क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के लिए जमे हुए जैविक नमूनों से विट्रस ऑन-ग्रिड लैमेला का उत्पादन करने के लिए केंद्रित आयन बीम मिलिंग का उपयोग करना।
यहां प्रस्तुत प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम-संक्रमित मानव एरिथ्रोसाइट्स के डुबकी-जमे हुए ग्रिड से क्रायो-लैमेला तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल है, जिसे आसानी से अन्य जैविक नमूनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। नमूने तैयार करने, मिलिंग और लैमेला देखने के लिए बुनियादी सिद्धांत सभी उपकरणों के लिए आम हैं और प्रोटोकॉल का पालन क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायोईएम) और क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (क्रायोईटी) के लिए ऑन-ग्रिड क्रायो-लैमेला तैयारी के लिए एक सामान्य गाइड के रूप में किया जा सकता है। कोशिकाओं का समर्थन करने वाले इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड को मैनुअल या स्वचालित प्लांक फ्रीजर का उपयोग करके तरल नाइट्रोजन-कूल्ड तरल ईथेन में डुबकी हुई होती है, फिर क्रायो-स्टेज से लैस प्रकाश माइक्रोस्कोप पर जांच की जाती है। जमे हुए ग्रिड को एक केंद्रित आयन बीम (क्रायोएफआईबी-एसईएम) से लैस क्रायो-स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में स्थानांतरित किया जाता है। मिलिंग से पहले ग्रिड को नियमित रूप से स्पटर लेपित किया जाता है, जो मिलिंग के दौरान चार्ज बिल्ड-अप के फैलाव में सहायता करता है। वैकल्पिक रूप से, एक ई-बीम रोटरी कोटर का उपयोग ग्रिड में कार्बन-प्लैटिनम की एक परत को लागू करने के लिए किया जा सकता है, जिसकी सटीक मोटाई को अधिक सटीक रूप से नियंत्रित किया जा सकता है। एक बार क्रायोएफआईबी-एसईएम के अंदर एक गैस इंजेक्शन सिस्टम (जीआईएस) के माध्यम से ग्रिड की सतह पर एक ऑर्गनोप्लाटिनम यौगिक की एक अतिरिक्त कोटिंग लागू की जाती है। यह परत लैमेला के सामने के किनारे की रक्षा करती है क्योंकि यह मिल जाती है, जिसकी अखंडता समान रूप से पतली लैमेला प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। एसईएम के माध्यम से रुचि के क्षेत्रों की पहचान की जाती है और मिलिंग को चरण-वार तरीके से किया जाता है, जिससे आयन बीम की धारा कम हो जाती है क्योंकि लैमेला इलेक्ट्रॉन पारदर्शिता तक पहुंचता है, ताकि अत्यधिक गर्मी उत्पादन से बचा जा सके। कई लैमेला वाले ग्रिड को फिर झुकाव-श्रृंखला अधिग्रहण के लिए क्रायोजेनिक स्थितियों के तहत ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (टीईएम) में स्थानांतरित किया जाता है। लैमेला तैयारी के लिए एक मजबूत और संदूषण-मुक्त वर्कफ़्लो डाउनस्ट्रीम तकनीकों के लिए एक आवश्यक कदम है, जिसमें सेलुलर क्रायोईएम, क्रायोएट और सब-टोमोग्राम औसत शामिल हैं। इन तकनीकों का विकास, विशेष रूप से लिफ्ट-आउट और उच्च दबाव वाले जमे हुए नमूनों की मिलिंग के लिए, क्षेत्र में उच्च प्राथमिकता है।
क्रायोजेनिक तापमान पर ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) द्वारा केवल जैविक नमूनों की सेलुलर सामग्री <500 एनएम मोटी को प्रभावी ढंग से चित्रित किया जा सकता है, जिससे नमूनों की सीमा वायरस, प्रोकैरियोट्स, सरल एकल-सेलुलर जीवों और बड़े यूकेरियोटिककोशिकाओं के पतले क्षेत्रों तक सीमित हो जाती है। ऑन-ग्रिड केंद्रित आयन बीम (एफआईबी) -मिलिंग मोटे डुबकी-जमे हुए जैविक नमूनों को क्रायोजेनिक तापमान (< -150 डिग्री सेल्सियस) पर इलेक्ट्रॉन पारदर्शी लैमेला में पतला करने में सक्षम बनाता है। परिणामी लैमेला को तब विज़ुअलाइज़ेशन और टोमोग्राफिक डेटा संग्रह के लिए एक टीईएम में स्थानांतरित किया जाता है, जिससे कोशिकाओं के अंदर सेलुलर और आणविक विशेषताओं के उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी पुनर्निर्माण को सक्षम किया जाता है (समीक्षा ओं के लिए देखें रिगोर्ट एट अल, 20122, ओइकोनोमो एट अल।
एफआईबी-मिलिंग सामग्री विज्ञान के क्षेत्र से उभरा, जहां नमूनों को डाउनस्ट्रीमविश्लेषण के लिए तैयार करने के लिए नियमित रूप से पतला किया जाता है। यह एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (एसईएम) में किया जाता है, जिसमें दो ऑप्टिकल कॉलम होते हैं: पारंपरिक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप ऑप्टिक्स और एक दूसरा कॉलम जिसमें ऑप्टिक्स होता है जो एक केंद्रित आयन बीम (एफआईबी) को उत्पन्न करने और बारीक नियंत्रित करने में सक्षम होता है – जिसे एफआईबी-एसईएम कहा जाता है। यह नमूने के एक विशिष्ट क्षेत्र को गैलियम स्रोत द्वारा उत्पन्न आयनों द्वारा अलग करने की अनुमति देता है, अतिरिक्त सामग्री को हटाता है और लैमेला6 को पीछे छोड़ देता है। मिलिंग प्रक्रिया को नमूने की स्थलाकृति के एसईएम इमेजिंग द्वारा निर्देशित किया जाता है, जिसका उपयोग रुचि के क्षेत्रों का पता लगाने और मिलिंग प्रगति की निगरानी के लिए किया जाता है। जैविक अनुप्रयोगों के लिए, मूल सेटअप काफी हद तक समान है, लेकिन मिलिंग क्रायोजेनिक तापमान पर की जाती है। इसके लिए मानक एफआईबी-एसईएम को क्रायो-कूल्ड चरणों के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है जो निरंतर तापमान और कम सतह संदूषण दर बनाए रखते हैं, साथ ही साथ एयरलॉक ्स को डेविट्रीफिकेशन या संदूषण के बिना नमूना हस्तांतरण की सुविधा प्रदान करते हैं। नमूना शटल को क्रायोएफआईबी-एसईएम के अंदर विभिन्न वाहकों की एक श्रृंखला को लगाने की अनुमति देने के लिए भी संशोधित किया गया है, जिसमें टीईएम ग्रिड, प्लानचेट्स और केशिकाएं शामिल हैं। शोधकर्ताओं के कई प्रमुख समूह इन विधियों के विकास औरइस क्षेत्र में निरंतर तकनीकी प्रगति 7,8,9,10,11,12 के लिए केंद्रीय रहे हैं। क्रायोजेनिक तापमान पर जैविक एफआईबी-मिलिंग के लिए वाणिज्यिक समाधान अब अधिक व्यापक रूप से उपलब्ध हैं और लैमेला की ऑन-ग्रिड मिलिंग एक अनुकूलित नमूना दी गई है।
कमरे के तापमान और क्रायोईएम तकनीकों की एक श्रृंखला का उपयोग जीवन के सभी पैमानों पर सेलुलर जानकारी की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है, मामूली संकल्प पर पूरे बहुकोशिकीय जीवों से लेकर सेलुलर स्तर पर जटिल प्रक्रियाओं के संदर्भ को समझने के लिए और इससे भी अधिक विस्तार से, in situ आणविक संरचनाएं;13,14,15,16,17,18,19. शास्त्रीय कमरे के तापमान तकनीकों में टीईएम द्वारा सेलुलर आकृति विज्ञान के विश्लेषण के लिए अल्ट्रामाइक्रोटॉमी द्वारा स्थिर और दागदार, राल स्थिर कोशिकाओं और ऊतकों को विभाजित करना शामिल है (समीक्षा के लिए देखें स्टडर एट अल।20). वैकल्पिक तकनीकों को एसईएम द्वारा संरक्षित कोशिकाओं के ब्लॉकों की सतह की छवि बनाने के लिए द्वितीयक इलेक्ट्रॉन प्रकीर्णन का फायदा उठाने के लिए विकसित किया गया है, इससे पहले कि सामग्री को चाकू (सीरियल ब्लॉक फेस इमेजिंग) या केंद्रित आयन बीम के साथ धीरे-धीरे हटाया जाए।21,22,23. इस तकनीक को क्रायोजेनिक तापमान (क्रायो-वॉल्यूम इमेजिंग के रूप में संदर्भित) पर भी सफलतापूर्वक लागू किया गया है, जिसमें कोशिकाओं या ऊतकों के विट्रस, बिना दाग वाले ब्लॉकों पर क्रायोएफआईबी-एसईएम है।24. वैकल्पिक रूप से, मोटी लैमेला (~ 15 μm मोटी) को STEM इमेजिंग द्वारा मिलाया और अध्ययन किया जा सकता है।25. इन तकनीकों का उपयोग करके, जनसंख्या की जानकारी इकट्ठा करने के लिए कई कोशिकाओं वाले पूरे ब्लॉक को चित्रित किया जा सकता है या एक पूरे अंग / जीव को 3 डी में चित्रित और पुनर्निर्माण किया जा सकता है। हालांकि, कोशिकाओं से उच्च-रिज़ॉल्यूशन आणविक जानकारी तक पहुंचने के लिए, नमूनों को निकट-देशी, जमे हुए-हाइड्रेटेड अवस्था में संरक्षित करने की आवश्यकता होती है और इसलिए, क्रायोजेनिक परिस्थितियों में तैयार करने की आवश्यकता होती है। क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ऑफ विट्रियस सेक्शन (सीईएमओवीआईएस) एक ऐसी तकनीक है जिसके तहत जैविक सामग्री के उच्च दबाव वाले जमे हुए ब्लॉकों को एक अल्ट्रामाइक्रोटोम के साथ क्रायोजेनिक स्थितियों के तहत वर्गीकृत किया जाता है। यह क्रायो-सेक्शन (40-100 एनएम मोटी) के रिबन का उत्पादन करता है।26, जो एक ईएम ग्रिड से जुड़े होते हैं और टीईएम में चित्रित होते हैं। हालांकि, विट्रियस नमूने के साथ चाकू की शारीरिक बातचीत क्रेवसिंग और संपीड़न कलाकृतियों का कारण बनती है जो सेलुलर संरचना को गंभीर रूप से विकृत कर सकती हैं।27,28,29,30. मोटे खंड इन कलाकृतियों के लिए अधिक प्रवण होते हैं, जिससे ~ 70 एनएम से अधिक मोटे वर्गों का उपयोग करना अव्यावहारिक हो जाता है।26. यह सीमा टोमोग्राम में जैविक संरचना के 3 डी दृश्य को बहुत प्रतिबंधित करती है। क्रायोजेनिक तापमान पर एफआईबी-मिलिंग इन समस्याओं का अनुभव नहीं करता है, लेकिन नमूने के कुछ हिस्सों में अंतर मिलिंग दरों के कारण इसकी अपनी कलाकृतियां होती हैं, जिससे लैमेला के भीतर परिवर्तनीय मोटाई होती है – जिसे पर्दा कहा जाता है। इस समस्या को गैस इंजेक्शन सिस्टम (जीआईएस) के माध्यम से लागू एक ऑर्गनोप्लाटिनम कोट के आवेदन से कम किया जाता है, जो मिलिंग के दौरान लैमेला के सामने के किनारे की रक्षा करता है।31. ऑन-ग्रिड एफआईबी-मिलिंग के लिए नमूना मोटाई की ऊपरी सीमा को नमूना को विट्रियस रखते हुए फ्रीज करने की क्षमता से परिभाषित किया गया है।32हालांकि, क्रायो लिफ्ट-आउट तकनीकों की शुरूआत और जैविक नमूनों के लिए अनुकूलित नमूना वाहक के साथ, एफआईबी-मिलिंग का उपयोग उच्च दबाव वाले जमे हुए नमूनों को संसाधित करने के लिए भी किया जा सकता है।31,33,34,35. इसके अतिरिक्त, जमे हुए नमूने बहुत पतले नहीं हो सकते हैं क्योंकि एक उचित आकार के लैमेला उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त जैविक सामग्री होनी चाहिए जो आवश्यक आवर्धन पर झुकाव-श्रृंखला एकत्र करने के लिए पर्याप्त सतह क्षेत्र प्रदान करेगी। बैक्टीरिया या खमीर जैसे छोटे कोशिकाओं के मिलिंग क्लंप द्वारा इस समस्या को कम किया जा सकता है। अंतिम लैमेला मोटाई (~ 100-300 एनएम) आमतौर पर नमूना अखंडता और मिलिंग रणनीति द्वारा निर्धारित की जाती है। पतली लैमेला उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनात्मक कार्य के लिए बेहतर हैं, जैसे कि उप-टोमोग्राम औसत, लेकिन मोटे लैमेला में सीईएमओवीआईएस द्वारा प्राप्त की जा सकने वाली तुलना में बहुत बड़े सेलुलर वॉल्यूम होते हैं, जो मूल रूप से संरक्षित नमूने में अधिक सेलुलर संदर्भ प्रदान करते हैं। इलेक्ट्रॉन विवर्तन अध्ययन के लिए एफआईबी-मिलिंग का उपयोग डुबकी-जमे हुए प्रोटीन क्रिस्टल को पतला करने के लिए भी किया जा सकता है।36.
विट्रियस कोशिकाओं की एफआईबी-मिलिंग समय और प्रयास के लायक है यदि वैज्ञानिक प्रश्न को सीटू में निकट-देशी नमूनों के उच्च-रिज़ॉल्यूशन आणविक विवरण की आवश्यकता होती है। लैमेला के नियमित उत्पादन के लिए अधिक सुविधाओं तक पहुंच के साथ, दर सीमित कदम अक्सर मिलिंग से पहले नमूने का अनुकूलन होता है, जहां यह सुनिश्चित करने के लिए समय लिया जाना चाहिए कि नमूना विट्रस है और मजबूत और समान रूप से पतली लैमेला का उत्पादन करने के लिए एक उपयुक्त मोटाई है। यहां वर्णित मलेरिया के प्रेरक एजेंट प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम परजीवी से संक्रमित एफआईबी-मिलिंग डुबकी-जमे हुए मानव लाल रक्त कोशिकाओं के लिए नमूना अनुकूलन है, लेकिन इस दृष्टिकोण को किसी भी नमूने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
जबकि क्रायोएफआईबी-मिलिंग अधिक नियमित हो रही है, मिलिंग के लिए इष्टतम नमूने तैयार नहीं किए गए हैं; इसलिए, इस प्रोटोकॉल में अधिकांश महत्वपूर्ण कदम नमूना क्रायोएफआईबी-एसईएम तक पहुंचने से पहले होते हैं। मिलिंग का प्रयास करने से पहले सर्वोत्तम संभव नमूना तैयार करने के लिए सेल तैयारी, डुबकी ठंड, और प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा स्क्रीनिंग के कई दौर द्वारा नमूना अनुकूलन की आवश्यकता होती है। सबसे अच्छा नमूना संभव होने से न केवल सफलता की संभावना बढ़ जाती है, बल्कि उपकरणों के उपयोग को भी अनुकूलित किया जाता है। इस कारण से, अधिकांश राष्ट्रीय सुविधाओं को सबूत की आवश्यकता होती है कि उनकी मशीनों पर समय देने से पहले पर्याप्त अनुकूलन किया गया है। एक बार क्रायोएफआईबी-एसईएम के अंदर, समान रूप से पतली लैमेला का उत्पादन करने के लिए ऑर्गनोप्लाटिनम कोट की प्रभावशीलता को अधिकतम करना महत्वपूर्ण है। अंत में, धैर्य और अच्छा नमूना हैंडलिंग उपयोगकर्ता से एक शर्त कौशल है, जिसे कई दिनों तक बैठने और फिर नाजुक लैमेला युक्त ग्रिड को स्थानांतरित करने की आवश्यकता होगी। यह स्वचालित मिलिंग रणनीतियों47,48 की शुरूआत के साथ बदल सकता है, लेकिन अभी तक, पूरी मिलिंग प्रक्रिया अभी भी अधिकांश सुविधाओं में काफी हद तक मैनुअल है।
जबकि काम पूरी तरह से पी फाल्सीपेरम स्किज़ोन्ट्स पर केंद्रित था, यहां प्रस्तुत विधि को अन्य सेल प्रकारों के लिए ग्रिड तैयारी और मिलिंग को अनुकूलित करने के लिए आसानी से संशोधित किया जा सकता है। विचार करने के लिए महत्वपूर्ण कारक ग्रिड पर लागू होने वाली कोशिकाओं का घनत्व, ग्रिड प्रकार (तांबा कुछ कोशिकाओं के लिए विषाक्त है), कार्बन फिल्म में छेद का आकार और अंतराल, ब्लॉटिंग समय और ब्लॉटिंग की विधि (एकल / दो पक्षीय, मैनुअल, या स्वचालित) हैं। इसके अतिरिक्त, यदि कोशिकाओं को ग्रिड (आमतौर पर एक छिद्रित कार्बन फिल्म के साथ सोने के ग्रिड) पर उगाया जा रहा है, तो सोख्ता और ठंड से पहले प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा कंफ्लुएंसी की जांच की जा सकती है। मिलिंग रणनीति इस बात पर निर्भर करती है कि ग्रिड पर कोशिकाओं को कैसे जमा किया जाता है। मलेरिया संक्रमित लाल रक्त कोशिकाओं के लिए, ग्रिड अनिवार्य रूप से कोशिकाओं की एक अटूट परत द्वारा लेपित होता है, कुछ क्षेत्रों में मोटा और अन्य क्षेत्रों में पतला होता है। मिलिंग इस ढाल के साथ एक क्षेत्र में कई बिंदुओं पर किया जाता है जहां बर्फ की मोटाई लैमेला उत्पन्न करती है जो टोमोग्राफी के लिए उपयुक्त आकार है। यह दृष्टिकोण छोटी कोशिकाओं के लिए अच्छी तरह से काम करता है क्योंकि आप कई कोशिकाओं के माध्यम से एक टुकड़ा युक्त लैमेला का उत्पादन कर सकते हैं। बड़ी कोशिकाओं या कोशिकाओं के झुरमुट के लिए, यह मामला हो सकता है कि एक सेल या सेल क्लंप एक लैमेला का उत्पादन कर सकता है।
ग्रिड हैंडलिंग और नमूना स्थानांतरण इस वर्कफ़्लो की मुख्य चुनौतियों में से एक है। लैमेला टूटने या दरारों के कारण खो सकता है, जीव विज्ञान को प्रभावित करने वाली कलाकृतियों को पर्दे पर उतारना, अत्यधिक सतह संदूषण, साथ ही टीईएम के भीतर ग्रिड अभिविन्यास समस्याओं के कारण, ग्रिड को पुनर्स्थापित करने के लिए एक अतिरिक्त हैंडलिंग कदम की आवश्यकता होती है। नुकसान की डिग्री दिन-प्रतिदिन और ग्रिड-टू-ग्रिड से भिन्न होती है, लेकिन समय के साथ अभ्यास और हैंडलिंग अनुभव के माध्यम से इसमें सुधार होता है। इस अध्ययन में, यह पाया गया कि लैमेला को नष्ट किए बिना कई बार ऑटोलोडर में ग्रिड को सावधानीपूर्वक पुन: स्थापित किया जा सकता है और इससे कभी-कभी सतह की बर्फ को धोने का लाभ होता है। इस वर्कफ़्लो की एक और मुख्य सीमा लैमेला का उत्पादन करने में लगने वाला समय है। चूंकि उत्पादन धीमा है, इसलिए उचित रूप से अनुकूलित नमूना होना महत्वपूर्ण है, जिससे मिलिंग यथासंभव कुशल हो सके।
विट्रियस जैविक नमूनों के एफआईबी-मिलिंग के लिए कई अनुकूलन हाल ही में पेश किए गए हैं। एक गेम-चेंजर क्रायोएफआईबी-एसईएम चैंबर के भीतर क्रायोजेनिक रूप से ठंडा लिफ्ट-आउट टूल का कार्यान्वयन है जो सामग्री के बड़े ब्लॉकों को उच्च दबाव वाले जमे हुए नमूनों से मिलाने में सक्षम बनाता है। ब्लॉकों को धातु की छड़ से जोड़ा जा सकता है या ग्रिपर में उठाया जा सकता है और एक विशेष रूप से संशोधित ईएम ग्रिड युक्त दूसरी नमूना स्थिति में ले जाया जा सकता है। ब्लॉकों को तब ऑर्गनोप्लाटिनम के साथ लेपित किया जा सकता है और लैमेला उत्पन्न करने के लिए मिल किया जा सकता है। उच्च दबाव वाली जमी हुई सामग्री से लैमेला को मिलाने की क्षमता का मतलब है कि बहुत बड़ी कोशिकाओं और ऊतकों को संसाधित किया जा सकता है, विशेष रूप से कोररिलेटिव फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी12 द्वारा क्षेत्रों को लक्षित किया जा सकता है। एफआईबी-मिलिंग विधि के अन्य हालिया अनुकूलन में नमूना16 को वेज प्री-मिलिंग करके पर्दे की कलाकृतियों को कम करना, माइक्रोफ्लुइडिक क्रायो-फिक्सेशन49 और सेल वितरण50 में सुधार के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड की फोटो-माइक्रोपैटर्निंग शामिल है। इसके अलावा, यह प्रदर्शित किया गया है कि लैमेला के दोनों तरफ मिलिंग माइक्रो-विस्तार अंतराल आसपास के नमूने द्वारा संपीड़न को कम कर सकता है क्योंकि यह अपनी अंतिम पतलीता51 तक पहुंचता है। यह विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है जब निरंतर सेल परतों को मिलिंग किया जाता है, जैसे कि इस अध्ययन में नमूना, जहां लैमेला का झुकना कभी-कभी अंतिम पॉलिशिंग चरण के दौरान देखा जाता है।
इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का भविष्य संभवतः उप-टोमोग्राम औसत द्वारा सीटू आणविक संरचनाओं का निर्धारण होगा और एफआईबी-मिलिंग एक महत्वपूर्ण उपकरण है जो इस प्रकार के वर्कफ़्लो के लिए विट्रस जैविक नमूनों के उत्पादन की सुविधा प्रदान करेगा। जबकि एफआईबी-मिलिंग अभी भी जैविक अनुप्रयोगों के लिए अपनी प्रारंभिक अवस्था में है, विधियों का विकास अकादमिक और राष्ट्रीय सुविधाओं दोनों में शोधकर्ताओं की कड़ी मेहनत के कारण तेजी से हो रहा है, साथ ही अनुसंधान का समर्थन करने के लिए क्रायोएफआईबी-एसईएम प्रौद्योगिकी विकसित करने में वाणिज्यिक निवेश भी है।
The authors have nothing to disclose.
इस शोध को वेलकम ट्रस्ट (212916 / जेड / 18 / जेड) द्वारा पूरे या आंशिक रूप से वित्त पोषित किया गया था। खुली पहुंच के उद्देश्य से, लेखक ने इस सबमिशन से उत्पन्न होने वाले किसी भी लेखक स्वीकृत पांडुलिपि संस्करण के लिए एक सीसी बीवाई सार्वजनिक कॉपीराइट लाइसेंस लागू किया है।
यह परियोजना जिसके लिए इस पद्धति को विकसित किया गया था, को हेलेन आर सैबिल, रोलैंड ए फ्लेक और माइकल जे ब्लैकमैन को दिए गए मेडिकल रिसर्च काउंसिल अनुदान एमआर / P010288/1 द्वारा वित्त पोषित किया गया था। फाल्सीपेरम की संस्कृतियों को फ्रांसिस क्रिक इंस्टीट्यूट में उगाया गया था, माइकल जे ब्लैकमैन के समूह के सदस्यों के समर्थन से। सेर यिंग (मिशेल) टैन को पतले रक्त स्मीयर में यौगिक 2 और ई 64-उपचारित स्किज़ोन्ट्स की छवियां प्रदान करने के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। अधिकांश लैमेला का उत्पादन ईबीआईसी में कर्मचारियों के समर्थन से किया गया था और हम अनुसंधान प्रस्ताव NT21004 पर स्किओस डुअल-बीम क्रायोएफआईबी-एसईएम तक पहुंच के लिए आभारी हैं। लेखक सीयूआई के भीतर एफआईबी-मिलिंग तकनीक के विकास को जारी रखने में रॉयल सोसाइटी इंडस्ट्री फैलोशिप योजना (आईएनएफ\R2\202061) के समर्थन को भी स्वीकार करते हैं। लेखक इस मेथड्स पेपर के संबंध में उपयोगी चर्चा ओं और परियोजना की निगरानी के लिए हेलेन आर साइबिल को भी धन्यवाद देना चाहते हैं।
c-clips | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | |
Clipping station | Thermo Fisher Scientific | n/a | Direct quote from Thermo |
Clipping station | Sub-angstrom | CSA-01 | |
Compound 2 | n/a | n/a | Synthesised by Dr Simon A. Osborne, LifeArc |
Cryo-FIB specific autogrid rims | Thermo Fisher Scientific | 1205101 | |
E64 | Sigma | E3132 | |
Emitech K100X glow discharge unit | Quorum | n/a | |
Gibco RPMI 1640 media | Thermo Fisher Scientific | 12633012 | Formulation used for culturing is custom made (REF 041-91762 A) and includes Albumax, glutamine, HEPES and hypoxanthine supplements |
Giemsa Stain | VWR International | 350864X | |
Glass slides | Thermo Fisher Scientific | 11562203 | |
Grid boxes | Sub-angstrom | PB | For clipped grids |
Grid boxes | Thermo Fisher Scientific | n/a | For clipped grids – direct quote from Thermo Fisher Scientific |
Grid boxes | Agar Scientific | AGG3727 | |
Home-made manual plunge freezing rig | n/a | n/a | With an insulated ethane pot (high-density foam) and liquid nitrogen bath (polystyrene) on a bench top in a containment facility. |
Human blood | n/a | n/a | UK National Blood and Transplant service |
JEOL 4700F Z JSM with a Leica VCT500 stage cooling system | JEOL | n/a | FIB-SEM |
Leica EM ACE600 with a VCT500 cryostage | Leica | n/a | sputter coater |
Leica EM ACE900 | Leica | n/a | e-beam rotary coater. In a humidity controlled room. |
Linkam cryo-stage for light microscope | Linkam | Model No. CMS196 | Cassettes for clipped and un-clipped grids. In a humidity controlled room. |
Methanol | Sigma | 179957 | |
Nikon Eclipse E200 light microscope | Nikon | n/a | with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room. |
Percoll | VWR International | 17-0891-01 | Solution for percoll cushion is 35 ml 10x PBS, 150 ml RPMI 1640 media and 315 ml Percoll |
Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM Finder grids | Quantifoil | N1-C17nCuH2-01 | 100 pack |
Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM grids | Quantifoil | N1-C17nCu20-01 | 100 pack |
Quorum PP3010 prep-chamber | Quorum | n/a | sputter coater |
Scios dual beam equipped with a Quorum PP3010 transfer stage. | FEI | n/a | FIB-SEM |
Staedtler Lumocolor fine black permanent marker pen | Viking Direct | ND538522 | |
TFS Titan Krios 300 kV TEM | Thermo Fisher Scientific | n/a | TEM equipped with a K2 or K3 camera. |
Whatmann grade 1 filter paper | Sigma | WHA1001150 | |
Zeiss Axio Scope A1 light microscope | Zeiss | n/a | with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room. |