Använda fokuserad jonstrålefräsning för att producera glasartade lameller på nätet från frysta biologiska prover för kryoelektrontomografi.
Här presenteras ett protokoll för beredning av kryolameller från djupfrysta galler av Plasmodium falciparum-infekterade humana erytrocyter, som lätt kan anpassas för andra biologiska prover. De grundläggande principerna för beredning av prover, fräsning och visning av lameller är gemensamma för alla instrument och protokollet kan följas som en allmän guide till kryo-lamellberedning på nätet för kryoelektronmikroskopi (kryo-elektronmikroskopi) och kryoelektrontomografi (kryoET). Elektronmikroskopigaller som stöder cellerna fryses i flytande kvävekyld flytande etan med hjälp av en manuell eller automatiserad frys och screenas sedan på ett ljusmikroskop utrustat med ett kryosteg. Frysta galler överförs till ett kryo-skanningselektronmikroskop utrustat med en fokuserad jonstråle (cryoFIB-SEM). Galler är rutinmässigt sputterbelagda före fräsning, vilket underlättar spridning av laddningsuppbyggnad under fräsning. Alternativt kan en e-balk roterande beläggning användas för att applicera ett lager kol-platina på gallren, vars exakta tjocklek kan kontrolleras mer exakt. Väl inne i kryoFIB-SEM appliceras en ytterligare beläggning av en organoplatinaförening på nätets yta via ett gasinjektionssystem (GIS). Detta skikt skyddar lamellens framkant när den fräss, vars integritet är avgörande för att uppnå jämnt tunna lameller. Intressanta regioner identifieras via SEM och fräsning utförs stegvis, vilket minskar jonstrålens ström när lamellen når elektrontransparens för att undvika överdriven värmeproduktion. Ett galler med flera lameller överförs sedan till ett transmissionselektronmikroskop (TEM) under kryogena förhållanden för insamling av tilt-serier. Ett robust och kontamineringsfritt arbetsflöde för lamellberedning är ett viktigt steg för nedströmstekniker, inklusive cellulär kryoEM, kryoET och subtomogrammedelvärde. Utveckling av dessa tekniker, särskilt för lyftning och malning av högtrycksfrysta prover, är av hög prioritet i fält.
Endast det cellulära innehållet i biologiska prover < 500 nm tjockt kan avbildas effektivt genom transmissionselektronmikroskopi (TEM) vid kryogena temperaturer, vilket begränsar provintervallet till virus, prokaryoter, enkla encelliga organismer och tunnare regioner av större eukaryota celler1. On-grid-fokuserad jonstrålefräsning (FIB) gör det möjligt att tunnas ut tjockare djupfrysta biologiska prover till elektrontransparenta lameller vid kryogena temperaturer (< -150 °C). De resulterande lamellerna överförs sedan till en TEM för visualisering och tomografisk datainsamling, vilket möjliggör högupplösta 3D-rekonstruktioner av cellulära och molekylära egenskaper inuti celler (för recensioner se Rigort et al., 20122, Oikonomou et al., 20163 och Wagner et al., 20204).
FIB-fräsning uppstod från materialvetenskapen, där prover rutinmässigt gallras för att förbereda dem för nedströmsanalys5. Det utförs i ett svepelektronmikroskop (SEM), som har två optiska kolumner: konventionell skanningselektronmikroskopoptik och en andra kolonn som innehåller optik som kan generera och finstyra en fokuserad jonstråle (FIB) – kallad FIB-SEM. Detta gör att en specifik region av provet kan ableras av joner genererade av en galliumkälla, avlägsna överflödigt material och lämna efter sig en lamell6. Fräsningsprocessen styrs av SEM-avbildning av provets topografi, som används för att lokalisera intressanta regioner och övervaka fräsningsförloppet. För biologiska tillämpningar är grundinställningen i stort sett densamma, men malning utförs vid kryogena temperaturer. Detta har krävt att standard FIB-SEM anpassas för att ha kryokylda steg som upprätthåller konstanta temperaturer och låga ytkontamineringshastigheter, samt luftslussar för att underlätta provöverföring utan devitrifiering eller kontaminering. Provskyttlar har också modifierats för att tillåta en rad olika bärare att monteras inuti kryoFIB-SEM, inklusive TEM-galler, planchetter och kapillärer. Flera nyckelgrupper av forskare har varit centrala för utvecklingen av dessa metoder och de fortsatta tekniska framstegen inom detta område 7,8,9,10,11,12. Kommersiella lösningar är nu mer allmänt tillgängliga för biologisk FIB-fräsning vid kryogen temperatur och malning av lameller på nätet blir mer rutinmässigt, givet ett optimerat prov.
En rad rumstemperatur- och kryoEM-tekniker kan användas för att visualisera cellulär information över alla livsskalor, från hela flercelliga organismer med blygsam upplösning till att förstå sammanhanget för komplexa processer på cellulär nivå och i ännu större detalj, till bestämning av in situ Molekylära strukturer13,14,15,16,17,18,19. Klassiska rumstemperaturtekniker inkluderar sektionering av fixerade och färgade, hartsinbäddade celler och vävnader genom ultramikrotomi för analys av cellulär morfologi med TEM (för granskning se Studer et al., 200820). Alternativa tekniker har utvecklats genom att utnyttja sekundär elektronspridning av SEM för att avbilda ytan på block av bevarade celler, innan material gradvis avlägsnas antingen med en kniv (seriell blockavbildning) eller en fokuserad jonstråle21,22,23. Denna teknik har också framgångsrikt implementerats vid kryogena temperaturer (kallad kryovolymavbildning) med en kryoFIB-SEM på glasaktiga, ofärgade block av celler eller vävnader24. Alternativt kan tjockare lameller (~ 15 μm tjocka) fräsas och studeras genom STEM-avbildning25. Med hjälp av dessa tekniker kan hela block som innehåller många celler avbildas för att samla befolkningsinformation eller ett helt organ / organism kan avbildas och rekonstrueras i 3D. För att få tillgång till högupplöst molekylär information från celler måste prover dock bevaras i ett nästan inhemskt, fryst hydratiserat tillstånd och måste därför beredas under kryogena förhållanden. Kryoelektronmikroskopi av glaskroppssektioner (CEMOVIS) är en teknik där högtrycksfrysta block av biologiskt material skärs under kryogena förhållanden med en ultramikrotom. Detta ger band av kryosektioner (40-100 nm tjocka)26, som är anslutna till ett EM-rutnät och avbildade i TEM. Knivens fysiska interaktion med glaskroppsprovet orsakar emellertid sprickor och kompressionsartefakter som allvarligt kan snedvrida cellulär struktur27,28,29,30. Tjockare sektioner är mer benägna att dessa artefakter, vilket gör det opraktiskt att använda sektioner tjockare än ~ 70 nm26. Denna begränsning begränsar kraftigt 3D-vyn av den biologiska strukturen i tomogrammet. FIB-fräsning vid kryogena temperaturer upplever inte dessa problem, men har sina egna artefakter orsakade av olika fräshastigheter över delar av provet, vilket leder till varierande tjocklekar inom en lamell – kallad gardin. Detta problem mildras genom applicering av en organoplatinabeläggning applicerad via ett gasinsprutningssystem (GIS), som skyddar lamellens framkant under fräsning31. Den övre gränsen för provtjocklek för FIB-fräsning på nätet definieras av förmågan att frysa provet samtidigt som det förblir glasaktigt32, men med införandet av kryolyftningstekniker och anpassade provbärare för biologiska prover kan FIB-fräsning också användas för att bearbeta frysta prover med högt tryck31,33,34,35. Dessutom kan frysta prover inte vara för tunna eftersom det måste finnas tillräckligt med biologiskt material för att generera en lagom stor lamell som ger tillräckligt med yta för att samla lutningsserier vid önskad förstoring. Detta problem kan lindras genom att mala klumpar av mindre celler, såsom bakterier eller jäst. Slutlig lamelltjocklek (~ 100-300 nm) dikteras vanligtvis av provets integritet och fräsningsstrategi. Tunnare lameller är bättre för högupplöst strukturellt arbete, såsom subtomogrammedelvärde, men tjockare lameller innehåller mycket större cellulära volymer än vad som kan uppnås med CEMOVIS, vilket ger mer cellulärt sammanhang i ett nära till naturligt bevarat prov. FIB-fräsning kan också användas för att tunna djupfrysta proteinkristaller för elektrondiffraktionsstudier36.
FIB-fräsning av glasceller är värt tiden och ansträngningen att utföra om den vetenskapliga frågan kräver högupplösta molekylära detaljer av nära inhemska prover in situ. Med tillgång till fler anläggningar för rutinproduktion av lameller är det hastighetsbegränsande steget ofta optimering av provet före malning, där tid måste tas för att säkerställa att provet är glasaktigt och en lämplig tjocklek för att producera robusta och jämnt tunna lameller. Här beskrivs provoptimeringen för FIB-fräsning av djupfrysta humana röda blodkroppar infekterade med Plasmodium falciparum-parasiter , malarians orsakssamband, men detta tillvägagångssätt kan anpassas för ett givet prov.
Medan kryoFIB-fräsning blir mer rutinmässig har beredning av optimala prover för fräsning inte; därför inträffar de flesta av de kritiska stegen i detta protokoll innan provet når kryoFIB-SEM. Provoptimering genom flera omgångar av cellberedning, doppfrysning och screening med ljus- och elektronmikroskopi krävs för att producera bästa möjliga prov innan fräsning försöks. Att ha bästa möjliga prov ökar inte bara chanserna för framgång utan optimerar också användningen av utrustningen. Av denna anledning kräver de flesta nationella anläggningar bevis för att tillräcklig optimering har utförts innan de beviljar tid på sina maskiner. Väl inne i kryoFIB-SEM är det viktigt att maximera effektiviteten hos den organoplatina beläggningen för att producera jämnt tunna lameller. Slutligen är tålamod och god provhantering en förutsättning för användaren, som kommer att behöva sitta i flera dagar för att producera och sedan överföra galler som innehåller känsliga lameller. Detta kan förändras med införandet av automatiserade frässtrategier47,48, men än så länge är hela malningsprocessen fortfarande till stor del manuell på de flesta anläggningar.
Medan arbetet enbart fokuserade på P. falciparum schizonts, kunde metoden som presenteras här enkelt modifieras för att optimera nätberedning och fräsning för andra celltyper. Viktiga faktorer att tänka på är densiteten hos cellerna som appliceras på gallret, rutnätstypen (koppar är giftigt för vissa celler), storleken och avståndet mellan hål i kolfilmen, blottningstiden och metoden för blotting (enkel/dubbelsidig, manuell eller automatiserad). Dessutom, om cellerna odlas på gallret (vanligtvis guldnät med en hålig kolfilm), kan sammanflödet kontrolleras med ljusmikroskopi före blottning och frysning. Fräsningsstrategin beror på hur cellerna deponeras på gallret. För malariainfekterade röda blodkroppar är gallret i huvudsak belagt av ett obrutet lager av celler, tjockare i vissa områden och tunnare i andra områden. Fräsning utförs på flera punkter i ett område längs denna gradient där istjockleken genererar lameller som är en lämplig storlek för tomografi. Detta tillvägagångssätt fungerar bra för mindre celler eftersom du kan producera lameller som innehåller en skiva genom flera celler. För större celler eller klumpar av celler kan det vara så att en cell eller cellklump kan producera en lamell.
Näthantering och provöverföring är fortfarande en av de största utmaningarna i detta arbetsflöde. Lameller kan gå förlorade på grund av brott eller sprickor, gardinartefakter som döljer biologin, överdriven ytkontaminering samt problem med nätorientering inom TEM, vilket kräver ett extra hanteringssteg för att flytta gallret. Graden av förluster varierar från dag till dag och rutnät till rutnät, men det förbättras genom övning och hanteringserfarenhet över tid. I denna studie fann man att gallren kan omorienteras noggrant i autoladdaren flera gånger utan att förstöra lameller och detta har ibland fördelen att tvätta bort ytis. En annan viktig begränsning av detta arbetsflöde är den tid det tar att producera lameller. Eftersom produktionen är långsam är det viktigt att ha ett korrekt optimerat prov, vilket gör fräsningen så effektiv som möjligt.
Ett antal anpassningar av FIB-fräsning av glaskroppsprover har nyligen införts. En spelväxlare är implementeringen av kryogeniskt kylda lyftverktyg i kryoFIB-SEM-kammaren som gör det möjligt att fräsa större materialblock från högtrycksfrysta prover. Blocken kan fästas på en metallstav eller plockas upp i en gripare och flyttas till en andra provposition, innehållande ett speciellt modifierat EM-rutnät. Blocken kan sedan beläggas med organoplatina och fräsas för att generera lameller. Förmågan att mala lameller från högtrycksfryst material innebär att mycket större celler och vävnader kan bearbetas, specifikt riktade områden genom korrelativ fluorescensmikroskopi12. Andra nya anpassningar av FIB-fräsningsmetoden inkluderar minskning av gardinartefakter genom kilförfräsning av provet16, mikrofluidisk kryofixering49 och fotomikromönstring av elektronmikroskopinät för att förbättra cellfördelningen50. Det har också visats att fräsning av mikroexpansionsgap på vardera sidan av en lamell kan lindra kompressionen av det omgivande provet när det når sin slutliga tunnhet51. Detta kan vara särskilt användbart vid fräsning av kontinuerliga cellskikt, såsom provet i denna studie, där böjning av lameller ibland ses under det sista poleringssteget.
Framtiden för elektronmikroskopi kommer sannolikt att vara bestämning av in situ-molekylära strukturer genom subtomogrammedelvärde och FIB-fräsning är ett viktigt verktyg som underlättar produktionen av glaskroppsbiologiska prover för dessa typer av arbetsflöden. Medan FIB-fräsning fortfarande är i sin linda för biologiska tillämpningar, sker metodutveckling i snabb takt tack vare hårt arbete från forskare, både akademiska och vid nationella anläggningar, plus kommersiella investeringar i att utveckla kryoFIB-SEM-teknik för att stödja forskning.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning finansierades helt eller delvis av Wellcome Trust (212916/Z/18/Z). För öppen tillgång har författaren tillämpat en CC BY offentlig upphovsrättslicens på alla författaraccepterade manuskriptversioner som härrör från detta bidrag.
Detta projekt för vilket denna metod utvecklades finansierades av ett Medical Research Council-anslag MR/P010288/1 som tilldelades Helen R. Saibil, Roland A. Fleck och Michael J. Blackman. Kulturer av P. falciparum odlades vid The Francis Crick Institute, med stöd av medlemmar i Michael J. Blackmans grupp. Författarna vill tacka Dr. Ser Ying (Michele) Tan för att ha tillhandahållit bilderna av förening 2 och E64-behandlade schizonter i tunna blodutstryk. De flesta lamellerna producerades med stöd från personal på eBIC och vi är tacksamma för tillgång till Scios dubbelstrålande kryoFIB-SEM på forskningsförslag NT21004. Författarna erkänner också stödet från Royal Society Industry Fellowship-systemet (INF\R2\202061) för att fortsätta utvecklingen av FIB-fräsningstekniken inom CUI. Författarna vill också tacka Helen R. Saibil för nyttiga diskussioner i relation till detta metoddokument och handledning av projektet.
c-clips | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | |
Clipping station | Thermo Fisher Scientific | n/a | Direct quote from Thermo |
Clipping station | Sub-angstrom | CSA-01 | |
Compound 2 | n/a | n/a | Synthesised by Dr Simon A. Osborne, LifeArc |
Cryo-FIB specific autogrid rims | Thermo Fisher Scientific | 1205101 | |
E64 | Sigma | E3132 | |
Emitech K100X glow discharge unit | Quorum | n/a | |
Gibco RPMI 1640 media | Thermo Fisher Scientific | 12633012 | Formulation used for culturing is custom made (REF 041-91762 A) and includes Albumax, glutamine, HEPES and hypoxanthine supplements |
Giemsa Stain | VWR International | 350864X | |
Glass slides | Thermo Fisher Scientific | 11562203 | |
Grid boxes | Sub-angstrom | PB | For clipped grids |
Grid boxes | Thermo Fisher Scientific | n/a | For clipped grids – direct quote from Thermo Fisher Scientific |
Grid boxes | Agar Scientific | AGG3727 | |
Home-made manual plunge freezing rig | n/a | n/a | With an insulated ethane pot (high-density foam) and liquid nitrogen bath (polystyrene) on a bench top in a containment facility. |
Human blood | n/a | n/a | UK National Blood and Transplant service |
JEOL 4700F Z JSM with a Leica VCT500 stage cooling system | JEOL | n/a | FIB-SEM |
Leica EM ACE600 with a VCT500 cryostage | Leica | n/a | sputter coater |
Leica EM ACE900 | Leica | n/a | e-beam rotary coater. In a humidity controlled room. |
Linkam cryo-stage for light microscope | Linkam | Model No. CMS196 | Cassettes for clipped and un-clipped grids. In a humidity controlled room. |
Methanol | Sigma | 179957 | |
Nikon Eclipse E200 light microscope | Nikon | n/a | with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room. |
Percoll | VWR International | 17-0891-01 | Solution for percoll cushion is 35 ml 10x PBS, 150 ml RPMI 1640 media and 315 ml Percoll |
Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM Finder grids | Quantifoil | N1-C17nCuH2-01 | 100 pack |
Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM grids | Quantifoil | N1-C17nCu20-01 | 100 pack |
Quorum PP3010 prep-chamber | Quorum | n/a | sputter coater |
Scios dual beam equipped with a Quorum PP3010 transfer stage. | FEI | n/a | FIB-SEM |
Staedtler Lumocolor fine black permanent marker pen | Viking Direct | ND538522 | |
TFS Titan Krios 300 kV TEM | Thermo Fisher Scientific | n/a | TEM equipped with a K2 or K3 camera. |
Whatmann grade 1 filter paper | Sigma | WHA1001150 | |
Zeiss Axio Scope A1 light microscope | Zeiss | n/a | with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room. |