ゼブラフィッシュラーバル異種移植片の生成と腫瘍行動解析

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)モデルは、欧州動物福祉法、指令2010/63/EU(欧州委員会、2016)およびシャンパリモー魚プラットフォームの標準プロトコルに従って処理され、維持されました。すべての議定書は、シャンパリモー動物倫理委員会とポルトガルの機関組織ORBEA(オルガン・デ・ベム・エティカ動物/動物福祉倫理団体)とDGAV(ディレサン・ジェラル・デ・アリメンタサン・エ・ヴェテリナリア/食品獣医総局)によって承認されました。 注:主な実験を開始する前に、ヒト大腸癌(CRC)細胞株HCT116を練習してください。この細胞株は、(高度に増殖)、非常に効率的に(約95〜100%)を注入し、生着することが容易な(高度な増殖)調製が容易である。過剰な細胞(約12×106 個の細胞、T-75フラスコ)と余分な魚(400匹の魚)から、訓練中に多くの細胞や魚が失われるため、この技術に堪能になるまで始めます。実験者は、HCT116異種移植片で〜95%の生着が達成されると準備ができています。完全なプロトコルの概略については、 図 1 を参照してください。 1. 注射用のセットアップ 注射の2週間前に、培養中の細胞を拡大する(いくつかの細胞株の注入のための最適なインビトロ合流の詳細なガイドについては表1を参照)。 注射の3日前に、所望の背景のゼブラフィッシュを横切る。 2. 24 時間前に注射 ゼブラフィッシュの胚プレート(死んだ胚と未開発の胚をすべて捨てる)をきれいにし、E3培地をリフレッシュします。 細胞培養室では、注入予定のフラスコから細胞培養培地を捨て、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1回洗浄し、死んだ細胞を除去し、新鮮な培地を添加する。 マイクロインジェクション針、アガロースプレート、ヘアピンなどの注射手順のツールを準備して、注射用の胚を整列させます(図2A-D、下記を詳述)。 マイクロインジェクション針(図2A) ホウケイ酸ガラス毛細血管(4インチ、OD 1.0 mm、マイクロピペットプーラーにフィラメントなし(熱:≈500;フィル:10;vel:50;12月:60;プル:100)。。 プレートの準備 (図 2B) H2 Oで2%アガロースを準備し、加熱し、きれいなペトリ皿の蓋に溶解アガロースの1層を注ぎます。それを重合させ、定規の助けを借りて、胚の整列のために3〜4本のまっすぐなアガロースラインを作ります。 ヘアピンアセンブリ (図2C-D) ガラスの毛管の中に1本の毛を入れて、約1センチの毛をチューブの外に残します。 約0.5mmの長さのループを形成するガラスキャピラリーチューブに鉗子の助けを借りて髪の外側の先端をカール。 毛細管の端をマニキュアの滴で密封します。これは、ループを所定の位置に固定するのにも役立ちます。乾かします。チューブの他の端で手順を繰り返します。 電気テープを切る(通常の粘着テープよりも抵抗力があり、不浸透性で、硬い)。 テープをキャピラリーの周りに密封して、破損しないようにします。 3. 注射日 孵化した胚を孵化していない卵から分離する。この段階で1xプロナーゼ(0.6mg/mL、 表3)を胚培地に添加すると、孵化を促進することができる。インキュベーターに胚を入れ(28°C)注射するまで入れる。注:酵素は孵化した胚に作用し、死亡リスクを高めるので、胚をプロナーゼ溶液に1時間以上放置しないでください。胚の発達段階が、浮腫および死亡率のリスクを回避するために、48 hpf(図3A、A’)に対応するものであることを確認してください。 1xトリケーヌ(25x株から)を準備します。注:詳細なレシピは 、表3 とゼブラフィッシュ情報ネットワーク – ZFINウェブページ17で見つけることができます。 4. 注射用の細胞ラベリング 注:細胞のラベリングは、フラスコ内または酵素剥離後の1.5 mLマイクロ遠心チューブのいずれかで直接行うことができます。詳細については 、「ディスカッション」 を参照してください。 細胞培養培地を取り出し、フラスコを1XPBSで2回洗浄します。 フラスコ(2 mL溶液/T75フラスコ)で直接、または酵素剥離後の1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに好ましい脂溶性色素で細胞にラベルを付けます。光への暴露を避け、37°Cで細胞をインキュベートします(条件/解決策については 表1 および 表2 を参照)。 フラスコでラベリングする場合 染料を取り出し、1x PBSで洗浄し、EDTAとセルスクレーパーで細胞を取り外します。 細胞を1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに移します。遠心分離機は300 x g で5分間、ステップ4.5に進みます。 1.5 mLマイクロ遠心分離チューブでラベリングする場合: 遠心分離機を300xgで5分間、染料を除去し、上清を捨てる。1x PBSで再び洗ってください。 遠心分離機は300 x g で5分、ステップ4.5に進みます。 上清を捨て、細胞培養培地でペレットを再懸濁します(50μLペレット添加~培地150~200μL)。 トリパンブルー排除または他の選択方法を用いてノイバウアーチャンバーを使用して細胞生存率を定量化する。 遠心分離機を300xgで4分間、上清を捨てる。注射媒体の細胞を再中断します。注:推奨される細胞濃度(一般的に0.25-0.5×106 セル/μL)および培地は 表1にあります。 この時点から、細胞を氷の上に置いておきます。 5. 注入手順 1x Tricaineで5分間胚を麻酔します。 プラスチック製のパスツールピペットを使用して、少量(〜50)の麻酔下の胚をアガロースプレートに移し、ヘアピンループの助けを借りて慎重に整列させます。胚の間の距離、特に1個の黄身と次の卵黄の頭部との間の距離を維持するようにしてください(図4A)。注:整列する胚の数は、注射を行う研究者の専門知識のレベルによって異なります。いくつかの(〜10-20)から始めます。寒天/アガロースプレートにおける胚の正しい位置の概略については 、図4Aを参照してください。 1-3滴のトリケーヌ溶液をプレートに慎重に加えることによって、アガロースプレートで整列した胚が乾燥しないようにして、死亡率を防ぎます。 マイクロ遠心チューブを軽くタップして細胞を再懸濁します。彼らは胚の完全性を損なうことができるので、気泡を避けるマイクロローダーチップを使用して細胞懸濁液で注射針をバックロードします。 空気圧弁(40 psi)を開き、マイクロインジェクターを設置し、マイクロインジェクションニードルをホルダーに慎重に設置します。注:次の推奨マイクロインジェクタ設定を使用してください:圧力を保持する – ベント(3 psi)。圧力を排出する – 通気孔。範囲 – 100ミリ秒。 顕微鏡下で#5または類似のDumont鉗子で先端近くのマイクロインジェクション針を切ります。注:先端は、細胞が詰まることなく通過し、胚を損傷して細胞を失うことを避けるために十分に鈍く、薄くなければなりません。太いマイクロ注射針の先端は、胚を傷つけると浮腫やゼブラフィッシュの死の形成を促進します.経緯線は針の校正には使用されません。詳細な 説明については、「ディスカッション 」を参照してください。 胚を注入する前に、マイクロインジェクター圧を、ゼブラフィッシュ胚の目の大きさと同様の体積を〜1〜3パルスパルスするまで、最も低い排出圧力で始まるかどうかを試験する。注:トレーニングの開始時に可能な限り蛍光体顕微鏡を使用することをお勧めします。これにより、蛍光標識された細胞の同定が容易になります。 胚の黄身の真ん中に慎重に突き刺し、針の角度を下げ、針の先端がペリビテリン空間(PVS)に達するまで慎重に押す(図4B-D)。 マイクロインジェクタペダルを押して、PVSに細胞を注入します。胚の目をガイドとして使用してください。心臓浮腫を防ぐために、胚の目の大きさに似た細胞の量と心臓から可能な限り遠くに細胞を注入してみてください。 慎重に針を取り出し、次の胚に移動します。 必要に応じてマイクロインジェクターの圧力を調整します。注:セルは詰まりを開始する傾向があるため、圧力が高くなる可能性があります。必要に応じて、圧力を下げながら毛細管を切断(直径を大きくする)することが可能です。 注入した胚を1x Tricaine溶液できれいなペトリ皿(表4)に移し、5〜10分間休ませます。これは傷が閉じる時間を与えるでしょう。注:寒天プレートからペトリ皿に胚を移すために、胚の上に1x Tricaine溶液を数滴加え、プラスチック製のパスツールピペットで慎重に収集します。採取した胚を1xトリケーヌ溶液で新しいペトリ皿に落とします。 1x Tricaine溶液を取り外し、新鮮なE3培地を追加します。 34°Cで異種移植片をインキュベートする(ヒト細胞株生存とゼブラフィッシュの発達8との間の温度が損なわれる)。 6. 転移アッセイ 約1時間の注入後(hpi)で、注入された胚を蛍光体顕微鏡でスクリーニングし、異種移植片を2つのグループに分類します(図5A)または循環中の細胞の存在(図5B)。。注:心臓または循環で1つの癌細胞しか検出されない場合でも、循環中の細胞を持つ異種移植片のグループにこれらの異種移植片が含まれる。あるいは、細胞を循環に直接注入して、この群の異種移植片の数を増やすことができる。 7. 1日ポストインジェクション 蛍光体型顕微鏡では各胚を注意深く分析し、適切に注射された腫瘍を持つものを選択する(図6)。注:必要に応じて、スクリーニング前にトリケーヌ1X溶液で注入された胚を麻酔してください。 次の胚/異種移植片を捨てる(図6A-A’):• 腫瘍/異常形態/死なず、• 心臓および/または黄身浮腫• 卵黄の腫瘍細胞のみで、•非常に少数の癌細胞を有する。 腫瘍のサイズに応じて選択した異種移植片を並べ替えます。比較のために目のサイズを使用します(図6B-B’、6C)。• 眼の大きさよりも小さい腫瘍(+)• 眼と同じ大きさの腫瘍(++)• 眼の大きさよりも大きい腫瘍 (+++). 所望の実験レイアウトに従って異種移植片を配布し、薬物アッセイ(対照対薬物等)を開始する。薬物およびE3培地を毎日交換する(表4)。 アッセイの終わりまで34°Cの温度を維持する異種移植片をインキュベートする。 8. 4日投与後注射 アッセイの最終日に、1x Tricaine溶液で異種移植片を麻酔し、寒天プレートに慎重に位置合わせします。注:死んだ、または腫れた異種移植片を捨てよ。薬物治療およびいくつかの腫瘍細胞は、毒性を誘発し、最終的に異種移植片の死亡率を引き起こす可能性がある。これらの異種移植片は、生着定量のために考慮されていません。 生着の割合を決定するには:蛍光体顕微鏡上で各生きた異種移植片を分析し、PVSにおける腫瘍の存在(図6D)/存在(図6E)を評価する。 転移の割合を決定するには:蛍光体顕微鏡上で各異種移植片を分析し、以前に定義された2つのグループの尾状造血組織(CHT)における微小転移の有無を評価する(CIRCおよびNO CIRC、図6F) 実験のセットアップによると、目的の異種移植片を選択し、25倍トリケーヌでそれらを安楽死させる(表3)。 室温(RT)または4°Cで一晩で少なくとも4時間4%ホルムアルデヒド(FA)でそれらを固定します。注:PBS/0.1%トリトンで4%で希釈したメタノールフリーホルムアルデヒド(16)を使用してください。固定性でチューブを上部に充填します。チューブを水平に配置して、すべての異種移植片の均質な固定を確保し、透過性を高め、ゼブラフィッシュが底部に凝集するのを防ぎます。 または、パイプ(1 mLあたり:1 Mパイプナトリウム塩(4°C)の1μL、1M MgSO 4(RT)の1 μL、0.5 M EGTA(RT)の4 μL、16(RT)の93.7 μL、ddH2Oの801.3 μLを使用して固定します。注:パイプは、4よりも優れたRFPとmCherryトランスジェニックラインの蛍光を保持します。 免疫染色が別の日に行われる場合は、FAを100%メタノール(MetOH)に置き換えます。100%メタノールに固定された異種移植片は、−20°Cで無期限に保存することができる。注:MetOHは、いくつかの染色(すなわち、ファロイジン)の効率を損ない、いくつかの蛍光標識をクエンチすることができます。あらかじめ、MetOH固定サンプル中の抗体の効率を確認してください。 9. コンフォーカルイメージング用の全マウント免疫染色 注:全体のマウント免疫蛍光技術は、次のように分割3日かかります:最初の日は、異種移植片と一次抗体インキュベーションの透過性です。洗浄および二次抗体インキュベーションの2日目および3日目は、洗浄、異種移植片の固定および取り付け培地中の貯蔵のためである。 1日目 異種移植片を100%MetOHに保存した場合、一連のMetOH濃度の減少(75%、50%、25%MetOH希釈)によって再水和します。FAで固定されている場合は、PBS /0.1%トリトンで交換してください。 PBS/0.1%トリトンで4倍の5分間洗浄します。 H2Oで1倍5分間洗います。注:特に明記されていない限り、チューブは常に固定、透過、洗浄のステップで水平に配置する必要があります。 H2Oを氷冷アセトンに交換し、-20°Cで7分間インキュベートします。注:アセトン付き50 mLチューブを-20°Cに置き、使用する準備が整います。マイクロ遠心チューブは、アセトンが漏れないようにラックの上 に垂直 に配置する必要があります。 PBS/0.1%トリトンで2倍の10分間洗浄します。 RTで1時間PBDX_GSブロッキング溶液をインキュベートする(PBDX_GSブロッキングバッファー:1x PBSの50 mL;0.5gのウシ血清アルブミン- BSA;0.5 mLのDMSO;250 μLの10%トリトン;750 μLのヤギ血清 – GS(15μL/1 mL) PBDX_GS取り除き、一次抗体希釈液の約40μLを加えます(一般的に1:100)。注:一次抗体希釈量は、マイクロ遠心分離管内に存在する異種移植片の数によって異なります。すべての異種移植片が水没していることを確認します。 RTで1時間インキュベートし、その後4°Cで一晩インキュベートします。チューブを縦に配置します。 2日目 一次抗体を取り除き、PBS/0.1%トリトンで2倍の10分間洗浄します。 PBS/0.05%トゥイーンで30分間4倍洗います。注:次の手順は、暗闇の中で実行する必要があります(光からチューブを保護するためにアルミ箔を使用してください)。 PBS/0.05% Tweenを取り除き、PBDX_GSで希釈した2次抗体希釈液(一般的に1:200-1:400)+DAPI(50 μg/mL)を加えます。 RTで1時間インキュベートし、その後4°Cで一晩インキュベートします。チューブを縦に配置し、光から保護します。 3日目(光からチューブを保護するためにアルミホイルを使用) 二次抗体希釈を除去し、PBS/0.05%Tweenで15分間4倍洗浄します。 4で20分間室温で固定します。 PBS/0.05%トゥイーンで1倍の5分間洗います。 PBS/0.05% Tweenを取り外し、各マイクロ遠心チューブに水性取り付け媒体を1滴加えます。チューブを縦に配置します。 取り付けまで光から保護された4°Cで取付けまたは保管してください。チューブを縦に配置します。 10. 異種移植片の取り付け 注:マイクロ遠心チューブをプロセス全体にわたって光から保護します。ゼブラフィッシュ異種移植片は、2つのカバーリップ(24 x 60 mm #1.5)の間に取り付けられています。これにより、腫瘍の両側(上側および下面)がアクセス可能になるように、共焦点イメージング中に取り付けられた異種移植片を反転させることができます。取り付け媒体とプラスチックピペットを使用しないでください – 異種移植片は、ピペットに巻き込まれる可能性があります。次の手順の概略図については、 図 7 を参照してください。 カバースリップYにラベルを付け、取り付け媒体の漏れを避けるために、カバースリップXの端を石油ゼリーまたはシリコーングリースで密封します。 ガラスパスツールピペットで異種移植片をカバースリップXに移します。 慎重にヘアピンでそれらを整列し、余分な水性取り付けメディアを取り除きます。 カバースリップ Y に水性取り付けメディアを追加します。 カバースリップ X の上にカバースリップ Y を慎重に配置します。これは潜在的に異種移植片を混乱させる可能性がありますので、カバーリップを押しないでください。 組み立てたカバーリップを顕微鏡スライドの上に置き、透明な粘着テープで固定します。これにより、共焦点イメージングと保存を容易に操作できます。 11. 共焦点イメージング 注: 水補正を備えたアポクロマティック 25x 浸漬対物レンズは、単一細胞解像度の PVS 腫瘍のイメージングに最適です(例については、 図 8C-C” および 図 9A を参照してください)。 各スライス間の間隔を5μmのzスタック関数を使用してサンプルを取得します。3D再構成を目的とした画像、特に血管では、スライス間に1〜3μmの間隔を使用します(図8A)。 12. 分析と定量 共焦点画像処理および解析には、フィジー/ImageJソフトウェアまたは類似のソフトウェアを使用してください。 フィジーソフトウェアで生データ(.czi、.lsmなど)を開きます。 コンポジット モードですべてのチャネルまたは単一チャネルのみを選択するには、[ イメージ>カラー>チャネル ツール] をクリックします。 明るさとコントラストのレベルを調整するには、[ イメージ>>カラーバランスを調整する] をクリックします。 腫瘍サイズを定量化するには 腫瘍の代表的なスライスを、上、中央、下から、異種移植片ごとにzスタックごとに選択する(図8 A)。注意:共焦点の決断は腫瘍の深さの60-70 μmを達成する。腫瘍が大きい場合、その総体積を画像化することができない場合がある。 スプレッドシートを開いてデータにアナティを付ける。 選択した3つのスライス内の腫瘍細胞に対応するすべてのDAPI核を数える(図8 A、B)。これを行うには: 「プラグイン」をクリックして、フィジー/ImageJからセルカウンタープラグイン >開く> セル カウンタ ツールで、[ 初期化] をクリックし、カウンタ タイプを選択してイメージをクリックし、カウント モードを手動で開始します。カウンタは、クリックするたびに、カウントされるセルの数 (クリック数) を加算します。 1 つの完全なスライスをカウントした後、対応する Excel ドキュメントにセル番号を保存します。 フィジーに戻り、同じカウンタが使用される場合は、[セルカウンタ]ウィンドウから[リセット]をクリックして情報を削除します。それ以外の場合は、情報を保持することができ、他のカウンターは、他のスライス (またはセル) で使用できます。 2 番目の代表スライスに移動し、前の手順を繰り返します。すべてのデータを収集します。注: DAPI カウンタ化は、個々のセルの明確な定義のためにセル数をカウントするために一般的に使用されていますが、他のセル固有の染色を使用することができます。 腫瘍の細胞の総数を取得するには、次の式を使用します。注:1.5補正数は、平均核径が10~12μmの細胞について推定されました。セルが大きくなったり小さくなったりする場合、この補正を行う必要があります。この方法の詳細については 、Dicussion を参照してください。 他のマーカー(免疫細胞、有糸数図、PPH3、活性化Caspase3、Ki67など)を定量化するには、同じプラグインを使用してすべてのスライスを定量化します(有糸分裂図の視覚化については 図8C-C’を 参照)。カウントされた細胞の総数を対応する腫瘍サイズで割り、100 を掛けてパーセンテージを求めます。注: 一部のセルは 2 つのスライスの間に配置され、Z スタック内を行き来して、1 つのセルが 2 回カウントされないように注意してください。