Brug af fokuseret ionstrålefræsning til fremstilling af glasagtige lameller på gitteret fra dybfrosne biologiske prøver til kryo-elektrontomografi.
Præsenteret her er en protokol til fremstilling af kryo-lameller fra dykfrosne gitter af Plasmodium falciparum-inficerede humane erythrocytter, som let kunne tilpasses til andre biologiske prøver. De grundlæggende principper for forberedelse af prøver, fræsning og visning af lameller er fælles for alle instrumenter, og protokollen kan følges som en generel vejledning til on-grid kryo-lamellpræparation til kryo-elektronmikroskopi (cryoEM) og kryo-elektrontomografi (cryoET). Elektronmikroskopigitter, der understøtter cellerne, kastes frosset ned i flydende nitrogenkølet flydende ethan ved hjælp af en manuel eller automatiseret springfryser og screenes derefter på et lysmikroskop udstyret med et kryo-trin. Frosne gitter overføres til et kryo-scanning elektronmikroskop udstyret med en fokuseret ionstråle (cryoFIB-SEM). Gitre er rutinemæssigt sputterbelagt inden fræsning, hvilket hjælper spredning af ladningsopbygning under fræsning. Alternativt kan en e-stråle roterende coater bruges til at påføre et lag kulstof-platin på gitterene, hvis nøjagtige tykkelse kan styres mere præcist. Når den er inde i cryoFIB-SEM, påføres en yderligere belægning af en organoplatinforbindelse på overfladen af gitteret via et gasindsprøjtningssystem (GIS). Dette lag beskytter lamellens forkant, når den fræses, hvis integritet er afgørende for at opnå ensartet tynde lameller. Interesseområder identificeres via SEM, og fræsning udføres trinvist, hvilket reducerer ionstrålens strøm, når lamellen når elektrongennemsigtighed, for at undgå overdreven varmegenerering. Et gitter med flere lameller overføres derefter til et transmissionselektronmikroskop (TEM) under kryogene betingelser for tilt-serie erhvervelse. En robust og kontamineringsfri arbejdsgang til lamelpræparation er et vigtigt skridt for downstream-teknikker, herunder cellulær cryoEM, cryoET og sub-tomogram-gennemsnit. Udvikling af disse teknikker, især til udtagning og fræsning af højtryksfrosne prøver, har høj prioritet i marken.
Kun det cellulære indhold af biologiske prøver <500 nm tykke kan afbildes effektivt ved transmissionselektronmikroskopi (TEM) ved kryogene temperaturer, hvilket begrænser prøveområdet til vira, prokaryoter, simple encellede organismer og tyndere områder af større eukaryote celler1. On-grid fokuseret ionstråle (FIB)-fræsning gør det muligt at tynde tykkere dykfrosne biologiske prøver til elektrongennemsigtige lameller ved kryogene temperaturer (< -150 °C). De resulterende lameller overføres derefter til en TEM til visualisering og tomografisk dataindsamling, hvilket muliggør 3D-rekonstruktioner i høj opløsning af de cellulære og molekylære egenskaber inde i celler (for anmeldelser se Rigort et al., 20122, Oikonomou et al., 20163, og Wagner et al., 20204).
FIB-fræsning opstod inden for materialevidenskab, hvor prøver rutinemæssigt tyndes for at forberede dem til downstream-analyse5. Det udføres i et scanningelektronmikroskop (SEM), som har to optiske søjler: konventionel scanningelektronmikroskopoptik og en anden kolonne indeholdende optik, der er i stand til at generere og fint styre en fokuseret ionstråle (FIB) – kaldet en FIB-SEM. Dette gør det muligt at ablere et bestemt område af prøven af ioner genereret af en galliumkilde, fjerne overskydende materiale og efterlade en lamel6. Fræseprocessen styres af SEM-billeddannelse af prøvens topografi, som bruges til at lokalisere områder af interesse og overvåge fræsningsfremskridt. Til biologiske applikationer er den grundlæggende opsætning stort set den samme, men fræsning udføres ved kryogene temperaturer. Dette har krævet, at standard FIB-SEM’er er tilpasset til at have kryokølede trin, der opretholder konstante temperaturer og lave overfladekontamineringshastigheder, samt luftsluser for at lette prøveoverførsel uden forvitring eller kontaminering. Prøvetransporter er også blevet modificeret for at gøre det muligt at montere en række forskellige bærere inde i cryoFIB-SEM, herunder TEM-gitre, planchetter og kapillærer. Flere nøglegrupper af forskere har været centrale for udviklingen af disse metoder og de fortsatte teknologiske fremskridt på området 7,8,9,10,11,12. Kommercielle løsninger er nu mere bredt tilgængelige til biologisk FIB-fræsning ved kryogen temperatur, og on-grid fræsning af lameller bliver mere rutine, givet en optimeret prøve.
En række rumtemperatur- og kryoEM-teknikker kan bruges til at visualisere cellulær information på tværs af alle livets skalaer, fra hele flercellede organismer med beskeden opløsning til forståelse af sammenhængen mellem komplekse processer på celleniveau og endnu mere detaljeret til bestemmelse af in situ molekylære strukturer13,14,15,16,17,18,19. Klassiske rumtemperaturteknikker omfatter sektionering af faste og farvede, harpiksindlejrede celler og væv ved ultramikrotomi til analyse af cellulær morfologi ved TEM (for gennemgang se Studer et al., 200820). Der er udviklet alternative teknikker, der udnytter sekundær elektronspredning af SEM til at afbilde overfladen af blokke af bevarede celler, før materiale gradvist fjernes enten med en kniv (seriel blokfladebilleddannelse) eller en fokuseret ionstråle21,22,23. Denne teknik er også blevet implementeret med succes ved kryogene temperaturer (kaldet cryovolumenbilleddannelse) med en cryoFIB-SEM på glasagtige, ufarvede blokke af celler eller væv24. Alternativt kan tykkere lameller (~ 15 μm tykke) fræses og studeres ved STEM-billeddannelse25. Ved hjælp af disse teknikker kan hele blokke, der indeholder mange celler, afbildes for at indsamle befolkningsinformation, eller et helt organ / organisme kan afbildes og rekonstrueres i 3D. For at få adgang til molekylær information med høj opløsning fra celler skal prøver imidlertid bevares i en næsten hjemmehørende, frosset hydratiseret tilstand og skal derfor forberedes under kryogene forhold. Kryo-elektronmikroskopi af glaslegemesektioner (CEMOVIS) er en teknik, hvorved højtryksfrosne blokke af biologisk materiale skæres under kryogene betingelser med et ultramikrotom. Dette producerer bånd af kryo-sektioner (40-100 nm tykke)26, som er knyttet til et EM-gitter og afbildet i TEM. Imidlertid forårsager knivens fysiske interaktion med glaslegemeprøven sprække- og kompressionsartefakter, der alvorligt kan forvrænge cellulær struktur27,28,29,30. Tykkere sektioner er mere tilbøjelige til disse artefakter, hvilket gør det upraktisk at bruge sektioner, der er tykkere end ~ 70 nm26. Denne begrænsning begrænser i høj grad 3D-visningen af den biologiske struktur i tomogrammet. FIB-fræsning ved kryogene temperaturer oplever ikke disse problemer, men har sine egne artefakter forårsaget af differentierede fræsehastigheder på tværs af dele af prøven, hvilket fører til variable tykkelser inden for en lamel – kaldet gardiner. Dette problem afhjælpes ved anvendelse af en organoplatinbelægning, der påføres via et gasindsprøjtningssystem (GIS), som beskytter lamellens forkant under fræsning31. Den øvre grænse for prøvetykkelse for FIB-fræsning på nettet defineres af evnen til at dykke fryse prøven, mens den holdes glasagtig32, selv om FIB-fræsning med indførelsen af cryo-udtagningsteknikker og tilpassede prøvebærere til biologiske prøver også kan anvendes til behandling af højtryksfrosne prøver31,33,34,35. Derudover kan dykfrosne prøver ikke være for tynde, da der skal være nok biologisk materiale til at generere en lamel af rimelig størrelse, der giver nok overfladeareal til at samle vippeserier ved den krævede forstørrelse. Dette problem kan afhjælpes ved at fræse klumper af mindre celler, såsom bakterier eller gær. Endelig lameltykkelse (~ 100-300 nm) dikteres normalt af prøveintegriteten og fræsestrategien. Tyndere lameller er bedre til strukturelt arbejde med høj opløsning, såsom sub-tomogramgennemsnit, men tykkere lameller indeholder meget større cellulære volumener, end CEMOVIS kan opnå, hvilket giver mere cellulær kontekst i en næsten til naturligt bevaret prøve. FIB-fræsning kan også bruges til at tynde dykfrosne proteinkrystaller til elektrondiffraktionsundersøgelser36.
FIB-formaling af glasagtige celler er værd at bruge tid og kræfter på at udføre, hvis det videnskabelige spørgsmål kræver molekylære detaljer med høj opløsning af næsten native prøver in situ. Med adgang til flere faciliteter til rutinemæssig produktion af lameller er det hastighedsbegrænsende trin ofte optimering af prøven inden fræsning, hvor der skal tages tid til at sikre, at prøven er glasagtig og har en passende tykkelse til at producere robuste og ensartet tynde lameller. Beskrevet her er prøveoptimering for FIB-fræsning af dykfrosne humane røde blodlegemer inficeret med Plasmodium falciparum-parasitter , malariaens årsagsmiddel, men denne tilgang kan tilpasses til en given prøve.
Mens kryoFIB-fræsning bliver mere rutinemæssig, har forberedelse af optimale prøver til fræsning ikke; derfor forekommer de fleste af de kritiske trin i denne protokol, før prøven når cryoFIB-SEM. Prøveoptimering ved flere runder af celleforberedelse, dykfrysning og screening ved lys- og elektronmikroskopi er påkrævet for at producere den bedst mulige prøve, før fræsning forsøges. At have den bedst mulige prøve øger ikke kun chancerne for succes, men optimerer også brugen af udstyret. Af denne grund kræver de fleste nationale faciliteter bevis for, at der er udført tilstrækkelig optimering, før de giver tid på deres maskiner. Når du er inde i cryoFIB-SEM, er det afgørende at maksimere effektiviteten af organoplatinbelægningen for at producere ensartet tynde lameller. Endelig er tålmodighed og god prøvehåndtering en forudsætning for brugeren, som skal sidde i flere dage og producere og derefter overføre gitre indeholdende sarte lameller. Dette kan ændre sig med introduktionen af automatiserede fræsestrategier47,48, men endnu er hele fræseprocessen stadig stort set manuel på de fleste faciliteter.
Mens arbejdet udelukkende fokuserede på P. falciparum schizonts, kunne metoden, der præsenteres her, let ændres for at optimere gitterforberedelse og fræsning til andre celletyper. Vigtige faktorer, der skal overvejes, er tætheden af de celler, der påføres gitteret, gittertypen (kobber er giftigt for nogle celler), størrelsen og afstanden mellem huller i kulstoffilmen, blottingtiden og metoden til blotting (enkelt / dobbeltsidet, manuel eller automatiseret). Derudover, hvis cellerne dyrkes på gitterene (normalt guldgitter med en hullet kulstoffilm), kan sammenløbet kontrolleres ved lysmikroskopi, før de blottes og fryses. Fræsestrategien afhænger af, hvordan cellerne deponeres på nettet. For malariainficerede røde blodlegemer er gitteret i det væsentlige belagt med et ubrudt lag af celler, tykkere i nogle områder og tyndere i andre områder. Fræsning udføres på flere punkter i et område langs denne gradient, hvor istykkelsen genererer lameller, der er en passende størrelse til tomografi. Denne fremgangsmåde fungerer godt for mindre celler, da du kan producere lameller, der indeholder en skive gennem flere celler. For større celler eller klumper af celler kan det være tilfældet, at en celle eller celleklump kan producere en lameller.
Nethåndtering og prøveoverførsel er fortsat en af de største udfordringer i denne arbejdsgang. Lameller kan gå tabt på grund af brud eller revner, gardinartefakter, der skjuler biologien, overdreven overfladeforurening samt netorienteringsproblemer inden for TEM, hvilket kræver et ekstra håndteringstrin for at omplacere gitteret. Graden af tab varierer fra dag til dag og grid-to-grid, men det forbedres gennem praksis og håndteringserfaring over tid. I denne undersøgelse blev det konstateret, at gitterene omhyggeligt kan omorienteres i autoloaderen flere gange uden at ødelægge lameller, og dette har undertiden fordelen ved at vaske overfladeis af. En anden hovedbegrænsning ved denne arbejdsgang er den tid, det tager at producere lameller. Da produktionen er langsom, er det afgørende at have en korrekt optimeret prøve, hvilket gør fræsningen så effektiv som muligt.
Der er for nylig indført en række tilpasninger til FIB-formaling af glasagtige biologiske prøver. En game-changer er implementeringen af kryogenkølede løfteværktøjer i cryoFIB-SEM-kammeret, der gør det muligt at fræse større blokke af materiale fra højtryksfrosne prøver. Blokkene kan fastgøres til en metalstang eller samles op i en griber og flyttes til en anden prøveposition, der indeholder et specielt modificeret EM-gitter. Blokkene kan derefter overtrækkes med organoplatinum og fræses for at generere lameller. Evnen til at fræse lameller fra højtryksfrosset materiale betyder, at meget større celler og væv kan behandles, specifikt målrettet områder ved korrelativ fluorescensmikroskopi12. Andre nylige tilpasninger af FIB-fræsningsmetoden omfatter reduktion af gardinartefakter ved kileforfræsning af prøven16, mikrofluidisk kryofiksering49 og fotomikromønster af elektronmikroskopigitter for at forbedre cellefordeling50. Det er også blevet påvist, at fræsning af mikroekspansionshuller på hver side af en lamel kan lindre kompression af den omgivende prøve, når den når sin endelige tyndhed51. Dette kan især være nyttigt ved fræsning af kontinuerlige cellelag, såsom prøven i denne undersøgelse, hvor bøjning af lameller undertiden ses under det sidste poleringstrin.
Fremtiden for elektronmikroskopi vil sandsynligvis være bestemmelse af in situ molekylære strukturer ved sub-tomogram gennemsnit, og FIB-fræsning er et vigtigt værktøj, der vil lette produktionen af glasagtige biologiske prøver til denne type arbejdsgange. Mens FIB-fræsning stadig er i sin barndom for biologiske anvendelser, sker metodeudviklingen i et hurtigt tempo takket være hårdt arbejde fra forskere, både akademiske og nationale faciliteter, plus kommercielle investeringer i udvikling af kryoFIB-SEM-teknologi til støtte for forskning.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev finansieret helt eller delvist af Wellcome Trust (212916/Z/18/Z). Med henblik på fri adgang har forfatteren anvendt en CC BY offentlig ophavsretslicens på enhver forfatteraccepteret manuskriptversion, der opstår som følge af denne indsendelse.
Dette projekt, som denne metode blev udviklet til, blev finansieret af et Medical Research Council-tilskud MR / P010288 / 1 tildelt Helen R. Saibil, Roland A. Fleck og Michael J. Blackman. Kulturer af P. falciparum blev dyrket på The Francis Crick Institute med støtte fra medlemmer af Michael J. Blackmans gruppe. Forfatterne vil gerne takke Dr. Ser Ying (Michele) Tan for at give billederne af forbindelse 2 og E64-behandlede skizonts i tynde blodudstrygninger. De fleste lameller blev produceret med støtte fra personale på eBIC, og vi er taknemmelige for adgang til Scios dual-beam cryoFIB-SEM på forskningsforslag NT21004. Forfatterne anerkender også støtten fra Royal Society Industry Fellowship-ordningen (INF\R2\202061) til at fortsætte udviklingen af FIB-fræseteknikken inden for CUI. Forfatterne vil også gerne takke Helen R. Saibil for nyttige diskussioner i forhold til dette metodepapir og tilsyn med projektet.
c-clips | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | |
Clipping station | Thermo Fisher Scientific | n/a | Direct quote from Thermo |
Clipping station | Sub-angstrom | CSA-01 | |
Compound 2 | n/a | n/a | Synthesised by Dr Simon A. Osborne, LifeArc |
Cryo-FIB specific autogrid rims | Thermo Fisher Scientific | 1205101 | |
E64 | Sigma | E3132 | |
Emitech K100X glow discharge unit | Quorum | n/a | |
Gibco RPMI 1640 media | Thermo Fisher Scientific | 12633012 | Formulation used for culturing is custom made (REF 041-91762 A) and includes Albumax, glutamine, HEPES and hypoxanthine supplements |
Giemsa Stain | VWR International | 350864X | |
Glass slides | Thermo Fisher Scientific | 11562203 | |
Grid boxes | Sub-angstrom | PB | For clipped grids |
Grid boxes | Thermo Fisher Scientific | n/a | For clipped grids – direct quote from Thermo Fisher Scientific |
Grid boxes | Agar Scientific | AGG3727 | |
Home-made manual plunge freezing rig | n/a | n/a | With an insulated ethane pot (high-density foam) and liquid nitrogen bath (polystyrene) on a bench top in a containment facility. |
Human blood | n/a | n/a | UK National Blood and Transplant service |
JEOL 4700F Z JSM with a Leica VCT500 stage cooling system | JEOL | n/a | FIB-SEM |
Leica EM ACE600 with a VCT500 cryostage | Leica | n/a | sputter coater |
Leica EM ACE900 | Leica | n/a | e-beam rotary coater. In a humidity controlled room. |
Linkam cryo-stage for light microscope | Linkam | Model No. CMS196 | Cassettes for clipped and un-clipped grids. In a humidity controlled room. |
Methanol | Sigma | 179957 | |
Nikon Eclipse E200 light microscope | Nikon | n/a | with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room. |
Percoll | VWR International | 17-0891-01 | Solution for percoll cushion is 35 ml 10x PBS, 150 ml RPMI 1640 media and 315 ml Percoll |
Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM Finder grids | Quantifoil | N1-C17nCuH2-01 | 100 pack |
Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM grids | Quantifoil | N1-C17nCu20-01 | 100 pack |
Quorum PP3010 prep-chamber | Quorum | n/a | sputter coater |
Scios dual beam equipped with a Quorum PP3010 transfer stage. | FEI | n/a | FIB-SEM |
Staedtler Lumocolor fine black permanent marker pen | Viking Direct | ND538522 | |
TFS Titan Krios 300 kV TEM | Thermo Fisher Scientific | n/a | TEM equipped with a K2 or K3 camera. |
Whatmann grade 1 filter paper | Sigma | WHA1001150 | |
Zeiss Axio Scope A1 light microscope | Zeiss | n/a | with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room. |