלה עם זחלים (5-12 ימים לאחר ההפריה), חשוב מאוד לטחון את הדיאטות לחלקיקים עדינים כדי להבטיח את צריכת המזון על ידי הזחלים. ניתן להשתמש באנלוגים של חומצות שומן המתויגות באופן פלואורסצנטי כדי להעריך את צריכת המזון בזחלים.
לפני הכנסת הזחלים לתיבות הרבייה והתחלת הליך ההאכלה, חשוב לוודא שהדגימה הניסיונית אחידה על ידי ערבוב זחלים מצלחות שונות. שלב זה חשוב מאחר שמיקרו-סביבה שונה, החל מיום 0, מקודמת בכל אחת מהצלחות ועלולה להשפיע על התגובה הדלקתית.
צעד חשוב נוסף הוא לספור את הזחלים, כדי לדעת כמה מזון נדרש עבור כל קופסת האכלה. אם כמות המזון אינה מספקת למספר הזחלים הנמצאים בכל קופסה, יתרחש אחד משני התרחישים: 1) הזחלים יהיו בתת-תזונה; 2) הזחלים יהיו overfed. האכלה לא מדויקת תוביל למצבים לא בריאים הקשורים לתת תזונה או תזונת יתר, כגון דלקת, אשר תשפיע באופן דרסטי על המיקרו-סביבה של הכבד. אם מתרחשת האכלה לא מדויקת, הזחלים יראו בעיות תנועה. בשלב התפתחות זה, הזחלים צריכים לשחות באופן אינטנסיבי, ולכן אם מבחינים בבעיות תנועה הזחלים גודלו בתנאים לא בריאים (תת תזונה או חשיפה למינונים רעילים של כולסטרול עקב האכלת יתר). מסיבה זו, נהלי האכלה צריכים להיות מבוקרים היטב עבור דיאטות, נורמלי כולסטרול מועשר. ניתן לבצע כמה בדיקות כדי לטפל במהירות בדיוק ההזנה והבריאות של הזחלים כולל נוכחות של hepatomegaly (גודל הכבד) ודלקת של רקמות ואיברים, במיוחד כבד ומעי (חדירה מוגברת גלויה של נויטרופילים ומקרופאגים).
ניקוי יומי והחלפה של 95% מ-E3 הוא חיוני כדי להפחית את הצמיחה של מיקרואורגניזמים בקופסאות ההזנה ולשפר את בריאות הזחלים והישרדותם. לחלופין, ניתן למקם את הזחלים במערכת ארון תקשורת עצמאית. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, יש למקם 60-80 זחלים במיכל של 3 ליטר. שמור על זרימת מים ברמה המינימלית על ידי התאמת הזרימה למצב טפטוף מהיר והאכלת זחלים 3-4 מ”ג פעמיים ביום (AM ו- PM). יש לבדוק את זרימת המים באופן קבוע כדי להבטיח זרימה נכונה בכל מיכל. במעבדה שלנו, שיטה זו נותנת לנו 95-100% הישרדות עם הזנה לטווח קצר של 10% HCD. בנוסף, שיטה זו הפחיתה מאוד את עומס העבודה הטמון בניקוי היומיומי ובהחלפת המים הדרושים בפרוטוקול ההזנה הסטטית המתואר.
אמנם השתמשנו בתזונה מועשרת ב-10% כולסטרול כדי לגרום ל-NASH בחשיפה קצרת טווח (5 ימים מספיקים כדי לגרום לסטאטוהפטיטיס), אבל ניתן לבצע שינויים בתזונה ולהרחיב אותם כדי להשתמש בפרוקטוז 18, חומצות שומן (כגון חומצה פלמיטית)19, או פרוטוקולי הזנה שניתן להרחיב באמצעות תזונה מועשרת ב-4% בכולסטרול20. נכון לעכשיו, יש מעט מטרות טיפוליות מוצלחות עבור HCC ואף אחת מהן עבור NASH. השימוש במודלים של דגי זברה מציע הזדמנות ייחודית להרחיב את הידע שלנו על הפטוקרצינוגנזה, אך גם מערכת בעלי חוליות שאין דומה לה לביצוע בדיקות סמים בתפוקה גדולה. הטכניקות המתוארות בפרוטוקול זה יאפשרו ממצאים עתידיים ומטרות טיפוליות למחלות כבד והפטוקרצינוגנזה.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחבר מבקש להודות לטכנאי מתקן הליבה של מכללת אלברט איינשטיין לרפואה של דגי זברה קלינטון דה-פאולו וספרטק קלינין על סיוע ותחזוקה של קווי דגי הזברה שלנו. FJMN נתמך על ידי המכון לחקר הסרטן וקרן פיברולמלר לסרטן.
Materials
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | Easily degraded. Store -20°C. |
| Corning Netwells carrier kit 15 mm | Fisher | 07-200-223 | |
| Corning Netwells inserts | Fisher | 07-200-212 | |
| Diethyl ether | Fisher | 60-046-380 | Highly Volatile. |
| Dumont forceps #55 dumostar | Fisher | NC9504088 | |
| Fisherbrand Pasteur Pipets 5.75in | Fisher | 22-183624 | |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| Golden Pearl Diet 5–50 nm Active Spheres | Brine Shrimp Direct | – | Any commercial dry powder food for larvae can be used. |
| Graduated Transfer Pipets | Fisher | 22-170-404 | |
| Isopropanol | Fisher | BP26181 | |
| PBS, pH7.4, 10X, 10 Pack | Crystalgen | 221-1422-10 | |
| Petri Dishes 100X20MM | Fisher | 08-747D | |
| Tricaine | Sigma | A-5040 | |
| Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
| Oil Red O solution 0.5% isopropanol | Sigma | O1391-500ML | |
| Tricaine | Sigma | A-5040 | |
| Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
| Vactrap | VWR | 76207-630 | Vacuum system for larvae collection |
| Microscopes | |||
| Fluorescent Stereomicroscope | Leica | M205 FCA THUNDER Imager Model Organism Large | |
| Spinning Disk Confocal Microscope | Nikon | Nikon CSU-W1 | |
| Stereomicroscope | Leica | S9i with transilluminated base | |
| Software | |||
| Fiji | Open-source Java image processing program. | ||
| Imaris 9.6 | Bitplane; Oxford Instruments. |
Referências
- Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. Nonalcoholic Fatty Liver Disease-Related Hepatocellular Carcinoma: A Problem of Growing Magnitude. Seminals in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).
- El-Serag, H. B., Kanwal, F. Epidemiology of hepatocellular carcinoma in the United States: where are we? Where do we go. Hepatology. 60 (5), 1767-1775 (2014).
- Estes, C., et al. Modeling NAFLD disease burden in China, France, Germany, Italy, Japan, Spain, United Kingdom, and United States for the period 2016-2030. Journal of Hepatology. 69 (4), 896-904 (2018).
- Estes, C., Razavi, H., Loomba, R., Younossi, Z., Sanyal, A. J. Modeling the epidemic of nonalcoholic fatty liver disease demonstrates an exponential increase in burden of disease. Hepatology. 67 (1), 123-133 (2018).
- Meli, R., Mattace Raso, G., Calignano, A. Role of innate immune response in non-alcoholic Fatty liver disease: metabolic complications and therapeutic tools. Frontiers in Immunology. 5, 177 (2014).
- Ganz, M., et al. Progression of non-alcoholic steatosis to steatohepatitis and fibrosis parallels cumulative accumulation of danger signals that promote inflammation and liver tumors in a high fat-cholesterol-sugar diet model in mice. Journal of Translational Medicine. 13, 193 (2015).
- Ma, C., et al. NAFLD causes selective CD4(+) T lymphocyte loss and promotes hepatocarcinogenesis. Nature. 531 (7593), 253-257 (2016).
- Reimer, K. C., Wree, A., Roderburg, C., Tacke, F. New drugs for NAFLD: lessons from basic models to the clinic. Hepatology International. 14 (1), 8-23 (2020).
- Wrighton, P. J., Oderberg, I. M., Goessling, W. There is something fishy about liver cancer: Zebrafish models of hepatocellular carcinoma. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 8 (3), 347-363 (2019).
- Goessling, W., Sadler, K. C. Zebrafish: An important tool for liver disease research. Gastroenterology. 149 (6), 1361-1377 (2015).
- Huo, X., et al. Transcriptomic profiles of tumor-associated neutrophils reveal prominent roles in enhancing angiogenesis in liver tumorigenesis in zebrafish. Science Reports. 9 (1), 1509 (2019).
- Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. Tumor-associated neutrophils and macrophages promote gender disparity in hepatocellular carcinoma in zebrafish. Pesquisa do Câncer. 77 (6), 1395-1407 (2017).
- Capece, D., et al. The inflammatory microenvironment in hepatocellular carcinoma: A pivotal role for tumor-associated macrophages. Biomed Research International. 2013, 187204 (2013).
- de Oliveira, S., et al. Metformin modulates innate immune-mediated inflammation and early progression of NAFLD-associated hepatocellular carcinoma in zebrafish. Journal of Hepatology. 70 (4), 710-721 (2019).
- Huemer, K., et al. Long-term live imaging device for improved experimental manipulation of zebrafish larvae. Journal of Visualized Experiments. (128), e56340 (2017).
- Huemer, K., et al. zWEDGI: Wounding and entrapment device for imaging live zebrafish larvae. Zebrafish. 14 (1), 42-50 (2017).
- Evason, K. J., et al. Identification of chemical inhibitors of beta-catenin-driven liver tumorigenesis in zebrafish. PLoS Genetics. 11 (7), 1005305 (2015).
- Sapp, V., Gaffney, L., EauClaire, S. F., Matthews, R. P. Fructose leads to hepatic steatosis in zebrafish that is reversed by mechanistic target of rapamycin (mTOR) inhibition. Hepatology. 60 (5), 1581-1592 (2014).
- Park, K. H., Ye, Z. W., Zhang, J., Kim, S. H. Palmitic acid-enriched diet induces hepatic steatosis and injury in adult zebrafish. Zebrafish. 16 (6), 497-504 (2019).
- Progatzky, F., et al. Dietary cholesterol directly induces acute inflammasome-dependent intestinal inflammation. Nature Communication. 5, 5864 (2014).
