Ved hjelp av fokusert ionstrålefresing for å produsere glassaktige lameller på nettet fra stupefrosne biologiske prøver for kryo-elektrontomografi.
Presentert her er en protokoll for fremstilling av kryo-lameller fra stupfrosne rister av Plasmodium falciparum-infiserte humane erytrocytter, som lett kan tilpasses for andre biologiske prøver. De grunnleggende prinsippene for fremstilling av prøver, fresing og visning av lameller er felles for alle instrumenter, og protokollen kan følges som en generell veiledning for kryo-lamellforberedelse på nettet for kryo-elektronmikroskopi (kryoEM) og kryo-elektrontomografi (cryoET). Elektronmikroskopigitter som støtter cellene, stupefryses ned i flytende nitrogenkjølt flytende etan ved hjelp av en manuell eller automatisert dykkfryser, og screenes deretter på et lysmikroskop utstyrt med et kryotrinn. Frosne rister overføres til et kryoskanningselektronmikroskop utstyrt med en fokusert ionstråle (cryoFIB-SEM). Rister blir rutinemessig sputter belagt før fresing, noe som hjelper spredning av ladningsoppbygging under fresing. Alternativt kan en e-stråle roterende coater brukes til å påføre et lag karbon-platina til rutenettene, hvis nøyaktige tykkelse kan kontrolleres mer nøyaktig. Inne i kryoFIB-SEM påføres et ekstra belegg av en organoplatinumforbindelse på overflaten av rutenettet via et gassinjeksjonssystem (GIS). Dette laget beskytter lamellens forkant når den er malt, hvis integritet er avgjørende for å oppnå jevnt tynne lameller. Regioner av interesse identifiseres via SEM og fresing utføres trinnvis, noe som reduserer strømmen av ionstrålen når lamellen når elektrongjennomsiktighet for å unngå overdreven varmeutvikling. Et rutenett med flere lameller overføres deretter til et transmisjonselektronmikroskop (TEM) under kryogene forhold for tilt-serieoppkjøp. En robust og forurensningsfri arbeidsflyt for lamellklargjøring er et viktig trinn for nedstrømsteknikker, inkludert cellulær kryoEM, kryoET og gjennomsnitt av sub-tomogram. Utvikling av disse teknikkene, spesielt for løft og fresing av høytrykksfrosne prøver, er høyt prioritert i feltet.
Bare det cellulære innholdet i biologiske prøver <500 nm tykt kan avbildes effektivt ved transmisjonselektronmikroskopi (TEM) ved kryogene temperaturer, og begrenser prøveområdet til virus, prokaryoter, enkle encellede organismer og tynnere områder av større eukaryote celler1. On-grid fokusert ionstråle (FIB)-fresing gjør at tykkere stupfrosne biologiske prøver kan tynnes til elektrontransparente lameller ved kryogene temperaturer (< -150 ° C). De resulterende lamellene overføres deretter til en TEM for visualisering og tomografisk datainnsamling, noe som muliggjør høyoppløselige 3D-rekonstruksjoner av de cellulære og molekylære egenskapene inne i celler (for vurderinger, se Rigort et al., 20122, Oikonomou et al., 20163, og Wagner et al., 20204).
FIB-fresing dukket opp fra materialvitenskap, hvor prøver rutinemessig tynnes for å forberede dem for nedstrømsanalyse5. Det utføres i et skanningelektronmikroskop (SEM), som har to optiske kolonner: konvensjonell skanningelektronmikroskopoptikk og en andre kolonne som inneholder optikk som kan generere og finstyre en fokusert ionstråle (FIB) – kalt en FIB-SEM. Dette gjør at en bestemt region av prøven kan ableres av ioner generert av en galliumkilde, fjerne overflødig materiale og etterlate en lamell6. Freseprosessen styres av SEM-avbildning av prøvens topografi, som brukes til å lokalisere regioner av interesse og overvåke fresefremgang. For biologiske applikasjoner er det grunnleggende oppsettet stort sett det samme, men fresing utføres ved kryogene temperaturer. Dette har krevd at standard FIB-SEM-er må tilpasses for å ha kryokjølte trinn som opprettholder konstante temperaturer og lave overflateforurensningsrater, samt luftsluser for å lette prøveoverføring uten avvik eller forurensning. Prøveskyttelbussene har også blitt modifisert for å gjøre det mulig å montere en rekke forskjellige bærere inne i kryoFIB-SEM, inkludert TEM-gitter, planchetter og kapillærer. Flere sentrale forskergrupper har vært sentrale i utviklingen av disse metodene og den fortsatte teknologiske utviklingen på dette området 7,8,9,10,11,12. Kommersielle løsninger er nå mer allment tilgjengelige for biologisk FIB-fresing ved kryogen temperatur, og on-grid fresing av lameller blir mer rutinemessig, gitt en optimalisert prøve.
En rekke romtemperatur- og kryoEM-teknikker kan brukes til å visualisere cellulær informasjon på tvers av alle livets skalaer, fra hele flercellede organismer med beskjeden oppløsning til å forstå sammenhengen mellom komplekse prosesser på mobilnivå og i enda større detalj, til bestemmelse av in situ Molekylære strukturer13,14,15,16,17,18,19. Klassiske romtemperaturteknikker inkluderer seksjonering av faste og fargede, harpikspregede celler og vev ved ultramikrotomi for analyse av cellulær morfologi ved TEM (for gjennomgang se Studer et al., 200820). Alternative teknikker har blitt utviklet ved å utnytte sekundær elektronspredning av SEM for å avbilde overflaten av blokker av bevarte celler, før man gradvis fjerner materiale enten med en kniv (seriell blokk ansiktsbilde) eller en fokusert ionstråle21,22,23. Denne teknikken har også blitt implementert ved kryogene temperaturer (referert til som kryovolumavbildning) med en cryoFIB-SEM på glassaktige, ufargede blokker av celler eller vev24. Alternativt kan tykkere lameller (~15 μm tykke) freses og studeres ved STEM-avbildning25. Ved hjelp av disse teknikkene kan hele blokker som inneholder mange celler avbildes for å samle befolkningsinformasjon, eller et helt organ / organisme kan avbildes og rekonstrueres i 3D. For å få tilgang til høyoppløselig molekylær informasjon fra celler, må prøvene imidlertid bevares i en nær-innfødt, frossen-hydrert tilstand og må derfor fremstilles under kryogene forhold. Kryo-elektronmikroskopi av glasslegemesnitt (CEMOVIS) er en teknikk der høytrykksfrosne blokker av biologisk materiale seksjoneres under kryogene forhold med et ultramikrotom. Dette gir bånd av kryoseksjoner (40-100 nm tykke)26, som er koblet til et EM-rutenett og avbildet i TEM. Imidlertid forårsaker den fysiske samspillet mellom kniven og glassprøven sprekker og kompresjonsartefakter som kan forvride cellulær struktur alvorlig27,28,29,30. Tykkere seksjoner er mer utsatt for disse artefaktene, noe som gjør det upraktisk å bruke seksjoner tykkere enn ~ 70 nm26. Denne begrensningen begrenser i stor grad 3D-visningen av den biologiske strukturen i tomogrammet. FIB-fresing ved kryogene temperaturer opplever ikke disse problemene, men har sine egne artefakter forårsaket av differensielle fresehastigheter over deler av prøven, noe som fører til variable tykkelser i en lamell – kalt gardinering. Dette problemet reduseres ved påføring av et organoplatinumbelegg påført via et gassinjeksjonssystem (GIS), som beskytter lamellens forkant under fresing31. Den øvre grensen for prøvetykkelse for FIB-fresing på nettet er definert av evnen til å stupe fryse prøven mens du holder den glassaktig32, men med introduksjonen av kryoutløftingsteknikker og tilpassede prøvebærere for biologiske prøver, kan FIB-fresing også brukes til å behandle høytrykksfrosne prøver31,33,34,35. I tillegg kan stupefrosne prøver ikke være for tynne, da det må være nok biologisk materiale til å generere en lamell av rimelig størrelse som vil gi nok overflateareal til å samle tilt-serier ved ønsket forstørrelse. Dette problemet kan lindres ved å frese klumper av mindre celler, for eksempel bakterier eller gjær. Endelig lamelltykkelse (~ 100-300 nm) dikteres vanligvis av prøveintegriteten og fresestrategien. Tynnere lameller er bedre for høyoppløselig strukturelt arbeid, for eksempel sub-tomogram gjennomsnitt, men tykkere lameller inneholder mye større cellulære volumer enn det som kan oppnås ved CEMOVIS, noe som gir mer cellulær kontekst i en nær til naturlig bevart prøve. FIB-fresing kan også brukes til å tynne stupfrosne proteinkrystaller for elektrondiffraksjonsstudier36.
FIB-fresing av glassceller er verdt tiden og kreftene å utføre hvis det vitenskapelige spørsmålet krever høyoppløselige molekylære detaljer av nærfødte prøver in situ. Med tilgang til flere fasiliteter for rutinemessig produksjon av lameller, er hastighetsbegrensende trinn ofte optimalisering av prøven før fresing, hvor det må tas tid for å sikre at prøven er glassaktig og en passende tykkelse for å produsere robuste og jevnt tynne lameller. Beskrevet her er prøveoptimaliseringen for FIB-fresing av stupefrosne humane røde blodlegemer infisert med Plasmodium falciparum-parasitter , det forårsakende middelet til malaria, men denne tilnærmingen kan tilpasses for en gitt prøve.
Mens kryoFIB-fresing blir mer rutinemessig, har ikke klargjøring av optimale prøver for fresing gjort det; Derfor skjer de fleste kritiske trinnene i denne protokollen før prøven når kryoFIB-SEM. Prøveoptimalisering ved flere runder med cellepreparering, stupefrysing og screening ved lys- og elektronmikroskopi er nødvendig for å produsere best mulig prøve før fresing forsøkes. Å ha best mulig prøve øker ikke bare sjansene for suksess, men optimaliserer også bruken av utstyret. Av denne grunn krever de fleste nasjonale anlegg bevis på at tilstrekkelig optimalisering er utført før de gir tid på maskinene sine. Inne i kryoFIB-SEM er det avgjørende å maksimere effektiviteten til organoplatinumbelegget for å produsere jevnt tynne lameller. Til slutt er tålmodighet og god prøvehåndtering en forutsetning fra brukeren, som vil bli pålagt å sitte i flere dager og produsere og deretter overføre rister som inneholder delikate lameller. Dette kan endre seg med introduksjonen av automatiserte fresestrategier47,48, men foreløpig er hele freseprosessen fortsatt stort sett manuell på de fleste anlegg.
Mens arbeidet fokuserte utelukkende på P. falciparum schizonts, kunne metoden som presenteres her enkelt modifiseres for å optimalisere gridforberedelse og fresing for andre celletyper. Viktige faktorer å vurdere er tettheten av cellene som påføres rutenettet, rutenetttypen (kobber er giftig for noen celler), størrelsen og avstanden mellom hull i karbonfilmen, blottingstiden og metoden for blotting (enkelt / dobbeltsidig, manuell eller automatisert). I tillegg, hvis cellene dyrkes på ristene (vanligvis gullgitter med en holey karbonfilm), kan sammenløp kontrolleres ved lysmikroskopi før blotting og frysing. Fresestrategien avhenger av hvordan cellene er avsatt på rutenettet. For malariainfiserte røde blodlegemer, er rutenettet i hovedsak belagt av et ubrutt lag av celler, tykkere i enkelte områder og tynnere i andre områder. Fresing utføres på flere punkter i en region langs denne gradienten hvor istykkelsen genererer lameller som er en passende størrelse for tomografi. Denne tilnærmingen fungerer bra for mindre celler, da du kan produsere lameller som inneholder et stykke gjennom flere celler. For større celler eller klumper av celler, kan det være tilfelle at en celle eller celle klump kan produsere en lamell.
Netthåndtering og prøveoverføring er fortsatt en av hovedutfordringene i denne arbeidsflyten. Lameller kan gå tapt på grunn av brudd eller sprekker, gardinerende gjenstander som skjuler biologien, overdreven overflateforurensning, samt rutenettorienteringsproblemer i TEM, noe som krever et ekstra håndteringstrinn for å flytte rutenettet. Graden av tap varierer fra dag til dag og fra nett til nett, men det forbedres gjennom praksis og håndteringserfaring over tid. I denne studien ble det funnet at ristene kan omorienteres forsiktig i autoloaderen flere ganger uten å ødelegge lameller, og dette har noen ganger fordelen av å vaske av overflateis. En annen hovedbegrensning i denne arbeidsflyten er tiden det tar å produsere lameller. Siden produksjonen er treg, er det avgjørende å ha en riktig optimalisert prøve, noe som gjør fresingen så effektiv som mulig.
En rekke tilpasninger til FIB-fresing av biologiske prøver i glasslegemet er nylig introdusert. En game-changer er implementeringen av kryogenisk avkjølte løfteverktøy i cryoFIB-SEM-kammeret som gjør det mulig å frese større blokker av materiale fra høytrykksfrosne prøver. Blokkene kan festes til en metallstang eller plukkes opp i en griper og flyttes til en annen prøveposisjon, som inneholder et spesielt modifisert EM-rutenett. Blokkene kan deretter belegges med organoplatinum og freses for å generere lameller. Evnen til å male lameller fra høytrykksfrosset materiale betyr at mye større celler og vev kan behandles, spesielt rettet mot områder ved korrelativ fluorescensmikroskopi12. Andre nylige tilpasninger til FIB-fresemetoden inkluderer reduksjon av gardineringsartefakter ved kileprefresing av prøven16, mikrofluidisk kryofiksering49 og fotomikromønster av elektronmikroskopigitter for å forbedre cellefordelingen50. Det har også blitt påvist at fresing av mikroekspansjonsgap på hver side av en lamell kan lindre kompresjonen av den omkringliggende prøven når den når sin endelige tynnhet51. Dette kan være spesielt nyttig ved fresing av kontinuerlige cellelag, slik som prøven i denne studien, hvor bøying av lameller noen ganger ses under det siste poleringstrinnet.
Fremtiden for elektronmikroskopi vil trolig være bestemmelse av in situ molekylære strukturer ved sub-tomogram gjennomsnitt og FIB-fresing er et viktig verktøy som vil lette produksjonen av glassaktige biologiske prøver for disse typer arbeidsflyter. Mens FIB-fresing fortsatt er i sin barndom for biologiske anvendelser, skjer metodeutviklingen i et raskt tempo takket være det harde arbeidet til forskere, både akademiske og ved nasjonale anlegg, pluss kommersielle investeringer i å utvikle cryoFIB-SEM-teknologi for å støtte forskning.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble finansiert helt eller delvis av Wellcome Trust (212916/Z/18/Z). Med henblikk på åpen tilgang har forfatteren anvendt en CC BY offentlig opphavsrettslisens til enhver forfatterakseptert manuskriptversjon som oppstår fra denne innsendingen.
Dette prosjektet som denne metoden ble utviklet for, ble finansiert av et medisinsk forskningsråds stipend MR / P010288 / 1 tildelt Helen R. Saibil, Roland A. Fleck og Michael J. Blackman. Kulturer av P. falciparum ble dyrket ved Francis Crick Institute, med støtte fra medlemmer av Michael J. Blackmans gruppe. Forfatterne vil gjerne takke Dr. Ser Ying (Michele) Tan for å gi bildene av sammensatte 2 og E64-behandlede schizonter i tynne blodutstryk. De fleste lamellene ble produsert med støtte fra ansatte ved eBIC, og vi er takknemlige for tilgang til Scios dual-beam cryoFIB-SEM på forskningsforslag NT21004. Forfatterne anerkjenner også støtten fra Royal Society Industry Fellowship-ordningen (INF\R2\202061) i å fortsette utviklingen av FIB-freseteknikken innen CUI. Forfatterne vil også takke Helen R. Saibil for nyttige diskusjoner i forhold til denne metodeoppgaven og veiledning av prosjektet.
c-clips | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | |
Clipping station | Thermo Fisher Scientific | n/a | Direct quote from Thermo |
Clipping station | Sub-angstrom | CSA-01 | |
Compound 2 | n/a | n/a | Synthesised by Dr Simon A. Osborne, LifeArc |
Cryo-FIB specific autogrid rims | Thermo Fisher Scientific | 1205101 | |
E64 | Sigma | E3132 | |
Emitech K100X glow discharge unit | Quorum | n/a | |
Gibco RPMI 1640 media | Thermo Fisher Scientific | 12633012 | Formulation used for culturing is custom made (REF 041-91762 A) and includes Albumax, glutamine, HEPES and hypoxanthine supplements |
Giemsa Stain | VWR International | 350864X | |
Glass slides | Thermo Fisher Scientific | 11562203 | |
Grid boxes | Sub-angstrom | PB | For clipped grids |
Grid boxes | Thermo Fisher Scientific | n/a | For clipped grids – direct quote from Thermo Fisher Scientific |
Grid boxes | Agar Scientific | AGG3727 | |
Home-made manual plunge freezing rig | n/a | n/a | With an insulated ethane pot (high-density foam) and liquid nitrogen bath (polystyrene) on a bench top in a containment facility. |
Human blood | n/a | n/a | UK National Blood and Transplant service |
JEOL 4700F Z JSM with a Leica VCT500 stage cooling system | JEOL | n/a | FIB-SEM |
Leica EM ACE600 with a VCT500 cryostage | Leica | n/a | sputter coater |
Leica EM ACE900 | Leica | n/a | e-beam rotary coater. In a humidity controlled room. |
Linkam cryo-stage for light microscope | Linkam | Model No. CMS196 | Cassettes for clipped and un-clipped grids. In a humidity controlled room. |
Methanol | Sigma | 179957 | |
Nikon Eclipse E200 light microscope | Nikon | n/a | with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room. |
Percoll | VWR International | 17-0891-01 | Solution for percoll cushion is 35 ml 10x PBS, 150 ml RPMI 1640 media and 315 ml Percoll |
Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM Finder grids | Quantifoil | N1-C17nCuH2-01 | 100 pack |
Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM grids | Quantifoil | N1-C17nCu20-01 | 100 pack |
Quorum PP3010 prep-chamber | Quorum | n/a | sputter coater |
Scios dual beam equipped with a Quorum PP3010 transfer stage. | FEI | n/a | FIB-SEM |
Staedtler Lumocolor fine black permanent marker pen | Viking Direct | ND538522 | |
TFS Titan Krios 300 kV TEM | Thermo Fisher Scientific | n/a | TEM equipped with a K2 or K3 camera. |
Whatmann grade 1 filter paper | Sigma | WHA1001150 | |
Zeiss Axio Scope A1 light microscope | Zeiss | n/a | with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room. |