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Biologia

优化低温电子断层扫描数据采集策略

Published: March 19, 2021
doi:
10.3791/62383
, , ,
1Structural and Computational Biology Unit,European Molecular Biology Laboratory, 2Electron Microscopy Core Facility,European Molecular Biology Laboratory, 3Imaging Centre,European Molecular Biology Laboratory

Summary

低温电子断层扫描对大规模数据收集的需求不断增加，这需要高通量图像采集程序。这里描述的是一个协议，旨在实现高级获取策略的最新发展，旨在最大限度地提高断层数据收集的时间效率和吞吐量。

Abstract

低温电子断层扫描（CryoET）是研究处于接近原生状态的生物样品3D结构的有力方法。目前的最先进的低温ET结合亚形图平均分析，使大分子复合体的高分辨率结构确定，这些复合物在断层重建中存在于多个副本中。断层扫描实验通常需要大量的倾斜系列才能通过具有重要操作运行成本的高端传输电子显微镜获得。虽然近年来自动数据采集程序的吞吐量和可靠性不断提高，但选择获取倾斜系列感兴趣的区域的过程不能轻易自动化，它仍然依赖于用户的手动输入。因此，设置大型数据收集会话是一个耗时的程序，可以大大减少可用于倾斜系列采集的剩余显微镜时间。在此，协议描述了基于串行EM封装和 PyEM 软件的最近开发的实现，这些软件显著提高了网格筛选和大规模倾斜系列数据收集的时间效率。所提交的协议说明了如何使用串行EM脚本功能来完全自动化网格映射、网格方形映射和倾斜系列采集。此外，该协议还描述了在启动自动数据收集后，如何使用 PyEM 在离线模式下选择其他获取目标。为了说明此协议，本文程描述了它在Sars-Cov-2倾斜系列高端数据收集中的应用。所呈现的管道特别适合最大限度地提高断层扫描实验的时间效率，这些实验需要仔细选择采集目标，同时需要收集大量的倾斜系列。

Introduction

低温电子显微镜（cryoEM）方法基于生物样品在快速玻璃化后通过传输电子显微镜（TEM）成像，这是一种样品制备过程，可在接近原生和水合状态1、2的状态下保存标本的分子和细胞结构。在低温电子断层扫描（CryoET）中，通过从不同方向获取相同区域的图像（即所谓的倾斜系列），然后对断层学卷3进行计算重建，实现测定样品的3D模型。这种先进的成像技术已经成熟为一种强大的方法，用于在原生细胞环境4、5、6的背景下对生物过程进行结构研究。

除了对测光样品进行超结构分析外，还可以通过应用平均5个子图来获得断层体体中多个副本中存在的大分子复合物的高分辨率重建。这种重建方法基于包含利益结构的子卷的迭次对齐和平均值，旨在提高信号噪声比和最终重建的分辨率7、8。子图平均值依赖于收集和处理大量数据，这些数据通常要求通过具有繁重运营成本的高端 TEM 获取数百个倾斜系列。

目前，这种自动低温ET会话的设置是一个耗时的过程，通常依赖于用户的手动输入9，10，11。通常，目标通过对映射网格的目视检查来识别，然后设置为自动数据收集。用户识别采集点的效率通常受样本性质的影响，在分析浓度低于最佳浓度的纯化大分子时，或在拥挤的蜂窝环境中发生罕见事件时，尤其具有挑战性，这意味着使用相关方法12。此外，当前的工作流程要求在设置过程中以各种放大倍数采集图像，这些图像随后将用于在自动采集11、13、14期间精确定位和定位目标。这些高精度重新对齐步骤对于高分辨率应用至关重要，高分辨率应用要求以高放大率进行成像，并且需要准确的中心步骤才能在由此产生的小视野内保留感兴趣的区域。总共，每个数据收集会话的几个小时都用于此耗时的程序，在此期间 TEM 不参与倾斜系列采集。因此，根据所需的倾斜系列数量，采集点的识别和设置可能会对低温ET会话期间可用于数据收集的显微镜时间产生重大影响。

这里描述的是一个基于 SerialEM 软件包15和最新版本的 PyEM 软件16的优化协议，用于映射网格、映射网格方块、选择目标，并为大规模倾斜系列集合设置自动数据采集。此方法的关键概念是为每个采集项目（称为虚拟地图）提供 PyEM 计算生成的图像，以便准确定位和定位目标。为了获得实际获取时间，使用串行EM的第二个虚拟实例离线执行目标选择和创建虚拟地图，将收购目标的选择过程与 TEM 操作脱钩。虽然没有解决如何提高数据质量13，17或倾斜系列采集的速度18，19，该协议主要侧重于战略，以优化大规模自动低温ET会话设置的时间效率。因此，实施所提交的协议是为了那些建立低温ET数据收集工作流程的科学家，他们希望通过增加可用于倾斜系列采集的显微镜时间，最大限度地提高自动数据采集的收益。

Protocol

此处描述的协议是 EMBL CryoEM 服务平台制作的更全面文档的一部分，其中包括详尽的分步说明和截图，说明典型低温ET会话的整个过程，包括样品加载、网格映射、显微镜调谐、设置采集点和自动数据收集。完整的协议可在以下链接下载：https://oc.embl.de/index.php/s/9OuTl8AazDkCNq0/download 1. 先决条件 安装串行EM版本3.8，并设置控制显微镜和探测器（http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/betaHlp/html/setting_up_serialem.htm）。 安装串行反转 3.8 的虚拟实例（https://sphinx-emdocs.readthedocs.io/en/latest/serialEM-note-setup-dummy.html）。 安装 PyEM（https://git.embl.de/schorb/pyem）。 2. 网格映射 将带网格的盒式磁带加载到显微镜自动装载机中。 设置适合映射整个网格的成像条件。考虑到所使用的探测器的视野（EFTEM SA 2250x），尽可能以最低的放大倍数进行此工作。保存成像条件作为 串行EM成像状态 ，使事情方便以后使用。 设置完整的蒙太奇 打开串行导航 器 菜单。 选择 蒙太奇和网格。 选择 设置全蒙太奇。 开始脚本 Grid_Mapping。允许脚本等待自动加载器冷却;进行清点，然后绘制库存过程找到的每个网格。通过 倾斜系列菜单 输入电子邮件，以便脚本在完成后方便地发送电子邮件。 保存 导航器。 从 SerialEM 导航器检查所有网格地图，并选择以更高的放大倍率进一步映射哪个网格。注：许多配备自动装载系统的TEM在重新加载时将显示网格的旋转。重新加载后最好重新制图任何网格。替代系统通常只遭受一些转变，这可以通过 “向标记转移” 程序在串行EM中更正。 3. 设置序列低剂量 设置序列EM低剂量 视图 和 预览 模式的放大倍数（这是步骤 6 所必需的）。 获取 视图 图像，并将其保存为导航器中的地图。 获取 预览 图像，并将其保存为导航器中的地图。 将两种模式设置为相同的装箱（建议装箱 4）。这样，可以将两个地图保存为一个图像堆栈。 在串行EM 导航器 窗口中，将视图地图的标签更改为 “查看”， 将”预览”地图的标签 更改为”预览”。 保存并关闭导航器文件。注：初始 查看 和 预览 图像不需要目标，PyEM 只会使用其成像设置。 4. 网格方形映射 设置成像条件来映射网格方块。能够看到兴趣样本和假珠分布是非常重要的。为确保网格方形地图的最佳对比度，执行以下步骤。 插入客观光圈。 如适用，插入能量过滤器切片。 使用 -100 μm 的脱焦。 适合进一步映射的好网格方块的屏幕。从网格映射对正方形进行目视检查后，根据网格方形地图的成像条件对正方形进行测试图像测试。 当确定好方块时，使用串行EM导航器的 添加点 功能在网格映射图像中标记其中心。 添加所有点后，在串行EM导航器按 移位 + A 上第一点，然后按 移位 + A 上最后一点。注：所有添加点现在都标有 A 标记，这意味着它们都是获取点。 在第一点按 移位 + N（ 按项目创建新文件），然后在最后一点上再次按移位 + N。在出现的对话中，选择 蒙塔格图像。 当蒙太奇对话弹出时，设置覆盖一个网格方块的蒙太奇大小。这取决于使用的网格的放大倍数和网格大小，通常需要 2 x 2 到 4 x 4 蒙太奇。给它一个数字（例如，squaremap_01.mrc）的名称，使 SerialEM 能够方便地自动编号每个网格方块的所有文件。 打开串行EM 导航器 菜单并单击 “获取项目”，开始网格映射。 在弹出式菜单中，选择以下选项。 选择 粗糙的欧心。 选择 获取地图图像。 选择 关闭柱阀在结束。 选择 发送电子邮件在结束。 5. 选择目标 打开虚拟串行实例。如果两台计算机共享网络连接，则可以在控制显微镜的 SerialEM PC 上或在不同的（支持）PC 上设置。 绘制第一个网格方块后，使用串行 EM 导航器菜单选项 合并 以查看虚拟串行实例中的蒙太奇。 双击 导航器 窗口以打开网格方形地图。 搜索地图并使用虚拟串行导航器选项 添加点 ，在感兴趣目标上添加图像采集点。 完成并绘制新方块后，保存 导航器 文件并再次合并导航器;继续，直到绘制所有网格方块。 6. 生成虚拟地图 再次，将导航器文件与虚拟串行实例合并。 运行PyEM 虚拟地图 脚本从虚拟串行EM菜单， 工具 和选择 虚拟锚地图。这可能需要一些时间，具体取决于网格方形地图的大小和数量以及视图和预览地图的装箱。注：PyEM 启动一个命令窗口，该窗口在完成后自动关闭，然后可以打开新的导航器文件。根据包含选定点的蒙太奇地图，PyEM 会编写单个合并地图及其所有视图和预览地图。最后，它写了一个新的导航文件称为<导航员档案>_自动映影.nav。 7. 显微镜调谐 检查显微镜调谐。为确保适当的显微镜性能，请按照以下顺序使用相同的放大倍数和光束大小设置进行数据采集。 运行塞里亚勒姆 无科马对齐由 Ctf （泽姆林表） 。 插入并中心目标孔径。 运行串行EM 纠正污名化由CTF（ 自动污名）。 运行 GIF 快速调谐 （即仅切开焦点）。注：由于步骤 7.1.1、7.1.3 和 7.1.4 可能需要更多剂量率，因此只应更改现货大小：光束大小不应更改，因为这会导致光束倾斜，从而使调谐不正确。步骤 7.1.1、7.1.2 和 7.1.3 在此公开可用的脚本中是半自动的（https://serialemscripts.nexperion.net/script/47）。 8. 设置导航器 在串行中，打开名为 _automaps.nav 的新导航器文件。注 ：V_yyyy是视图地图 ，P_yyyy是预览地图。预览地图设置为”获取点”。 在串行EM导航窗口中，取消选择所有 A 点，选择第一 个V_yyyy地图，选择 折叠，点击 A 两次，并取消选择 折叠。 选择第一个V_yyyy位置，按移位 +T，然后选择最后一个V_yyyy位置，然后再次按移位 + T。 选择文件属性中的 单帧图像 以打开对话。 在下一个文件属性对话中，根据成像需求和仪器设置选择所需的参数。 提示时，给一个数字（例如，TS_001.mrc）的名字，然后单击 “保存”。注：串行将自动编号所有倾斜系列的文件名。 为第一个 TS 位置设置倾斜系列控制器。完成后，单击”确定”以在此获取项目后为所有倾斜系列设置这些参数。现在，所有预览地图都选为TS（倾斜系列），并注有编号的文件名TS_xxx.mrc。注：以后可以使用导航器 TSparams 功能手动更改参数：列表中向下的所有项目都将应用更改。用户可以选择运行自定义脚本，而不是倾斜系列。 9. 设置对焦/跟踪位置 如果需要，为每个目标设置对焦/跟踪距离（确保已打开串行EM 低剂量 ）。 双击 视图图 以加载它。 在导航器列表中选择 预览地图 。 在导航器窗口中选择 编辑焦点 。 在 低剂量控制 面板中，取消选择 旋转区域间轴 ，以沿舞台倾斜轴定位 试验 和 聚焦 。 单击加载视图图中所需的区域，为此倾斜系列设置焦点/试用位置。 确保导航器项目现在设置 TSP; 重复所有项目的程序。注：在导航器中自动向下复制对焦/跟踪位置。因此，如果前一个项目的对焦/跟踪位置位于正确的侧面和正确的距离，则无需更改当前项目的重点/跟踪位置。 10. 设置附加脚本 两个脚本处理焦点范围： 预托莫 和 期间托莫。 预托莫 脚本运行在每个倾斜系列之前， 在每个倾斜过程中运行期间托莫 脚本。 编辑脚本 预托莫中的焦点范围。 在串行EM倾斜系列菜单中，在 TS 中查看运行脚本 并选择 期间脚 本的脚本编号。 11. 运行 检查氮气罐水平。 检查自动加载器涡轮增压器是否已选中。 检查数据存储自由空间。 在串行EM文件菜单中，取消对日志文件的连续保存，并关闭当前打开的任何日志文件。每个倾斜系列将获得自己的日志文件。 在导航器菜单中，单击 “获取项目”。 运行脚本 普雷托莫。 选择 主要任务获取倾斜系列。 选择 运行脚本后后，后托莫。 选择 关闭柱阀在结束。 选择 发送电子邮件在年底。 点击 GO。注：串行将发送每个倾斜系列的电子邮件，无论是成功还是错误：然而，错误也可能意味着未达到完全倾斜范围。

Representative Results

此过程用于获取 Turonova 等人描述的 Sars-Cov-2 倾斜系列。202020：整个数据集是在EMBL海德堡的三次显微镜会议上使用三个不同的网格制作的。当前研究将侧重于并描述与第一个网格运行的第一个 3 天（+72 小时）会话。 在整个网格以低放大倍率（+10 分钟，参见第 2 步）绘制后，网格地图上选择了 71 个合适的方块，并获得了中等放大图（方形地图），这些设置（放大、曝光、脱焦）允许直接可视化和识别感兴趣的样本，在这种情况下，冠状病毒（见第 4 步）（图 1A）。收购时间为每平方 3 分钟，总时间为 3 小时 45 分钟。 第一张方形地图创建后，在单独的计算机上打开一个虚拟串行实例（无需摄像机或显微镜控制），以可视化方形地图，并在适合倾斜系列采集的目标上添加点（见第 5 步）（图 1B）。通过将当前的虚拟串行导航器与从获取的串行实例中获取的导航器合并，检索了新获得的方形地图。经过+2小时的网格方采集和选择，可以确定50个初始目标。 方形地图采集完成后，设置了 SerialEM 低剂量，并拍摄并保存了参考 视图 和 预览 图像（参见第 3 步）。然后，后一种地图可以立即在虚拟序列中使用，从相应的方形地图图像生成使用 PyEM 软件套件的 50 个选定目标的 虚拟视图 （图 1C）和 虚拟预览 （图 1D）地图，处理时间为 30 分钟（见第 6 步）。虚拟串行EM会话上的这个处理时间用于对显微镜进行获取的最后准备：能量滤镜调谐、新相机获得参考图像采集、目标镜头的无污名和无昏迷对齐。 完成显微镜调谐并生成 50 个初始目标的虚拟地图后，将设置用于采集的实际串行EM导航器（参见第 8 步），设置对焦和跟踪位置（第 9 步），并启动倾斜系列采集（参见步骤 10 和 11）。虚拟视图图（图 1C） 用于目标的初始中心 （图 1E），然后使用虚拟预览地图 （图 1D） 在实际倾斜系列采集放大 （图 1F）上执行最终中心。 从上午 9：30 开始，50个初始目标的倾斜系列的采集大约在 15：00开始。使用断层扫描采集的设置（参见详细信息参考），倾斜系列需要 +20 分钟才能获得，然后有足够的目标运行整个晚上。在收购进行期间，可以检查其他方形地图，并添加更多目标，但仍通过虚拟串行实例离线。在剩余的方形地图中又选择了 121 个目标，并在为这些新目标创建虚拟地图后添加到收购串行EM导航器中，足以运行到 72 小时会话完成。 此过程（摘要（ 图 2）允许在单个工作日内设置 171 个目标，用于 72 小时（3 天）显微镜会话的自动断层学采集。 图1：图罗诺娃等人使用的沙斯-Cov-2低温网格代表方图，中心后有代表性的虚拟地图和相应的采集。 四个感兴趣的区域标有红十字。显微镜放大倍数为 2，250 倍。（B） 从方形地图中裁剪出来，突出显示用于生成所选目标（红十字）（C） 虚拟视图地图的虚拟视图（橙色）和虚拟预览（黄色）地图的区域。（D） 虚拟预览地图。（E） 以虚拟视图地图为参考进行中心化后的实际视图采集。显微镜放大倍数为 11，500 倍。（F） 使用虚拟预览地图作为参考后，从倾斜系列中获取 0° 倾斜。显微镜放大倍数为 64，000 倍。请单击此处查看此图的较大版本。 图2：使用带有PyEM工具的串行EM的CryoET会话工作流程。请点击这里查看此图的较大版本。

Discussion

从利基技术，低温ET现已成熟成一种广泛的方法，以前所未有的可达到分辨率21，22在细胞和分子水平进行结构研究。对低温成像的需求不断增加，这给获得这项技术的有限资源带来了压力。尽管开放了若干国家低温设备设施，科学机构努力提高其TEM能力，以满足全世界社区的需求，但获得低温电子设备的机会仍然有限，因此用户必须有效地利用可用于数据收集的时间，以最大限度地提高每次显微镜会议的产量。需要获取数百个倾斜系列，加上数据收集可用时间有限，需要新的图像采集程序，以便在不影响数据质量的情况下实现更好的吞吐量。硬件和成像工作流程的最新发展大大提高了倾斜系列收购的速度，从而导致建立收购点所花费的时间与实际倾斜系列采集所需的时间之间的比率发生了巨大变化。总之，设置采集点的程序正在成为可实现的低温ET会话吞吐量的主要瓶颈之一。

此处提供的优化协议使我们能够在低温ET会话的第一天内设置 171 个位置用于自动断层扫描采集，而显微镜则积极参与其他操作（例如方形映射、调谐和自动倾斜系列采集），从而不影响可用于数据收集的显微镜时间。除了最大限度地提高低温ET会话的吞吐量外，该管道还大大减少了用户在自动数据收集会话的准备阶段投入的时间。在描述的协议中，用户被要求浏览映射的网格方块，以确定合适的感兴趣区域，并将它们添加到串行 EM 导航器中作为采集点。然后，所有目标将通过PyEM工具在串行EM内自动批量处理，用于制作虚拟地图16。因此，通过消除与舞台移动、图像采集、View 和预览之间的成像条件变化相关的等待时间，以及最终以高放大度为中心重复这些步骤，所呈现的计算方法比获取真正的锚定地图要快得多。此外，由于每个获得的图像都会导致感兴趣的物体23的电子剂量积累，因此使用虚拟地图精确调整目标可减少在实际倾斜系列采集之前低温ET会话准备阶段引入的辐射损伤。此处描述的协议使用中间放大倍率和高放大度虚拟地图（分别预览和查看），以便在倾斜系列获取之前重新调整目标。此过程可以很容易地修改为仅在对齐精度不太重要时使用中间放大视图图像，例如，在最终目标精度不太关注10的大型结构中，或对于在低温网格上分布不佳的单个粒子分析样本，需要用户手动选择每个采集点24， 25.最后，基于假串行实例的离线使用方法还通过远程连接促进获取点的设置，最大限度地减少了用户在显微镜下实际存在的需要，从而在设施的操作组织方面具有更大的灵活性。

冷冻ET技术和方法的最新进展大大提高了自动数据收集会话的速度和可靠性。但是，需要进一步的发展，以解决该方法的剩余限速步骤。最值得注意的是，网格和方形映射的初始步骤现在正成为会话设置的主要瓶颈之一，从而产生了对硬件改进的需求，旨在提高显微镜阶段运动的速度和直接电子探测器获取图像的速度。此外，开发机器学习方法以完全自动化目标识别过程对于消除用户选择感兴趣区域的视觉检查需求至关重要，这是一个耗时的程序，依赖于用户的专业知识。

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我们感谢德国海德堡欧洲分子生物学实验室结构和计算生物学组和电子显微镜核心设施以及 iNEXT-Discovery（项目编号871037）的支持。我们非常感谢系列EM软件包的作者大卫·马斯特罗纳德教授的大力支持。我们还要感谢冯赫尔曼对手稿的批判性解读。

Materials

Transmission Electron Microscope Our protocol is only based on computational workflows. The user will only need acess to a TEM of any kind
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Referências

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Cryogenic Electron TomographyData AcquisitionSerialEMVirtual Anchor MapsComa-free AlignmentAstigmatism CorrectionTilt Series AcquisitionPreview MapsFocus/track Distance

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Weis, F., Hagen, W. J. H., Schorb, M., Mattei, S. Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition. J. Vis. Exp. (169), e62383, doi:10.3791/62383 (2021).
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