Actualmente, hay 3 enfoques principales para analizar las células T específicas del antígeno. El primer enfoque se basa en la interacción entre el receptor de células T y el péptido (epítopo). Las células T específicas del antígeno podrían teñirse directamente con multómeros del complejo de histocompatibilidad peptídico mayor (MHC). La ventaja de este método es que podría obtener células T viables específicas de antígenos, adecuadas para el análisis transcriptómico / metabolómico posterior. Una limitación de este método es que no pudo proporcionar información sobre toda la respuesta de las células T a un antígeno específico, ya que requiere péptidos de epítopo validados, mientras que el número de epítopos identificados para un antígeno específico es limitado por ahora. En comparación con los epítopos de células T CD8 específicos del virus de la hepatitis B (VHB), se han identificado menos epítopos de células T CD4 específicos del VHB^1,2, lo que hizo que este método fuera menos aplicable para el análisis de células T CD4 específicas del VHB actualmente.

El segundo enfoque se basa en la regulación al alza de una serie de marcadores inducidos por activación después de la estimulación peptídica del antígeno³. Los marcadores comúnmente utilizados incluyen CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB⁴. Este método se ha utilizado ahora para analizar las respuestas de células T específicas de antígenos en individuos vacunados^5,6,pacientes con infección por el virus de la inmunodeficiencia humana⁷y pacientes con infección por coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo^8,9. A diferencia del ensayo basado en multómeros péptidos-MHC, este método no está restringido por epítopos validados y podría obtener células viables para el análisis posterior. Una limitación de este método es que no pudo proporcionar información sobre el perfil de citoquinas de las células T específicas del antígeno. Además, la expresión de estos marcadores inducidos por la activación por algunas células no específicas de antígeno activado podría contribuir a las señales de fondo en el análisis, lo que podría ser un problema, especialmente cuando las células T específicas del antígeno objetivo son raras. Actualmente, existe una aplicación limitada de este método en las células T CD4 específicas del^{VHB 4.} Si este método podría utilizarse para analizar las células T CD4 específicas del VHB de una manera confiable necesita más investigación.

El tercer enfoque se basa en la secreción de citoquinas después de la estimulación del péptido antígeno. Al igual que el análisis basado en marcadores inducidos por activación, este método no está restringido por epítopos validados. Este método podría revelar directamente el perfil de citoquinas de las células T específicas del antígeno. La sensibilidad de este método es menor que el método basado en marcadores inducidos por activación, ya que se basa en la secreción de citoquinas de células T específicas de antígenos y el número de citoquinas analizadas suele ser limitado. Actualmente, este método es ampliamente utilizado en el análisis de células T específicas del VHB. Como las células T específicas del VHB secretas de citoquinas difícilmente podrían detectarse mediante la estimulación directa del péptido ex vivo^10,11, el perfil de citoquinas de las células T específicas del VHB generalmente se analiza después de 10 días de expansión estimulada por péptidos in vitro^12,13^,14,15,16. La disposición de grupos de péptidos en forma de matriz se ha utilizado para facilitar la identificación de epítopos específicos de antígenos^17,18. Con la combinación de la matriz peptídica y el análisis de secreción de citoquinas, se ha desarrollado un método para evaluar las respuestas de las células T CD4 específicas del VHB e identificar los epítopos de células T CD4 específicas del VHB simultáneamente¹⁶. En este protocolo, se describen los detalles de este método. El antígeno central del VHB se elige como ejemplo de demostración en este protocolo.