تحليل البيئة الدقيقة للكبد أثناء التقدم المبكر لسرطان الخلايا الكبدية المرتبط بمرض الكبد غير الكحولي في أسماك الزرد
Summary
هنا ، نقدم كيفية توليد نموذج الزرد المرتبط بمرض الكبد الدهني غير الكحولي (NAFLD) المرتبط بسرطان الخلايا الكبدية (HCC) لدراسة تأثير فائض الكوليسترول على البيئة الدقيقة للكبد ومشهد الخلايا المناعية.
Abstract
سرطان الكبد هو حاليا السبب الرئيسي الثالث للوفاة المرتبطة بالسرطان في جميع أنحاء العالم، وسرطان الخلايا الكبدية (HCC) يمثل 75-90٪ من جميع حالات سرطان الكبد. مع إدخال علاجات فعالة للوقاية من التهاب الكبد B / C وعلاجه ، أصبح مرض الكبد الدهني غير الكحولي (NAFLD) ، والشكل الأكثر عدوانية المعروف باسم التهاب الكبد الدهني غير الكحولي (NASH) ، بسرعة عوامل الخطر رقم واحد لتطوير HCC في المجتمعات الحديثة. لفهم الدور الذي تلعبه NASH بشكل أفضل في تطوير HCC ، قمنا بتصميم سمكة حمار وحشي HCC مرتبطة ب NASH. الوضوح البصري والجاذبية الجينية ليرقات الزرد تجعلها نموذجا جذابا وقويا لدراسة البيئة الدقيقة للكبد وتكوين الخلايا المناعية باستخدام التصوير الحي الفلوري غير الغازي. يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام نموذج الزرد HCC المرتبط ب NASH للتحقيق في تأثير فائض الكوليسترول في البيئة الدقيقة للكبد وتأثيره على تكوين الخلايا المناعية في المراحل المبكرة من المرض. أولا ، نقوم بتغذية يرقات HCC (s704Tg) ، والتي تعبر عن بيتا كاتينين المنشط الخاص بخلايا الكبد ، مع اتباع نظام غذائي عالي الكوليسترول بنسبة 10٪ لمدة 8 أيام لتطوير نموذج HCC المرتبط ب NASH. هنا نصف كيفية الاستفادة من الخطوط المعدلة وراثيا المختلفة لتقييم العديد من ميزات الأورام الخبيثة المبكرة في الكبد عن طريق المجهر البؤري غير الغازي ، مثل منطقة الكبد والخلية والمورفولوجيا النووية (منطقة خلايا الكبد ، المنطقة النووية ، النسبة النووية: السيتوبلازمية (نسبة N: C) ، الدائرية النووية ، تسجيل النوى الدقيقة / الفتق النووي) وتكوين الأوعية. ثم ، باستخدام خطوط معدلة وراثيا مع خلايا مناعية موسومة (العدلات ، البلاعم ، والخلايا التائية) ، نوضح كيفية تحليل تكوين خلايا الكبد المناعية في يرقات HCC المرتبطة ب NASH. التقنيات الموصوفة مفيدة لتقييم البيئة الدقيقة للكبد وتكوين الخلايا المناعية في مراحل تكوين الكبد المبكرة ، ولكن يمكن أيضا تعديلها لدراسة هذه الميزات في نماذج أمراض الكبد الأخرى.
Introduction
سرطان الخلايا الكبدية (HCC) هو سرطان عدواني مع خيارات علاجية محدودة. وقد وجد أن أكثر من 30٪ من جميع المرضى الذين يعانون من HCC يعانون من السمنة المفرطة ولديهم NASH ، وهو شكل عدواني من NAFLD1،2،3،4. استهلاك الوجبات الغذائية الغنية بالسعرات الحرارية يزيد بشكل كبير من توافر الأحماض الدهنية التي تسبب تحولات الأيض المحلية والجهازية وتؤدي إلى تنكس دهني ، وإصابة خلايا الكبد ، والالتهاب ، والتليف – وكلها ميزات رئيسية ل NASH. يتضمن تقدم NASH إلى HCC تراكم الدهون في الكبد ، مما يؤدي إلى التهاب وتغيير تكوين الخلايا المناعية5،6،7. من الأهمية بمكان والأهمية بمكان فهم كيفية تغيير البيئة الدقيقة للكبد ومشهد الخلايا المناعية أثناء تطور أمراض الكبد ، وكيف تتغير بسبب بعض العوامل المسببة. لتحديد تأثير فائض الكوليسترول بشكل أفضل على البيئة الدقيقة للكبد ومشهد الخلايا المناعية ، قمنا بتطوير نموذج فريد من نوعه لسمك الزرد من HCC المرتبط ب NASH. لقد أعطانا استخدام هذا النموذج فهما أفضل لتأثير النظام الغذائي والتغذية الزائدة على البيئة الدقيقة للكبد وتطور أمراض الكبد.
كانت نماذج الثدييات ، مثل الفئران وعينات الأنسجة البشرية ، ضرورية في فهم التسبب في التهاب الكبد الدهني و steatosis8. الفئران هي النموذج المفضل لأمراض الكبد والسرطان ، لكنها تفتقر إلى الوضوح البصري على المستوى الخلوي ، في حين أن عينات الأنسجة البشرية غالبا ما تفتقر إلى بيئة 3D التي تستطيع النماذج الحيوانية تقليدها. وقد جعلت هذه العقبات من الزرد نموذجا قويا في مجتمع البحوث. الزرد لديها أوجه تشابه ملحوظة مع البشر ، مع الحفاظ على الجينات بنسبة 70٪ على الأقل. أنها تحافظ على البيئة الدقيقة للكبد ، والتركيب الخلوي الكبدي ، والوظيفة ، والإشارات ، والاستجابة للإصابات 9,10. باستخدام نظام غذائي عالي الكوليسترول (HCD) بالاشتراك مع نموذج الزرد المعدل وراثيا من HCC ، قمنا بتطوير نموذج الزرد من HCC المرتبط ب NASH.
نقدم هنا بروتوكولا يشرح كيفية إنشاء نموذج الزرد HCC المرتبط ب NASH وكيفية دراسة البيئة الدقيقة للكبد ومعالجة ميزات الورم الخبيث المبكر في الجسم الحي. باستخدام المجهر البؤري غير الغازي بالاشتراك مع الخطوط المعدلة وراثيا لأسماك الزرد مع غشاء ونواة خلايا الكبد الموسومة بالفلورسنت ، يمكننا معالجة ميزات الورم الخبيث المبكر من خلال تحليل مورفولوجيا الكبد (المساحة والحجم ومساحة السطح) ، ومورفولوجيا الخلايا والنووية (منطقة خلايا الكبد ، المنطقة النووية ، نسبة N: C ، الدائرية النووية ، تسجيل النوى الدقيقة / الفتق النووي) وتكوين الأوعية (كثافة الأوعية). البيئة الدقيقة للخلايا المناعية هي أيضا ميزة مهمة في تكوين الكبد11،12،13،14 ، لذلك ، نعرض أيضا كيفية تحليل تكوين الخلايا المناعية للكبد في يرقات HCC المرتبطة ب NASH ، باستخدام خطوط الزرد المعدلة وراثيا مع الخلايا المناعية الموسومة (العدلات ، البلاعم ، والخلايا التائية). التقنيات الموصوفة فريدة من نوعها للنموذج ومفيدة للغاية لتقييم البيئة الدقيقة للكبد وتكوين الخلايا المناعية في تطور أمراض الكبد.
Protocol
Representative Results
Discussion
مع زيادة حدوث HCC ، وتحديدا HCC الناجم عن NASH ، من الأهمية بمكان أن يكون لديك نماذج أكثر كفاءة لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية المشاركة في HCC المرتبطة ب NASH. يعد فك الالتفاف بين التفاعلات بين الخلايا والخلايا في الكبد أمرا بالغ الأهمية لفهم تطور أمراض الكبد وتكوين الكبد بشكل أفضل. يوفر النهج الموصوف في هذا البروتوكول طريقة فريدة لتحليل تطور أمراض الكبد في الجسم الحي وغير الغازي.
يعد إعداد النظام الغذائي أمرا بالغ الأهمية لنجاح إنشاء نموذج HCC المرتبط ب NASH. من المهم السماح لثنائي إيثيل الأثير بالتبخر تماما داخل غطاء الدخان لتجنب الآثار الضارة ، أثناء إعداد الوجبات الغذائية لسمك الزرد. لاستخدام هذه الوجبات الغذائية مع اليرقات (5-12 يوما بعد الإخصاب) ، من المهم للغاية طحن الوجبات الغذائية إلى جزيئات دقيقة لضمان تناول الطعام من قبل اليرقات. يمكن استخدام نظائر الأحماض الدهنية الموسومة بالفلورسنت لتقييم تناول الطعام في اليرقات.
قبل وضع اليرقات في صناديق التكاثر وبدء إجراء التغذية ، من الأهمية بمكان التأكد من توحيد العينات التجريبية عن طريق خلط اليرقات من لوحات مختلفة. هذه الخطوة مهمة لأن البيئات الدقيقة المختلفة ، بدءا من اليوم 0 ، يتم الترويج لها في كل لوحة من اللوحات وقد تؤثر على الاستجابة الالتهابية.
خطوة أخرى مهمة هي حساب اليرقات ، لمعرفة كمية الطعام اللازمة لكل صندوق تغذية. إذا كانت كمية الغذاء غير كافية لعدد اليرقات الموجودة في كل صندوق ، فسيحدث أحد السيناريوهين: 1) ستعاني اليرقات من نقص التغذية. 2) سيتم الإفراط في تغذية اليرقات. ستؤدي التغذية غير الدقيقة إلى ظروف غير صحية مرتبطة بسوء التغذية أو الإفراط في التغذية ، مثل الالتهاب ، مما سيؤثر بشكل كبير على البيئة الدقيقة للكبد. في حالة حدوث تغذية غير دقيقة ، ستظهر اليرقات مشكلات في الحركة. في مرحلة التطور هذه ، يجب أن تسبح اليرقات بشكل مكثف ، لذلك إذا لوحظت مشاكل في الحركة ، فقد أثيرت اليرقات في ظل ظروف غير صحية (سوء التغذية أو التعرض لجرعات سامة من الكوليسترول بسبب الإفراط في التغذية). لهذا السبب ، يجب التحكم في إجراءات التغذية بإحكام لكل من الوجبات الغذائية ، الطبيعية والمخصبة بالكوليسترول. يمكن إجراء بعض الفحوصات لمعالجة دقة تغذية وصحة اليرقات بسرعة بما في ذلك وجود تضخم الكبد (حجم الكبد) والتهاب الأنسجة والأعضاء ، وخاصة الكبد والأمعاء (زيادة واضحة في تسلل العدلات والبلاعم).
يعد التنظيف اليومي واستبدال 95٪ من E3 أمرا محوريا للحد من نمو الكائنات الحية الدقيقة في صناديق التغذية وتحسين صحة اليرقات وبقائها. بدلا من ذلك ، يمكن وضع اليرقات في نظام حامل مستقل. للحصول على أفضل النتائج ، ضع 60-80 يرقات في خزان سعة 3 لترات. حافظ على تدفق المياه عند الحد الأدنى من المستوى عن طريق ضبط التدفق على وضع التنقيط السريع وتغذية اليرقات 3-4 ملغ مرتين في اليوم (صباحا ومساء). يجب فحص تدفق المياه بانتظام لضمان التدفق الصحيح في كل خزان. في مختبرنا ، تعطينا هذه الطريقة البقاء على قيد الحياة بنسبة 95-100٪ مع تغذية قصيرة الأجل بنسبة 10٪ HCD. بالإضافة إلى ذلك ، قللت هذه الطريقة بشكل كبير من عبء العمل المتأصل في التنظيف اليومي وتبادل المياه الضروري في بروتوكول التغذية الثابتة الموصوف.
بينما استخدمنا نظاما غذائيا غنيا بالكوليسترول بنسبة 10٪ لتحفيز NASH في التعرض على المدى القصير (5 أيام كافية للحث على التهاب الكبد الدهني) ، يمكن إجراء تعديلات النظام الغذائي وتوسيعها لاستخدام الفركتوز 18 ، أو الأحماض الدهنية (مثل حمض البالمتيك) 19 ، أو بروتوكولات التغذية التي يمكن تمديدها باستخدام نظام غذائي غني بالكوليسترول بنسبة 4٪20. حاليا ، هناك عدد قليل من الأهداف العلاجية الناجحة ل HCC ولا شيء ل NASH. يوفر استخدام نماذج الزرد فرصة فريدة لتوسيع معرفتنا حول تكوين الكبد ولكن أيضا نظام الفقاريات غير المسبوق لإجراء فحوصات كبيرة للعقاقير. ستسهل التقنيات الموصوفة في هذا البروتوكول النتائج المستقبلية والأهداف العلاجية لأمراض الكبد وتكوين الكبد.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلف أن يعرب عن تقديره لفنيي مرفق الزرد الأساسي في كلية ألبرت أينشتاين للطب كلينتون ديباولو وسبارتاك كالينين للمساعدة والصيانة لخطوط أسماك الزرد لدينا. يتم دعم FJMN من قبل معهد أبحاث السرطان ومؤسسة سرطان Fibrolamellar.
Materials
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | Easily degraded. Store -20°C. |
| Corning Netwells carrier kit 15 mm | Fisher | 07-200-223 | |
| Corning Netwells inserts | Fisher | 07-200-212 | |
| Diethyl ether | Fisher | 60-046-380 | Highly Volatile. |
| Dumont forceps #55 dumostar | Fisher | NC9504088 | |
| Fisherbrand Pasteur Pipets 5.75in | Fisher | 22-183624 | |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| Golden Pearl Diet 5–50 nm Active Spheres | Brine Shrimp Direct | – | Any commercial dry powder food for larvae can be used. |
| Graduated Transfer Pipets | Fisher | 22-170-404 | |
| Isopropanol | Fisher | BP26181 | |
| PBS, pH7.4, 10X, 10 Pack | Crystalgen | 221-1422-10 | |
| Petri Dishes 100X20MM | Fisher | 08-747D | |
| Tricaine | Sigma | A-5040 | |
| Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
| Oil Red O solution 0.5% isopropanol | Sigma | O1391-500ML | |
| Tricaine | Sigma | A-5040 | |
| Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
| Vactrap | VWR | 76207-630 | Vacuum system for larvae collection |
| Microscopes | |||
| Fluorescent Stereomicroscope | Leica | M205 FCA THUNDER Imager Model Organism Large | |
| Spinning Disk Confocal Microscope | Nikon | Nikon CSU-W1 | |
| Stereomicroscope | Leica | S9i with transilluminated base | |
| Software | |||
| Fiji | Open-source Java image processing program. | ||
| Imaris 9.6 | Bitplane; Oxford Instruments. |
Referências
- Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. Nonalcoholic Fatty Liver Disease-Related Hepatocellular Carcinoma: A Problem of Growing Magnitude. Seminals in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).
- El-Serag, H. B., Kanwal, F. Epidemiology of hepatocellular carcinoma in the United States: where are we? Where do we go. Hepatology. 60 (5), 1767-1775 (2014).
- Estes, C., et al. Modeling NAFLD disease burden in China, France, Germany, Italy, Japan, Spain, United Kingdom, and United States for the period 2016-2030. Journal of Hepatology. 69 (4), 896-904 (2018).
- Estes, C., Razavi, H., Loomba, R., Younossi, Z., Sanyal, A. J. Modeling the epidemic of nonalcoholic fatty liver disease demonstrates an exponential increase in burden of disease. Hepatology. 67 (1), 123-133 (2018).
- Meli, R., Mattace Raso, G., Calignano, A. Role of innate immune response in non-alcoholic Fatty liver disease: metabolic complications and therapeutic tools. Frontiers in Immunology. 5, 177 (2014).
- Ganz, M., et al. Progression of non-alcoholic steatosis to steatohepatitis and fibrosis parallels cumulative accumulation of danger signals that promote inflammation and liver tumors in a high fat-cholesterol-sugar diet model in mice. Journal of Translational Medicine. 13, 193 (2015).
- Ma, C., et al. NAFLD causes selective CD4(+) T lymphocyte loss and promotes hepatocarcinogenesis. Nature. 531 (7593), 253-257 (2016).
- Reimer, K. C., Wree, A., Roderburg, C., Tacke, F. New drugs for NAFLD: lessons from basic models to the clinic. Hepatology International. 14 (1), 8-23 (2020).
- Wrighton, P. J., Oderberg, I. M., Goessling, W. There is something fishy about liver cancer: Zebrafish models of hepatocellular carcinoma. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 8 (3), 347-363 (2019).
- Goessling, W., Sadler, K. C. Zebrafish: An important tool for liver disease research. Gastroenterology. 149 (6), 1361-1377 (2015).
- Huo, X., et al. Transcriptomic profiles of tumor-associated neutrophils reveal prominent roles in enhancing angiogenesis in liver tumorigenesis in zebrafish. Science Reports. 9 (1), 1509 (2019).
- Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. Tumor-associated neutrophils and macrophages promote gender disparity in hepatocellular carcinoma in zebrafish. Pesquisa do Câncer. 77 (6), 1395-1407 (2017).
- Capece, D., et al. The inflammatory microenvironment in hepatocellular carcinoma: A pivotal role for tumor-associated macrophages. Biomed Research International. 2013, 187204 (2013).
- de Oliveira, S., et al. Metformin modulates innate immune-mediated inflammation and early progression of NAFLD-associated hepatocellular carcinoma in zebrafish. Journal of Hepatology. 70 (4), 710-721 (2019).
- Huemer, K., et al. Long-term live imaging device for improved experimental manipulation of zebrafish larvae. Journal of Visualized Experiments. (128), e56340 (2017).
- Huemer, K., et al. zWEDGI: Wounding and entrapment device for imaging live zebrafish larvae. Zebrafish. 14 (1), 42-50 (2017).
- Evason, K. J., et al. Identification of chemical inhibitors of beta-catenin-driven liver tumorigenesis in zebrafish. PLoS Genetics. 11 (7), 1005305 (2015).
- Sapp, V., Gaffney, L., EauClaire, S. F., Matthews, R. P. Fructose leads to hepatic steatosis in zebrafish that is reversed by mechanistic target of rapamycin (mTOR) inhibition. Hepatology. 60 (5), 1581-1592 (2014).
- Park, K. H., Ye, Z. W., Zhang, J., Kim, S. H. Palmitic acid-enriched diet induces hepatic steatosis and injury in adult zebrafish. Zebrafish. 16 (6), 497-504 (2019).
- Progatzky, F., et al. Dietary cholesterol directly induces acute inflammasome-dependent intestinal inflammation. Nature Communication. 5, 5864 (2014).
