바이러스 감염시 ^m6A 및 ^m5C 에피레미테롬 탐험: HIV를 가진 예

1. 세포 준비 참고: 세포 유형 및 RNA 함량에 따라 세포의 시작 수는 다를 수 있습니다. 총 RNA의 200-500 μg 또는 다중 A 선택 RNA의 5-7 μg 사이에서 얻을 수 있는 충분한 세포가 있다. 예를 들어, 50 x 106 SupT1 세포는 페놀 기반 시약을 추출할 때 총 RNA의 약 500 μg를 산출해야 하며, 따라서 테스트된 각 개별 조건에 대해 요구된다. 실험 설계에 따라 필요한 수의 세포를 준비하여, 따라서 시험된 조건의 수에 따라서 (감염, 정점, 처리). 실험이 감염되지 않은 세포와 HIV 감염 세포를 24시간 감염 후 에서 얻는 것을 목표로 하는 경우 총 100 x 106 세포가 필요하며, 절반은 감염되지 않은 상태의 경우 절반, 감염된 상태의 절반은 필요합니다. 2. RNA 추출 세포에서: 페놀 클로로폼을 가진 RNA 추출 각 조건에 대해, 원심 분리에 의해 세포 (예를 들어,50 x 106)를 수집하고 상체를 폐기합니다. 각 50 x 106 셀 펠릿에 페놀 기반 시약 5mL을 추가하고 여러 번 위아래로 파이프를 사용하여 혼합합니다. 실온에서 5분 동안 배양하여 완전한 용해를 허용합니다. Lysed 세포는 -80 °C에 저장하거나 직접 처리 할 수 있습니다.참고: 필요한 경우, 세포는 1.5mL 튜브에서 튜브 당 10 x 106 세포의 알리쿼트로 분할되고 보다 편리한 저장을 위해 페놀 기반 시약 1mL로 용액될 수 있습니다. 클로로폼 1mL을 넣고 반전으로 섞습니다. 실온에서 3분 동안 배양하십시오. 2,000 x g 및 4 °C에서 15 분 동안 원심 분리기. 수성 상(상층)을 피펫하고 새로운 튜브로 이송합니다. 튜브를 45°로 기울여 수성 위상을 옮기고 조심스럽게 용액을 피펫으로 마무리하십시오.참고: 수성 상의 양은 샘플마다 다를 수 있지만 시료에 첨가된 클로로폼의 양 (즉, 1mL)에 가깝어야 합니다. 어떤 단계 또는 유기 층을 전송하지 마십시오! 위상 잠금 또는 위상 메이커 튜브를 사용하면 이 프로세스를 용이하게 할 수 있습니다. 수성 상에 100% 분자 급 이소프로판올의 0.5 mL를 추가합니다. RNA 강수량을 허용하기 위해 -80°C에서 1시간 동안 배양한다. 12,000 x g 및 4°C에서 10분 동안 원심분리기를 사용하여 침전된 RNA를 펠릿합니다. 상체를 버리고 RNA 펠릿을 75% 분자 생물학 등급 에탄올의 1 mL에서 재중단한다. 소용돌이가 짧게. 7,500 x g 및 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리기를 하고 상체를 폐기하십시오. 펠릿을 15분 동안 공기 건조시합니다. RNase가 없는 물의 20 μL에서 펠릿을 다시 중단하고 새로운 튜브로 옮습니다. 빈 튜브를 추가로 20 μL의 물로 씻어 RNA 복구를 최대화하고 처음 20 μL 부피를 사용하여 풀을 하십시오. 분광계로 총 RNA를 정량화하고 단편 분석기로 RNA 품질을 평가합니다. 바이러스 성 입자에서: 컬럼 기반 바이러스 RNA 추출 키트와 RNA 추출참고: 페놀 기반 시약을 가진 바이러스 성 입자에서 RNA 추출은 낮은 품질의 바이러스 RNA와 낮은 품질의 라이브러리에서 발생합니다. 따라서 컬럼 기반 RNA 추출을 선호해야 한다. RNA 용출 및 회수를 위한 담체 RNA를 이용한 RNA 추출 키트는 이 절차에 적합하지 않으며 피해야 합니다. HIV RNA는 폴리-아데닐화되기 때문에, 추가 mRNA 절연 없이 직접 RNA 추출은 MeRIP-Seq 및 BS-Seq 파이프라인에 들어가기에 충분합니다. 보편적으로 감염된 세포로부터의 바이러스 성 상피물의 일반적으로 1-2 mL은 전체 워크플로우를 수행하기에 충분한 RNA를 제공해야한다. 30mL의 용해 버퍼에 베타-메르카토에탄올 150 μL을 추가하여 버퍼를 준비합니다. 100% 에탄올의 96mL를 추가하여 바이러스 성 세척 버퍼를 재구성합니다. 바이러스가 함유된 수퍼나티와 원심분리기를 수집하여 세포 이물질을 펠릿하여 세포 RNA 오염을 최소화합니다. 15 mL 튜브에 바이러스 성 상류체의 1 mL을 전송합니다. 바이러스 RNA 버퍼 3mL을 바이러스 성 샘플 1 mL에 넣고 소용돌이에 섞습니다. 수집 튜브에 삽입된 컬럼에 700 μL의 샘플을 전송합니다. 상온에서 13,000 x g에서 2 분 동안 원심 분리기. 흐름을 삭제합니다. 전체 샘플이 처리될 때까지 3개의 이전 단계를 반복하여 모든 RNA가 실리카 계 매트릭스 컬럼상에 포획되었다. 열에 바이러스 세척 버퍼 500 μL을 추가합니다. 상온에서 10,000 x g에서 1 분 동안 원심 분리기. 흐름을 삭제합니다. 열에 바이러스 세척 버퍼 200 μL을 추가합니다. 상온에서 10,000 x g에서 1 분 동안 원심 분리기. 흐름을 삭제합니다. 열을 빈 수집 튜브에 넣습니다. 원심분리기는 실온에서 10,000 x g에서 1분 동안 원심분리기를 사용하여 남은 세척 완충물질 오염 물질을 더 폐기합니다. 조심스럽게 1.5 mL 튜브로 컬럼을 전송합니다. 실온에서 30s에 대한 열 매트릭스와 원심 분리기의 중심에 직접 DNase / RNase가없는 물의 20 μL을 추가합니다. 열 매트릭스의 중앙에 직접 DNase/RNase가 없는 물의 10μL을 추가하고 원심분리기를 다시 30초 동안 추가로 추가합니다. 분광계로 총 RNA를 정량화하고 단편 분석기로 RNA 품질을 평가합니다.참고: RNA 추출은 검색된 RNA의 품질이 높은 경우, RNA 무결성/품질 번호 > 9를 사용하여 임의의 방법으로 수행될 수 있다. 총 RNA는 추가 처리될 때까지 -80°C에서 저장할 수 있습니다. 3. oligo (dT)25와 폴리 A 선택에 의해 mRNA 절연 참고: 세포 추출물에서 고도로 메틸화된 리보소말 RNA의 존재로 인해, rRNA 고갈또는 폴리-A 양성 선택에 의해 폴리-A RNA를 우선적으로 분리하는 것이 좋습니다. 이 단계는 선택 사항이며 세포 RNA 샘플만 수행하여 더 높은 해상도로 시퀀싱 결과를 얻어야 합니다. 비 다중 아데닐라기 바이러스 RNA의 메틸화를 분석하는 경우, 폴리-A 선택보다는 rRNA 고갈을 선호하거나 결국 총 RNA에 대한 분석을 수행한다. 폴리 A 캡처를위한 비드 준비 올리고 (dT)25 마그네틱 비즈 주식 바이알을 >30 s에 대한 소용돌이를 다시 중단합니다. 자기 구슬 200 μL을 1.5mL 튜브로 옮기습니다. 처리될 RNA 샘플의 총 수량에 따라 자기 구슬이 있는 튜브수를 준비한다.참고: 다이나비드 스톡 용액200μL을 가진 튜브 1개는 구슬 1mg에 해당하며 총 RNA 75μg 샘플을 수용할 수 있습니다. 튜브를 자석에 1분 동안 놓고 상체를 폐기합니다. 자석에서 튜브를 제거합니다. 바인딩 버퍼 1mL(20m Tris-HCl, pH 7.5, 1.0 M LiCl, 2mM EDTA)를 추가하고 소용돌이에 의해 재중단됩니다. 자석에 튜브를 1분 동안 놓고 상체를 폐기합니다. 자석에서 튜브를 제거합니다. 반복하다. 바인딩 버퍼의 100 μL에서 세척 된 자기 구슬을 다시 일시 중지합니다. 총 RNA 제제 75 μg/100 μL에 해당하는 RNase 가 없는 물로 총 RNA를 0.75 μg/μL의 최종 농도로 희석시 희석시.참고: RNA가 농도가 낮은 경우 볼륨을 수정하지 않고 아래에 설명된 대로 진행합니다. Aliquot는 튜브 당 RNA 샘플 의 100 μL을 분배하여 다중 튜브에서 총 RNA를 인용합니다. 각 RNA 샘플에 결합 버퍼 100 μL을 추가합니다. 총 RNA를 65°C로 가열하여 2분 동안 가열하여 이차 구조를 방해합니다. 다음 단계로 나아갈 준비가 될 때까지 얼음 위에 즉시 놓습니다.참고: 인큐베이션 시간은 처리되는 시료의 수에 따라 달라질 수 있지만 RNA 분해를 피하기 위해 1h를 초과해서는 안 됩니다. 폴리-A 선택 각 RNA 튜브(3.2단계에서)에 세척된 자기 구슬 100μL를 추가합니다(3.1단계에서). 위아래로 파이프를 돌리면 철저히 섞어서 실온에서 회전하는 휠에 15분 동안 바인딩을 허용합니다. 모든 튜브를 열고 자석에 1 분 동안 놓고 모든 상퍼를 조심스럽게 제거하십시오. 새로운 튜브에서 상체를 회수하고 폴리-A 최종 회복을 개선하기 위해 두 번째 RNA 포획(Step 3.3.14)을 위해 제쳐두십시오. 자석에서 튜브를 제거하고 세척 버퍼의 200 μL을 추가 (10m Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 M LiCl, 1 mM EDTA). 조심스럽게 4 ~ 5 번 파이펫으로 섞는다. 튜브를 자석에 1분 동안 놓고 상체를 폐기합니다. 세척 단계를 한 번 반복합니다(반복 단계 3.3.5 및 3.3.6). 비드에서 폴리-A RNA를 엘루트하기 위해 얼음 감기 10m Tris-HCl 20 μL을 추가합니다. 80 °C에서 2 분 동안 인큐베이션하십시오. 자석에 튜브를 놓고 폴리-A RNA를 함유한 상체를 새로운 RNase 가 없는 튜브로 신속하게 이송합니다. 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 용출 단계(단계 3.3.8 내지 3.3.10)를 반복하여 수율을 늘립니다. 세탁 버퍼 200 μL로 동일한 구슬을 한 번 씻으시면 됩니다. 조심스럽게 4 ~ 5 번 파이펫으로 섞는다. 자석에 1분 동안 놓고 세척 버퍼를 버리십시오. 3.3.4 단계에서 유량을 구슬에 추가하고 구속력에서 용출까지의 절차를 반복합니다(3.3.2 ~ 3.10 단계). RNA용용유는 당분간 별도의 튜브에 보관하십시오.참고: 선택적으로, 컨트롤로 사용할 수 있으므로 새 튜브에서 3.3.4 단계와 동등한 상체를 다시 유지합니다. 절차의 끝에서, 에탄올 강수량 또는 선택의 컬럼 기반 방법 (즉, RNA 청소 및 농축기)에 의해 RNA를 정화하고 농축한다. 이 샘플은 다중 A-고갈 된 RNA 샘플에 대응하고 bisulfite 변환을위한 제어로 사용될 수있다 (단계 8.2.2). 용출된 RNA를 분광광계로 정량화하고 2 μL 알리쿼트를 유지하여 단편 분석기로 RNA 품질을 더욱 평가합니다.참고: 폴리-A RNA는 필요할 때까지 -80°C에 보관할 수 있다. 4. RNA 워크플로우 세포 폴리-A RNA(mRNA) 및 바이러스 RNA 샘플을 각각의 상피 분석 파이프라인에 전념하는 2개의 알리쿼트로 나눕니다.(i) 세포 mRNA 5 μg 또는 MeRIP-Seq 및 입력 제어를 위한 바이러스 RNA 의 1 μg (단계 5 ~ 7, 및 단계 9로 이동).(ii) BS-Seq에 대한 바이러스 RNA의 세포 mRNA 또는 500 ng의 1 μg (8 단계 및 9단계로 이동). 5. RNA 단편화 참고: RNA 단편화는 RNA 단편화 시약으로 수행되며 MeRIP-Seq 및 제어 RNA 샘플을 위한 것입니다. 이것은 100-200 nt 사이의 조각을 얻기 위해 신중한 최적화가 필요한 매우 중요한 단계입니다. mRNA의 총 부피를 mRNA/튜브의 18 μL로 0.2 mL PCR 튜브로 나눕니다.참고: 신속하게 작업할 수 있습니다. 재현 가능한 결과를 얻으려면 한 번에 8개 이상의 샘플로 작업하지 마십시오. 볼륨을 확장해도 재현 가능하고 균일한 조각화를 보장하지는 않습니다. 70°C에서 열순환기를 데우겠습니다. 각 PCR 튜브의 가장자리에 조각화 시약 2 μL을 추가합니다. 튜브를 닫고 스핀 다운하십시오 (시약이 8 개의 튜브에 대해 동시에 RNA와 접촉하게됩니다). 예열된 열순환기에서 70°C에서 15분 동안 시료를 배양한다. 인큐베이션이 끝난 즉시 각 튜브에 2 μL의 정지 용액을 빠르게 추가합니다. 스핀 다운하고 다음 단계로 진행할 준비가 될 때까지 얼음에 앉아 보자.참고: 인큐베이션 시간은 처리되는 시료의 수에 따라 달라질 수 있지만 RNA 분해를 피하기 위해 1h를 초과해서는 안 됩니다. 모든 샘플에 대한 절차를 반복합니다(8개 이상의 알리쿼트가 있는 경우). 튜브를 함께 풀링하고 RNA 청정 및 농축기 키트(6단계) 또는 맞춤형 컬럼 기반 키트로 RNA 정화를 진행하여 버퍼를 제거하고 물에 있는 깨끗한 단편화된 RNA를 회수합니다. 6. RNA 정화 참고: 이 단계는 에탄올 침전 또는 임의의 종류의 컬럼 기반 RNA 정제 및 농도 방법(즉, RNA 클린 및 농축기)에 의해 수행될 수 있다. 엘ute 또는 DNase /RNase가없는 물의 총 부피 50-75 μL의 정제 된 RNA를 다시 중단합니다.참고: 열 기반 방법을 사용하는 경우 최대 복구를 위해 두 라운드의 용출을 강력하게 권장합니다. 분광계로 정제된 단편화된 mRNA를 정량화하고 단편 분석기로 RNA 품질을 평가한다. 라이브러리 준비 및 시퀀싱을 위한 입력 컨트롤로 조각화된 mRNA 100 ng를 유지합니다(9단계로 이동). 나머지 단편화된 mRNA(최소 2.5 μg)는 MeRIP(7.2단계로 이동)에 사용할 수 있습니다. 7. 메립 참고: 단편화된 mRNA의 최소 2.5μg은 각 면역침전수(IP)에 필요하며, 특정 항m6A 항체(test condition)를 사용하거나 안티-IgG 항체(음성 제어)를 사용한다. 면역 침전을위한 자기 비드 준비 각 시료에 대해, mRNA IP 완충제 5배(50m Tris-HCl pH 7.4, 750mMM NaCl, 0.5% Igepal CA-630, 뉴클레아스 프리 워터)의 800 μL을 3.2mL의 뉴클레아스 워터로 희석하여 새로운 원내 튜브에 1x IP 버퍼 4mL를 준비한다.참고: 적어도 2개의 반응이 필요합니다(테스트 1회 및 IgG 제어 1개). 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 원하는 IP 반응 수에 대해 1.5mL 마이크로원심분리기 튜브의 적절한 수에 라벨을 부착하십시오.항m6A 항체용 n관(test).일반 마우스 IgG용 n 튜브(음수 제어) 반전 및 소용돌이에 의해 자기 구슬 (예를 들어, Magna ChIP 단백질 A/G)을 다시 중단합니다. 구슬 덩어리를 볼 수 없습니다. 계획된 각 반응에 대해, 자기 구슬의 25 μL을 마이크로 센심분리기 튜브로 옮기다. 사용된 구슬의 원래 부피(즉, 자기 비드의 25 μL 당 1배 IP 버퍼의 250 μL)에 대하여 10배 더 많은 1배 IP 버퍼(단계 7.1.1)를 추가합니다. 구슬을 여러 번 부드럽게 배관하여 혼합하여 완전한 재서스펜션을 합니다. 1 분 동안 자기 분리기에 튜브를 배치합니다. 체퍼를 제거하고 폐기하여 자기 구슬을 흡인하지 않도록 하십시오. 자석에서 튜브를 제거합니다. 세척 단계를 반복합니다(7.1.6~ 7.1.9단계). 구슬의 원래 부피의 25 μL 당 1배 IP 버퍼의 100 μL로 구슬을 재연한다. 자기 구슬의 원래 부피의 25 μL 당 항체의 5 μL (1 μg/μL)를 추가합니다.항m6A 항체(클론 17-3-4-1) [1 μg/μL]을 가진 n 관(test).일반 마우스 IgG (1 μg /μL)와 n 튜브 (음수 제어). 자기 구슬과 항체의 연상을 허용하기 위해 실온에서 30 분 동안 회전 휠에 배양. 1 분 동안 자기 분리기에 튜브를 배치합니다. 상부체를 폐기합니다. 자석에서 튜브를 제거하고 1x IP 버퍼의 100 μL에서 항체 비드 혼합물을 다시 분리합니다. RNA 면역 침전 (RIP) 다음과 같이 각 2.5 μg mRNA 샘플에 대해 RIP 반응 혼합물 500 μL을 준비하십시오: 단편화된 RNA의 100μL에서 2.5 μg (단계 6.12에서); 뉴클레아제 없는 물의 295 μL; 40 U/μL RNase 억제제의 5 μL; 및 5배 IP 버퍼의 100 μL. 각 항체 비드 혼합물에 RIP 반응 혼합물 500 μL을 추가합니다(7.1.14 단계에서~100 μL). 구슬을 완전히 재보페수 있도록 여러 번 부드럽게 파이펫을 섞는다. 얼음 위에 놓습니다. 4°C에서 2시간 동안 회전 휠에 모든 RIP 튜브를 배양합니다. 원심 분리는 MeRIP 반응을 간략하게 반응하여 캡과 튜브 측면에서 액체 방울을 회전시합니다. 튜브를 자기 분리기위에 1분 동안 놓습니다. 새로운 원심분리기 튜브에서 상체를 옮기고 자기 구슬을 방해하지 않도록 주의한다.참고: 플로우루는 RIP 효율을 확인하기 위한 제어로 보관할 수 있습니다(7.3.9단계로 이동). 자석에서 튜브를 제거합니다. 차가운 1x IP 버퍼의 500 μL을 추가하여 구슬을 씻으세요. 구슬을 여러 번 부드럽게 배관하여 구슬을 완전히 재보페팅합니다. 튜브를 자기 분리기위에 1분 동안 놓고 상체를 폐기합니다. 총 3개의 세척에 대해 세척 절차(단계 7.2.6-7.7.7)를 두 번 반복합니다. 튜브를 얼음 위에 놓고 즉시 용해로 진행합니다. 용출 20mMm6A 용액을 10 mg의 N6-메틸라데로신, 5′모노포세산염 나트륨(m6A)을 1.3mL의 뉴클레아제 없는 물로 용해시게 한다. 150 μL 알리코를 준비하고 -20 °C에 보관하십시오. 각 시료(테스트 및 제어):5배 IP 버퍼 45μL, 20mM m6A 75μL, 40U/μL RNase 억제제의 3.5 μL, 뉴클레아자유수의 101.5 μL 등 다음 성분을 혼합하여 225μL의 용출 버퍼를 준비한다. 용출 버퍼 100 μL(7.3.2 단계)을 구슬에 추가합니다(7.2.9 단계부터). 구슬을 완전히 재보페수 있도록 여러 번 부드럽게 파이펫을 섞는다. 4 °C에서 로커에 연속 흔들림으로 모든 튜브를 1 시간 동안 배양하십시오. RIP 반응을 원심분리하여 캡과 튜브 측면에서 액체 방울을 회전시합니다. 튜브를 자기 분리기위에 1분 동안 놓습니다. 용출된 RNA 단편을 포함하는 상체를 새로운 1.5 mL 마이크로센심분리기 튜브로 이송한다. 비드를 흡인하지 않도록 주의하십시오. 용출 단계(7.3.3 ~ 7.3.6)를 다시 100 μL의 용출 버퍼를 추가하고, 4°C에서 1h를 배양하고, 자기 분리 후 용출을 수집한다. 동일한 샘플에서 모든 용출을 결합합니다(총 용출 부피는 200 μL이어야 합니다). 에탄올 강수량 또는 열 기반 선택 방법(즉, RNA 클린 및 농축기)에 의해 용출된 RNA 및 유량(7.2.5단계으로부터 선택 사항)을 정화합니다. 고감도 검출 키트를 사용하여 단편 분석기를 사용하여 RNA 수량 및 유량 및 용출 된 샘플을 평가합니다. RNA의 품질이 만족하는 경우, 라이브러리 준비 및 높은 처리량 시퀀싱(단계 9)을 진행한다.참고: MeRIP에서 검색된 RNA의 양은 매우 낮으며, 정량화를 보장하기 위해 반드시 고감도 검출 키트가 필요합니다. 생체 분석기를 사용할 수 없는 경우, 도서관 준비에 맹목적으로 진행할 수 있다. 8. RNA 비설피테 변환 제어 및 시약 준비 ERCC 믹스 스파이크 인 제어: mRNA의 500 ng에 희석되지 않은 ERCC 믹스의 0.5 μL을 추가하는 것이 좋습니다 제조업체의 지시에 따라 ERCC 믹스를 추가합니다. 이 제어는 비설피트 변환의 효율성을 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다. 스파이크 폴리-A 고갈 RNA (단계로부터 3.3.14) 비율 1/1000 (즉, mRNA의 500 ng에 대한 폴리 A 고갈 RNA의 500 pg). 이 샘플은 리보소말 RNA에서 농축되어 따라서 28S rRNA, 양성 조절을 포함해야 한다.참고: 총 RNA는 또한 다중 A 고갈 RNA 대신 양성 대조군으로 사용될 수 있습니다. RNA 메틸화 키트(예: Zymo EZ)로 비설피트 변환을 수행합니다. RNA 세척 버퍼: 사용하기 전에 RNA 세척 버퍼 농축물의 12mL에 100% 에탄올(또는 95% 에탄올의 52mL)의 48mL을 추가합니다. 비설피트 변환참고: 비설피테 변환은 아래에 명시된 대로 제조업체의 절차에 따라 상업적으로 이용 가능한 RNA bisulfite 변환 키트로 수행되었다. 0.2 mL PCR 튜브에서 1000 ng의 mRNA (또는 300 에서 1000 ng 사이)를 추가하십시오. 스파이크 인 컨트롤 추가 : ERCC 믹스의 1 μL (단계 8.1.1) 및 폴리 A 고갈 RNA의 1000 pg (단계 8.1.2). DNase/RNase가 없는 물로 최대 20μL의 완전한 부피를 완성합니다. RNA 변환 시약 130μL을 각 20 μL RNA 샘플에 추가합니다. 위아래로 파이프를 사용하여 샘플을 혼합합니다. 튜브의 캡이나 측면에 물방울이 없는지 확인하기 위해 잠시 회전하십시오. PCR 튜브를 열 사이클러에 놓고 다음 단계를 수행하십시오: 5분 동안 70°C에서 의 분해; 45 분 동안 54 °C에서 변환; 총 3사이클에 대한 반복적인 거부 및 변환 단계; 그런 다음 4 °C에서 무기한 으로 유지하십시오.참고: 3주기의 데마산및 비황피트 변환은 시료의 완전한 비황피트 변환을 보장합니다. 샘플은 -80°C에 저장하거나 직접 처리할 수 있습니다. 열 내 탈황을 진행합니다. 컬럼을 빈 수집 튜브에 넣고 컬럼에 RNA 바인딩 버퍼 250 μL을 추가합니다. RNA 바인딩 버퍼를 포함하는 컬럼에 샘플(~150 μL)을 로드하고 위아래로 배관하여 혼합합니다. 매컬의 샘플 RNA 결합 버퍼 혼합물에 95-100% 에탄올의 400 μL을 추가합니다. 캡을 닫고 열을 여러 번 반전하여 즉시 섞습니다. 30 초용 최고 속도 (≥ 10,000 x g)의 원심 분리기. 흐름을 삭제합니다. RNA 워시 버퍼 200μL을 컬럼에 넣고 원심분리기를 최고 속도로 30초간 추가합니다. RNA 황전 버퍼 200μL을 컬럼에 넣고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 30 초 전속력의 원심분리기. 흐름을 삭제합니다. RNA 워시 버퍼 400μL을 컬럼에 넣고 원심분리기를 최고 속도로 30초간 추가합니다. RNA 세척 버퍼의 추가 400 μL로 세척 단계를 반복합니다. 흐름을 삭제합니다. 2 분 동안 최고 속도로 비워진 컬렉션 튜브의 컬럼을 원심 분리합니다. 컬럼을 RNase 가 없는 튜브로 옮기십시오. 단열 매트릭스에 직접 DNase/RNase가 없는 물의 ≥ 10μL을 추가하고 실온에서 1분 동안 배양합니다. 30 초전속의 원심분리기.참고: 우리는 보통 20 μL의 부피로 엘ute. 용출 된 RNA는 즉시 사용하거나 최대 3 개월 동안 -20 °C에서 저장할 수 있습니다. 장기 보관을 위해 -80°C로 유지하십시오. RNA 품질 및 수량의 단편 분석기 평가를 위해 2.5 μL을 꺼내 서고 준비 및 고처리량 시퀀싱(단계 9)을 진행한다. 효율의 편유피 변환 제어를 위해 변환 된 RNA의 4 μL을 가져 가라 (단계 8.3). RT-PCR에 의한 비설피트 변환 제어참고: 이 단계는 시퀀싱을 진행하기 전에 비설피트 변환이 성공했습니다. 호모 사피엔스의 28S 리보소말 RNA는 RNA 메틸화 분석에 대한 양성 대조군으로 사용될 것이며, C 잔류물은 4447(GenBank 가입 #NR_003287)로 100% 메틸화된 것으로 설명되고 있다.프라이머 시퀀스:H 28SF 프라이머: 5′-GGGGTTAYGATTTTTTTTTTGGG-3’H 28SR 프라이머: 5′-CCAACTCACRTTCTATTAATAATAATAAC-3′ 대용량 cDNA 역전사 키트를 사용하여 역전사(RT) 반응 믹스를 준비한다. 얼음에 키트 구성 요소를 해동하고 다음과 같이 얼음에 RT 마스터 믹스를 준비 :비술피테의 4 μL 변환 RNA (단계 8.2.14에서):10xRT 버퍼의 2 μL0.8 μL 의 25배 dNTP 믹스 [100mMM]10x RT 랜덤 프라이머 의 2 μL멀티스크리브 역전사 1μLRNase 억제제 의 1 μL뉴클레아제 프리 H2O의 9.2 μL참고: 각 RT 반응에는 0.2mL PCR 튜브의 20 μL 최종 부피가 포함되어야 합니다. 다음 RT 프로그램과 함께 열 사이클러에 튜브를 넣어 : 10 분 동안 25 °C; 120 분 동안 37 °C; 5 분 동안 85 °C; 그런 다음 4 °C에서 무기한. PCR 교정 효소를 사용하여 28S rRNA를 증폭시키기 위해 PCR 반응을 준비합니다. 키트 구성 요소를 얼음, 부드럽게 소용돌이 및 간략하게 원심분리기에 적어 보냅니다. 다음과 같이 얼음이나 얼음 냉철 판 홀더에 PCR 마스터 믹스를 준비하십시오.10 μM H 28SF 프라이머의 0.6 μL10 μM H 28SF 프라이머의 0.6 μL템플릿 cDNA의 6.5 μLDNA 폴리머라제 마스터 믹스의 22.5 μL참고: 각 PCR 반응에는 0.2mL PCR 튜브의 20 μL 최종 부피가 포함되어야 합니다. 다음 PCR 프로그램과 함께 열 사이클러에 튜브를 넣어 : 5 분 동안 95 °C에서 초기 분해; 45사이클의 데나포화(15s용 95°C), 아닐링(30초동안 57°C), 신장(15초동안 72°C), 72°C에서 10분 동안 최종 신장, 그리고 4°C에서 무기한 으로 유지한다. 2% 아가로즈 젤에 반응의 10 μL을 실행합니다. 예상 대역 크기는 130 – 200 bp입니다. PCR 제품의 시퀀싱 효소및 dNTP 잔류물을 제거하고 증폭된 DNA를 DNase/RNase 가 없는 물의 최소 20μL에서 염화한 DNA를 예테하는 것이 선택되는 컬럼 기반 방법으로 PCR 제품을 정화합니다. 정제된 DNA를 분광광계로 정량화합니다. 시퀀싱 반응 PCR 제품/염기서열 분석 반응의 40 ng를 사용합니다. H 28SF 및 H 28SR 프라이머를 사용 하 여 양방향으로 서열. 알려진 비변환 시퀀스와 서열을 정렬 (28S 리보소말 N5 (RNA28SN5). 위치 C4447에서 C 잔류물의 존재 여부를 확인하고 다른 곳에서 C 대신 T 잔류물의 경우. 9. 라이브러리 준비 및 고처리량 시퀀싱 elute-Prime-Fragment 단계에서 프로토콜을 시작하고 제조업체 지침을 따르기 위해 mRNA 키트(예: 일루미나 TruSeq Stranded)를 사용하여 시퀀싱을 위한 라이브러리를 준비합니다. 그러나, 입력 RNA-Seq 및 MeRIP-Seq 샘플의 경우, 샘플을 80°C에서 2분 동안 배양하여 전성기에만 만주하지만 더 이상 단편화하지는 않는다. 일루미나 플랫폼을 사용하여 시퀀싱을 수행합니다. 시퀀싱 반응은 최소 100nt 길이로 단일 또는 페어링 된 끝 중 하나 또는 쌍의 종결환경 및 실험 설계에 따라 수행 될 수 있습니다. 10. 생물정보학 분석 m6A 데이터 처리 FASTQC24를 실행하여 m6A의 판독 품질을 평가하고 시퀀싱에서 FASTQ 파일을 입력합니다. Atropos25를 실행하여 판독에서 저품질 엔드 및 어댑터 시퀀스를 다듬습니다. Atropos를 실행에서 다음 매개 변수를 설정합니다. AGATCGGAAGAG, CTCTTCCGATCT, AACACTCTTTCCCT, AGATCGGAAGAGCG, AGGGAAAGAGTGTT, CGCTCTTCCGATCT : 다음과 같은 어댑터 시퀀스를 제거합니다. 제조업체(https://support.illumina.com/downloads/illumina-adapter-sequences-document-1000000002694.html)가 지정한 저품질 단자를 트리밍하기 위해 5. 트리밍 후 다음 최소 읽기 길이를 사용합니다: 25 개의 기본 쌍. GRh38 인간 게놈 및 HIV [통합 선형 pNL4-3Env-GFP] 참조를 FASTA 형식으로 병합합니다. 합병된 참조를 HISAT226으로 인덱싱합니다. 트리밍된 읽기에서 HISAT2를 실행하여 인덱싱된 참조에 정렬합니다. 기본 HISAT 매개 변수를 사용합니다. 정렬된 읽기를 SAMtools27로 정렬하고 인덱싱합니다. SAMtools 통계 및 Qualimap 228을 실행하여 시퀀스 라이브러리의 정렬 후 품질 검사를 위해 실행합니다. 선택적으로 multiQC29를 사용하면 이전 단계의 품질 측정값을 수집하고 요약합니다. HIV 게놈은 5’LTR 및 3’LTR에서 동종 634 bp 서열을 가지고 있습니다: SAMtools를 가진 해당 3′ LTR 지구에 5’LTR에서 멀티 매핑 판독을 재조정합니다. m6A 피크를 식별하려면 피크 호출 소프트웨어 MACS230(v 2.1.2)을 실행합니다. MACS2 실행 매개변수를 신중하게 선택하여, 최고 호출이 유전자 발현 수준에 의해 영향을 받을 수 있고, 짧은 엑소온이 피크로 잘못 호출될 수 있기 때문에 RNA-Seq 데이터에 대한 올바른 기능을 보장하기 위해. 따라서 MACS2에서 DNA 기반 데이터에 일상적으로 적용하지 않고 입력 신호를 m6A 신호에서 빼야 합니다. MACS2의 ‘콜피크’ 하위 명령에 다음 매개 변수를 적용합니다.- 유지 DUP 자동 (중복 읽기로 MACS2 동작을 제어, ‘자동’MACS는 p 값 컷오프로 1e-5를 사용하여 이소미 분포를 기반으로 정확히 동일한 위치에서 읽기의 최대 수를 계산 할 수 있습니다)-g 2.7e9(bp의 인간 게놈 크기)-q 0.01 (최소 FDR 컷오프가 중요한 피크를 호출)- 노모델 (ChIP-Seq 실험에 맞게 조정된 변속 모델 구축 우회)-slocal 0-llocal 0 (이 및 이전 매개 변수를 0으로 설정하면 MACS2가 매끄럽지 않고 직접 빼고 m6A 읽기에서 입력이 읽습니다).-내전 100(bp의 조각의 평균 길이)-B MACS2의 하위 명령을 호출하는 차동 피크를 실행, ‘bdgdiff’ 감염된 대 비 감염 된 샘플을 비교합니다. ‘bdgdiff’는 이전 단계에서 ‘callpeak’에 의해 생성된 bedGraph 파일을 입력하는 것으로 수행됩니다. 각 시간 지점에 대해, 감염된 대 비감염 시료를 ‘bdgdiff’로 비교하여 m6A 신호로부터 각각의 입력 신호를 빼고 추가 매개변수를 제공합니다: -g 60-l 120. m5C 데이터 처리 Cutadapt31을 실행하여 다음 매개 변수를 사용하여 원시 읽기에서 어댑터 시퀀스를 다듬습니다.어댑터 “아가트CG가가카카크GTGTCTGAAC”- 최소 길이 =25. 시퀀싱 프로토콜이 역방향 가닥에서 읽기를 생성하므로 seqkit32를 사용하여 트리밍된 읽기를 역으로 보완합니다. FastQC를 실행하여 판독 품질을 검사합니다. FASTA 형식으로 GRh38 인간 게놈 및 HIV[통합 선형 pNL4-3Env-GFP] 참조를 병합합니다. 메란TK 패키지33에서 응용 프로그램 meRanGh와 병합 된 참조를 색인. 다음과 같은 매개 변수와 meRanGh와 정렬 :- UN을 가능하게 하는 매핑되지 않은 읽기는 출력 파일에 기록될 수 있습니다.-MM 을 사용하면 멀티 매핑된 읽기를 출력 파일에 기록할 수 있습니다.-베드그래프출력용 bg-mbgc 10 필터 커버리지에 의해 보고 된 지역 (적어도 10 판독 범위) HIV 게놈은 5’LTR 및 3’LTR에서 동종 634 bp 서열을 가지고 있습니다: 멀티 매핑 판독을 5′ LTR에서 SAMtools를 사용한 해당 3’ LTR 영역으로 재정렬됩니다. meRanTK에서 제공하는 meRanCall 도구를 통해 메틸화 호출을 실행합니다.-rl = 126, 읽기 길이-ei = 0.1, 메틸화 율 p-값 계산에 대한 오차 간격-cr = 0.99, 예상 전환 각 샘플의 크기 요인을 추정하기 위해 MeRanTK의 유틸리티 estimateSizeFactors.pl 실행합니다. 크기 요소는 다음 단계에서 매개 변수로 사용됩니다. 실행 MeRanCompare 비감염 대 시간 점 12, 24 및 36h에 걸쳐 감염의 차동 메틸화 분석을 위해 비교합니다. 다음 매개 변수가 적용됩니다: 이전 단계의 보고 및 크기 요인에 대한 최소 임계값으로 .01의 중요도 값이 적용됩니다.