質量分析に基づくプロテオミクスアプローチによるグローバルで信頼性の高いタンパク質R-メチル化分析
Summary
タンパク質アルギニン(R)-メチル化は、複数の生物学的経路を調節する広範な翻訳後修飾です。質量分析は、修飾ペプチド濃縮のための生化学的アプローチと組み合わせると、R-メチルプロテオームをグローバルにプロファイリングするための最良の技術です。ここでは、ヒト細胞における全体的なR-メチル化を高信頼で同定するために設計されたワークフローについて説明します。
Abstract
タンパク質アルギニン(R)-メチル化は、RNAプロセシング、シグナル伝達、DNA損傷応答、miRNA生合成、翻訳など、いくつかの細胞経路の調節に関与する広範なタンパク質翻訳後修飾(PTM)です。
近年、生化学的および分析的開発のおかげで、質量分析(MS)ベースのプロテオミクスが、単一部位分解能で細胞のメチルプロテオームを特徴付けるための最も効果的な戦略として浮上しています。しかし、MSによる in vivo タンパク質R-メチル化の同定とプロファイリングは、主にこの修飾の化学量論的性質と、さまざまなアミノ酸置換の存在、およびメチル化に同重な酸性残基の化学的メチルエステル化のために、依然として困難でエラーが発生しやすいままです。したがって、R-メチルペプチドの同定を強化するための濃縮法と、メチルプロテオミクス研究における偽発見率(FDR)を低減するための直交検証戦略が必要です。
ここでは、細胞サンプルからの高信頼性R-メチルペプチドの同定と定量のために特別に設計されたプロトコルについて説明し、細胞の代謝標識を重同位体コードメチオニン(hmSILAC)および二重プロテアーゼ溶液中消化で全細胞抽出物に結合し、その後、オフライン高pH逆相(HpH-RP)クロマトグラフィー分画と抗汎-R-メチル抗体を使用したR-メチルペプチドのアフィニティー濃縮を行います。高分解能MS分析では、生データはまずMaxQuantソフトウェアパッケージで処理され、その結果はMaxQuant出力ファイル内の軽メチルペプチドと重メチルペプチドに対応するMSピークペアの詳細な検索用に設計されたソフトウェアであるhmSEEKERによって分析されます。
Introduction
アルギニン(R)-メチル化は、哺乳類プロテオームの約1%を修飾する翻訳後修飾(PTM)です1。タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ(PRMT)は、Rの側鎖のグアニジノ基の窒素(N)原子に1つまたは2つのメチル基を対称的または不斉に沈着させることによってR-メチル化反応を触媒する酵素です。哺乳動物では、PRMTは、モノメチル化(MMA)と不斉ジメチル化(ADMA)、MMAと対称ジメチル化(SDMA)の両方を沈着させる能力に応じて、タイプI、タイプII、およびタイプIIIの3つのクラスに分類でき、それぞれMMAのみである2,3。PRMTは主に、GARモチーフとして知られるグリシンおよびアルギニンリッチ領域内に位置するR残基を標的としていますが、PRMT5やCARM1などの一部のPRMTは、プロリン-グリシン-メチオニンリッチ(PGM)モチーフをメチル化することができます4。R-メチル化は、RNAスプライシング5、DNA修復6、miRNA生合成7、翻訳2など、いくつかの生物学的プロセスのタンパク質調節因子として浮上しており、このPTMの研究を促進しています。
質量分析(MS)は、タンパク質、ペプチド、および部位分解能での全体的なR-メチル化を体系的に研究するための最も効果的な技術として認識されています。ただし、このPTMは、MSによる信頼性の高い識別のためにいくつかの特別な予防措置を必要とします。第一に、R-メチル化は化学量論的であり、修飾されていないペプチドは修飾されたペプチドよりもはるかに豊富であるため、データ依存取得(DDA)モードで動作する質量分析計は、低強度のメチル化ペプチドよりも高強度の非修飾ペプチドを断片化する頻度が高くなります8。さらに、R-メチル化部位同定のためのほとんどのMSベースのワークフローは、バイオインフォマティクス解析レベルでの制限に悩まされています。実際、メチルペプチドの計算同定は、このPTMが様々なアミノ酸置換(例えば、グリシンからアラニンへ)およびアスパラギン酸およびグルタミン酸のメチルエステル化などの化学修飾に同重体であるため、高い偽発見率(FDR)を起こしやすい9。したがって、細胞培養中のアミノ酸による重メチル安定同位体標識(hmSILAC)などのメチル基の同位体標識に基づく方法は、 in vivo メチル化の信頼性の高いMS同定のための直交戦略として実装されており、偽陽性アノテーションの割合を大幅に低減しています10。
最近、R-メチル化タンパク質を研究するためのさまざまなプロテオームワイドプロトコルが最適化されています。R-メチルペプチドの免疫親和性濃縮のための抗体ベースの戦略の開発は、ヒト細胞における数百のR-メチル化部位のアノテーションをもたらした11,12。さらに、多くの研究3,13では、抗体ベースの濃縮をHpH-RPクロマトグラフィー分画などのペプチド分離技術と結合させることで、同定されたメチルペプチドの総数を増やすことができると報告されています。
この記事では、さまざまな生化学的および分析ステップに基づいて、ヒト細胞のR-メチル化部位を体系的かつ信頼性の高い同定のために設計された実験戦略について説明します:hmSILAC標識細胞からのタンパク質抽出、トリプシンおよびリサルギナーゼプロテアーゼによる並行二重酵素消化、それに続く消化ペプチドのHpH-RPクロマトグラフィー分画、MMA-、SDMA-の抗体ベースの免疫親和性濃縮と組み合わせた、 およびADMA含有ペプチド。次に、すべてのアフィニティーが豊富なペプチドをDDAモードの高分解能液体クロマトグラフィー(LC)-MS/MSで分析し、生のMSデータをMaxQuantアルゴリズムで処理してR-メチルペプチドを同定します。最後に、MaxQuantの出力結果は、重金属ペプチドと軽メチルペプチドのペアを検索するために自社開発のバイオインフォマティクスツールであるhmSEEKERで処理されます。簡単に言うと、hmSEEKERはmsmsファイルからメチルペプチドの同定を読み取ってフィルタリングし、各メチルペプチドをallPeptidesファイル内の対応するMS1ピークと照合し、最後に重/軽ペプチドのピークを検索します。推定される重照度ペアごとに、Log2 H/L比(LogRatio)、保持時間差(dRT)、および質量誤差(ME)パラメータが計算され、ユーザー定義のカットオフ内にあるダブレットが真陽性としてラベル付けされます。生化学的プロトコルのワークフローを 図1に示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
グローバルMSベースのプロテオミクスによる in vivo タンパク質/ペプチドメチル化の高信頼同定は、高いFDRのリスクのために困難であり、メチル化に同重体であり、直交MS検証戦略がない場合に誤った割り当てを引き起こす可能性のあるサンプル調製中にいくつかのアミノ酸置換およびメチルエステル化が発生します。このPTMの化学量論的性質は、グローバルなメチルプロテオミクスの?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MMとEMは、欧州分子医学学校(SEMM)の博士課程の学生です。EMは、3年間のFIRC-AIRC奨学金(プロジェクトコード:22506)の受領者です。結核グループのR-メチルプロテオームのグローバル分析は、AIRC IGグラント(プロジェクトコード:21834)によってサポートされています。
Materials
| Ammonium Bicarbonate (AMBIC) | Sigma-Aldrich | 09830 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 497363 | |
| C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g) | Waters | WAT036905 | |
| Colloidal Coomassie staining Instant | Sigma-Aldrich | ISB1L-1L | |
| cOmplete Mini, EDTA-free | Roche-Sigma Aldrich | 11836170001 | Protease Inhibitor |
| Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO ThermoFisher | 26400-044 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483-12-3 | |
| DMEM Medium | GIBCO ThermoFisher | requested | with stabile glutamine and without methionine |
| EASY-nano LC 1200 chromatography system | ThermoFisher | ||
| EASY-Spray HPLC Columns | ThermoFisher | ES907 | |
| Glycerolo | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HeLa cells | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | 144-48-9 | |
| Jupiter C12-RP column | Phenomenex | 00G-4396-E0 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M5308 | Light (L) Methionine |
| L-Methionine-(methyl-13C,d3) | Sigma-Aldrich | 299154 | Heavy (H) Methionine |
| LysargiNase | Merck Millipore | EMS0008 | |
| Microtip Cell Disruptor Sonifier 250 | Branson | ||
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO ThermoFisher | 15140122 | |
| PhosSTOP | Roche-Sigma Aldrich | 4906837001 | Phosphatase Inhibitor |
| Pierce C18 Tips | ThermoFisher | 87782 | |
| Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85175 | LC-MS Solvent B |
| Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85170 | LC-MS Solvent A |
| Pierce Acetonitrile (ACN), LC-MS Grade | ThermoFisher | 51101 | |
| Pierce Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 51140 | |
| Polyacrylamide | Sigma-Aldrich | 92560 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | 1610373 | |
| PTMScan antibodies α-ADMA | Cell Signaling Technology | 13474 | |
| PTMScan antibodies α-MMA | Cell Signaling Technology | 12235 | |
| PTMScan antibodies α-SDMA | Cell Signaling Technology | 13563 | |
| Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | ThermoFisher | ||
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5113 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | |
| Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf | Speed vac |
Referências
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