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Biologia

Métodos de cultivo para estudiar las interacciones apicales específicas utilizando modelos organoides intestinales

Published: March 23, 2021
doi:
10.3791/62330
, , , , , , ,
1STEMCELL Technologies Ltd., 2STEMCELL Technologies Inc., 3Terry Fox Laboratory, BC Cancer

Summary

Aquí presentamos dos protocolos que permiten el modelado de interacciones intestinales apical-específicas. las monocapas intestinales Organoide-derivadas y las culturas de la interfaz aire-líquido (ALI) facilitan la generación de epitelios bien diferenciados accesibles de lados luminales y basolaterales, mientras que los organoids intestinales polaridad-invertidos exponen su lado apical y son susceptibles a los análisis de alto rendimiento.

Abstract

El revestimiento del epitelio intestinal se compone de una capa simple de células epiteliales especializadas que exponen su lado apical a la luz y responden a señales externas. La optimización reciente de las condiciones de cultivo in vitro permite la recreación del nicho de células madre intestinales y el desarrollo de sistemas avanzados de cultivo en 3 dimensiones (3D) que recapitulan la composición celular y la organización del epitelio. Los organoides intestinales incrustados en una matriz extracelular (ECM) se pueden mantener a largo plazo y autoorganizarse para generar un epitelio bien definido y polarizado que abarque una luz interna y un lado basal expuesto externo. Esta naturaleza restrictiva de los organoides intestinales presenta desafíos en el acceso a la superficie apical del epitelio in vitro y limita la investigación de mecanismos biológicos como la absorción de nutrientes y las interacciones huésped-microbiota/huésped-patógeno. Aquí, describimos dos métodos que facilitan el acceso al lado apical del epitelio organoide y apoyan la diferenciación de tipos específicos de células intestinales. En primer lugar, mostramos cómo la eliminación de ECM induce una inversión de la polaridad de la célula epitelial y permite la generación de organoides 3D apical-out. En segundo lugar, se describe cómo generar 2 dimensiones (2D) monocapas a partir de suspensiones unicelulares derivadas de organoides intestinales, compuesto de tipos de células maduras y diferenciadas. Estas técnicas proporcionan nuevas herramientas para estudiar las interacciones apical-específicas del epitelio con señales externas in vitro y promover el uso de organoides como una plataforma para facilitar la medicina de precisión.

Introduction

El epitelio intestinal es el segundo epitelio más grande del cuerpo humano y consiste en una capa celular polarizada que facilita la absorción de nutrientes y actúa como barrera contra los insultos ambientales1. Esta distinción entre los lados apical y basolateral permite a las células del epitelio llevar a cabo sus diversas funciones. El compartimento apical se expone a la luz y media las interacciones epiteliales con estímulos ambientales y microorganismos, al tiempo que facilita la absorción de nutrientes. La superficie basolateral alberga uniones intercelulares y adherencias célula-matriz, mientras interactúa con las células del sistema inmune y otros tejidos2. Estas uniones generan una monocapa impermeable unida a la membrana basal, que actúa como una barrera y entrega los nutrientes absorbidos al tejido corporal circundante.

El establecimiento de sistemas de cultivo que sean capaces de recapitular estas funciones intestinales in vitro ha sido un reto3. Los modelos ines vitro convencionales utilizan variedades de células colorrectales humanas transformadas del cáncer, tales como Caco-2, para generar culturas de la monocapa 2D. A pesar de ser capaces de modelar múltiples funciones del compartimento absorbente, estos modelos no pueden recapitular completamente la composición y función del epitelio intestinal, lo que limita las características funcionales clave y las aplicaciones4,5.

La aparición de organoides como un avanzado sistema de cultivo 3D generado a partir de células madre que pueden autoorganizarse y diferenciarse a tipos de células específicas de órganos, supuso un gran avance en el estudio in vitro del epitelio intestinal6. Los organoides intestinales están incrustados en una matriz extracelular (ECM) que se asemeja a la lámina basal y forman uniones célula-matriz que permiten a estos cultivos retener la polaridad apicobasal del epitelio. Los organoides exhiben una arquitectura cerrada en la que el lado apical se expone al compartimento luminal, imitando así la estructura del intestino. Aunque esta organización cerrada ofrece la oportunidad de estudiar funciones específicas de la orientación, limita las investigaciones que requieren acceso al lado apical del epitelio. Se han adoptado diferentes enfoques para superar estas limitaciones tanto en 2D como en 3D, incluyendo la fragmentación organoide, la microinyección organoide y la generación de cultivos monocapa7. La fragmentación organoide provoca la pérdida de la organización estructural y la destrucción de las uniones celulares, lo que permite la exposición de la superficie apical del epitelio al medio. Esta técnica aprovecha la capacidad regenerativa de los fragmentos para reformar organoides cuando se siembran en una matriz extracelular y se ha utilizado para modelar enfermedades infecciosas e interacciones huésped-patógeno8,9. Sin embargo, el acceso simultáneo a la superficie apical y básica también puede provocar respuestas no específicas a la infección.

Un enfoque alternativo que permite el acceso a la superficie apical y preserva tanto la arquitectura estructural como las uniones celulares está representado por la microinyección de factores en la luz de los organoides. Este método se ha utilizado extensivamente para estudiar interacciones del anfitrión-patógeno y para modelar los efectos del cryptosporidium10,de los píloros11del H. , y del difficile12 de la C. en el epitelio gastrointestinal in vitro. Utilizando técnicas similares, se determinó el potencial mutagénico de los pks+ cepa de E. coli sobre el epitelio intestinal13. Aunque eficaz, la microinyección organoide es una tarea laboriosa e ineficiente teniendo en cuenta el alto número de organoides que se necesitan inyectar para obtener efectos medibles y por lo tanto limita su aplicación para ensayos de alto rendimiento.

Los avances recientes con organoides intestinales también han proporcionado métodos para el establecimiento de cultivos organoides monocapa 2D, exponiendo así su superficie apical14,15,16,17. Estas monocapas organoides-derivadas recapitulan las propiedades in vivo dominantes del epitelio intestinal. Exhiben una composición celular fisiológicamente relevante, que contiene poblaciones de células madre y diferenciadas y modelan la diversidad a través del eje cripta-vellosidad. A medida que se conserva la polaridad apicobasal, las propiedades inherentes de la monocapa permiten un fácil acceso de los lados apical y basolateral y los intercambios de medios pueden imitar el flujo intestinal y la eliminación de residuos, lo que permite un cultivo a largo plazo. Estas características hacen que las monocapas derivadas de organoides sean susceptibles de estudios centrados en las interacciones luminales y proporcionan un modelo superior para la integridad y permeabilidad de la barrera epitelial18,19.

Estudios han demostrado que la polaridad de las células epiteliales está estrechamente regulada por las proteínas ECM en los esferoides MDCK20,21 y recientemente en organoides intestinales humanos22. La eliminación de los componentes de la ECM o la inhibición del receptor de integrina que media las uniones célula-matriz da lugar a una reversión de la polaridad de los organoides intestinales y a la exposición del lado apical del epitelio al medio22. Este enfoque ha atraído el interés de los investigadores que trabajan en enfermedades infecciosas, ya que permite un fácil acceso al lado apical en 3D y lo hace susceptible a ensayos de alto rendimiento. Aquí, describimos un protocolo modificado basado en el trabajo reciente del laboratorio Amieva22,que facilita la generación de organoides intestinales 3D que exponen fácilmente su lado apical. También se esboza un protocolo que puede generar de manera eficiente y reproducible monocapas 2D intestinales derivadas de organoides intestinales.

Protocol

La derivación de cultivos organoides intestinales humanos se realizó como se describe en otra parte23. Los organoides se mantuvieron en cultivo según lo descrito por la Hoja de Información del Producto (PIS) para el Medio de Expansión Organoide Intestinal (consulte la Tabla de Materiales). 1. Inversión de la polaridad organoide intestinal NOTA: Esta sección describirá el protocolo para invertir la polaridad de los organoides intestinales 3D. Este protocolo proporciona un procedimiento detallado para el establecimiento de organoides polarizados con una superficie apical expuesta en suspensión en una placa de cultivo. Este protocolo está pensado como un ensayo de punto final, aunque los organoides podrían mantenerse en esta conformación durante más de 2 semanas y mantener una pequeña población de células madre que les permita restablecer los organoides apicales en el paso. Revestimiento de cultureware y tubos con solución antiaherenteNOTA: Para maximizar el número de organoides intestinales apical-hacia fuera y prevenir el accesorio indeseable al cultureware, precoating de cultureware se requiere generalmente. La sección que se describe a continuación describe el recubrimiento de cultivo y artículos de plástico con solución antiaép adherente. Placas de cultivo de la capa que se utilizarán en la parte de suspensión del protocolo de la siguiente manera. Agregue 0,5 mL de solución antiaéduntina a cada pozo de una placa de cultivo de tejido de 24 pozos. Gire la placa para extender la solución uniformemente a través de la superficie y las paredes de los pozos. Centrifugar la placa a 1.300 x g durante 10 min. Retire la solución antiaédante de cada pozo con un aspirador o una pipeta de 1 mL. Lave los pozos con 1 mL de DMEM/F-12 con 15mM HEPES (DMEM/F12). Llene cada pozo lavado con 0,5 mL de DMEM/F-12 y guarde la placa a 37 °C y 5% de CO2 hasta su uso.NOTA: Si no se usa inmediatamente, las placas recubiertas se pueden mantener en la incubadora durante al menos 1 semana. Capa 15 mL tubos cónicos utilizados en este protocolo de la siguiente manera. Añadir 4 mL de solución antiaéduga al tubo cónico de 15 mL. Gire el tubo para extender la solución uniformemente a través de la superficie de las paredes. Centrifugar el tubo a 1.300 x g durante 10 min. Retire la solución antiaé adherente del tubo. Lavar el tubo 1x con 5 mL de DMEM/F-12 y aspirar el DMEM/F-12. Los tubos ya están listos para su uso.NOTA: Si no se utiliza inmediatamente, añadir 5 ml de DMEM/F12 y conservar a 4 °C. Los tubos recubiertos se pueden mantener a 4 °C durante al menos una semana. Inversión de polaridad de organoides intestinales por cultivo de suspensiónNOTA: Los pasos a continuación describen la inversión de organoides intestinales previamente cultivados en condiciones estándar de cúpula ECM. Los procedimientos descritos aquí son para un pozo de una placa de 24 pozos. Si utiliza otro software de cultivo, ajuste los volúmenes en consecuencia. Retire y deseche cuidadosamente el medio de cada pozo que contiene organoides sin interrumpir la cúpula de la matriz extracelular de la membrana basal. Asegúrese de que el tamaño de los organoides sea de 150-250 μm de diámetro (normalmente en el día 3-5) antes de comenzar el protocolo de inversión. Añadir 1 mL de solución de disociación helada en cada pozo. Incubar a temperatura ambiente (15-25 °C) durante 1 min. Agregue al menos 2 mL de solución antiaépntgica a un tubo de 15 mL para ser utilizado para el recubrimiento de puntas de plástico. Añadir al menos 2 mL de DMEM/F-12 a un tubo de 15 mL para ser utilizado para el lavado de puntas de plástico enjuagadas con solución antiaépnt. Recubrir una punta de pipeta de 1 mL con solución antiarrecononte, pipeteando 1 mL de solución tres veces en el tubo con solución antia adherente a partir del paso 1.2.4. Lavar la punta en frío DMEM/F-12, pipeteando 1 mL de solución tres veces en el tubo con DMEM/F-12 desde el paso 1.2.5. Usando la punta recubierta, desaloje cuidadosamente las cúpulas pipeteando lentamente. Tenga cuidado de no interrumpir o fragmentar los organoides. Transferir la suspensión organoide a una placa tratada con solución antia adherente (a partir de la etapa 1.1.1). Coloque la placa en una coctelera a 4 °C durante 30 min. Un agitador de giroscopio se puede utilizar a 70 rpm.NOTA: Evite sacudidas brustas, como el vórtice de la muestra, ya que puede resultar en la fragmentación organoide. La formación de burbujas y espuma puede indicar temblores brusca. Después de 30 min, retire la placa. Usando una punta de pipeta de 1 mL recubierta con solución antia adherente, pipetee suavemente la solución hacia arriba y hacia abajo. Colocar la placa en una coctelera a 4 °C durante 15 min. Un agitador de giroscopio se puede utilizar a 70 rpm. Retire la placa y deje que los organoides se asienten por gravedad (1-2 min a temperatura ambiente). Observe la placa bajo el microscopio para verificar la sedimentación organoide.NOTA: Evite la agitación extensa de la placa, ya que puede hacer que los organoides asentados resuspend. Después de que los organoides se asienten, retire la mayor cantidad posible de la solución de disociación y lávese añadiendo 1,5 mL de DMEM/F-12. Permita que los organoides se sedimenten y eliminen la mayor cantidad posible del sobrenadante. Repita el paso de lavado una vez más.NOTA: Observe la placa bajo el microscopio para verificar la sedimentación organoide antes de realizar cualquier paso de lavado. Retire la mayor cantidad posible del DMEM/F-12 y agregue 0,5 mL de medio de expansión organoide intestinal. Incubar a 37 °C y al 5% deCO2. Al día siguiente, realice un cambio parcial de medio inclinando la placa en un ángulo de 25 a 30 grados y eliminando el medio a lo largo de la pared del pozo. Retirar 0,4 mL de medio teniendo cuidado de no eliminar organoides suspendidos. Añadir 0,4 mL de medio de expansión organoide intestinal. Incubar a 37 °C y 5% deCO2 durante 3 días.NOTA: Después de 3 días, la mayoría de los organoides deben tener una polaridad apical, pero pueden haberse formado grandes agregados. Si se han formado agregados, utilice una pipeta de 1 mL con una punta recubierta con solución antia adherente (como se describe en los pasos 1.2.6 y 1.2.7) para esquilear los agregados pipeteando hacia arriba y hacia abajo 20 veces mientras presiona el extremo de la punta en la parte inferior de la placa. Colocar la placa a 37 °C y 5% deCO2 y realizar un cambio de medio completo al día siguiente con medio de expansión organoide intestinal (como se describe en la sección 1.2.17). Después de 2 días (día 5 en suspensión), los organoides intestinales apicales se pueden utilizar en ensayos aguas abajo. 2. Establecimiento de cultivos de monocapa 2D de células intestinales e interfaz aire-líquido (ALI) derivados de organoides intestinales 3D NOTA: Esta sección describirá el protocolo para generar cultivos de monocapa 2D a partir de organoides intestinales. Esta técnica proporciona la ventaja de establecer un cultivo de monocapa confluente y polarizado con una superficie apical expuesta en una placa de cultivo de tejido que contiene inserto de membrana de cultivo celular. Aunque la monocapa comenzará a diferenciarse en el formato de monocapa sumergida, se puede lograr una diferenciación adicional de la monocapa cambiando a un cultivo ALI después de que haya alcanzado la confluencia. Tanto la monocapa como los protocolos ali posteriores están pensados como ensayos de punto final y aunque el cultivo de monocapa mantiene una pequeña población de células madre, ninguno de los dos puede ser eficientemente dividido y pasado después de que se establece. Preparación de medios y placas para el cultivo de monocapa intestinal Prepare el medio de diferenciación organoide intestinal según lo delineado por el fabricante para el cultivo de monocapa (ver Lista de materiales). Añadir Y-27632 sólo a un volumen de medio que se utilizará dentro de 1 semana a una concentración final de 10 μM. Si no se usa inmediatamente, conservar a 4 °C. Tripsina precalentada EDTA (0,05%) a 37 °C. Al menos 2 h antes de los cultivos de monocapa de siembra, prepare una solución de recubrimiento de ECM al 2% de la siguiente manera. Descongele la ECM en hielo y agregue 1:50 al PBS estéril frío para preparar una solución al 2%. Preparar cantidades suficientes para añadir 100 μL al pozo superior de cada inserto de membrana de cultivo celular de 6,5 mm(0,33 cm 2)que se utilizará. Ajuste el volumen adecuadamente para cultivos más grandes o más pequeños. Añadir 100 μL a cada pozo e incubar cada placa a 37 °C y 5% deCO2 hasta que sea necesario (al menos 2 h antes de la siembra). Disociación de organoides intestinales para la generación y cultivo de monocapas Retire un número adecuado de pozos de cultivo organoide de la incubadora. Consulte la Tabla 1 para obtener el número recomendado de pozos a cosechar para diversos artículos de cultivo. Aspirar todo el medio de los cultivos organoides sin perturbar la cúpula ECM. Añadir 1 mL de solución de disociación a cada pozo. Incubar a temperatura ambiente (15-25 °C) durante al menos 1 min. Usando una pipeta de 1 mL, pipetea vigorosamente hacia arriba y hacia abajo para interrumpir la cúpula y liberar los organoides. Acoja los organoides suspendidos de cada pozo en un tubo cónico de 15 mL. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min con agitación suave o balanceo. Los organoides para la siembra de múltiples pozos se pueden agrupar en este paso, hasta 10 mL de volumen en cada tubo. Centrífuga a 200 x g durante 5 min a 4 °C. Retire y deseche el sobrenadante. Añadir 5 mL de DMEM/F-12 helados a los organoides resuspend. Mezclar y centrífuga de nuevo a 200 x g durante 5 min a 4 °C. Aspirar el sobrenadante, eliminando tanto como sea posible, teniendo cuidado de no molestar el pellet.NOTA: Algunos ECM residuales pueden permanecer en el pellet; sin embargo, esto no debe afectar perceptiblemente a la disociación de los organoids. Añadir 1 mL de tripsina-EDTA precalentada (37 °C) (0,05%) a los organoides resuspend. Mezcle bien para asegurar una suspensión uniforme. Sume hasta 1 mL adicional de Tripsina-EDTA para un gran número de células, o si queda una cantidad significativa de ECM. Incubar a 37 °C durante 5-10 min. Mezcle bien con una pipeta de 1 mL para interrumpir los organoides tanto como sea posible. Los organoides deben disociarse completamente en células individuales o pequeños fragmentos. Si quedan fragmentos más grandes u organoides enteros después de un pipeteo completo, continúe la incubación con Tripsina-EDTA a 37 °C durante otros 3-5 min.NOTA: No incubar con Tripsina-EDTA durante más de 20 min, ya que esto puede resultar en una mayor pérdida de viabilidad celular. Una vez que los organoides estén suficientemente disociados, agregue un volumen igual de DMEM/F-12 (por ejemplo, 1 mL de DMEM/F-12 por mL de Tripsina-EDTA) y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien. Desactive la tripsina-EDTA agregando un 10% de FBS al DMEM/F-12 en este paso. Fragmentos de centrífuga a 200 x g durante 5 min a 2-8 °C. Si los organoides disociados no pueden peletizar, esto es común y puede deberse a una acumulación de moco liberado por las células disociadas. En este caso, mezcle las células a fondo pipeteando hacia arriba y hacia abajo y centrífugalas de nuevo a 200 x g durante 5 min a 2-8 °C. Retire cuidadosamente tanto sobrenadante como sea posible, dejando sólo el pellet de la célula. Resuspend las células en 100 μL de medio de diferenciación organoide intestinal (con 10 μM Y-27632) para cada pozo a ser sembrado. Ajuste el volumen adecuadamente para tamaños de pozo más grandes o más pequeños. Retirar las placas recubiertas de la incubadora (preparadas en el paso 3.1.4) y retirar el exceso de ECM de cada pozo. Agregue 100 μL de la suspensión celular al pozo superior de cada inserto de cultivo celular. Añadir 500 μL de medio de Diferenciación Organoide Intestinal al pozo inferior de cada inserto de cultivo celular. Incubar a 37 °C y 5% de CO2. Reemplace el medio en los pozos superior e inferior cada 2 a 3 días. Los cultivos de monocapa deben alcanzar la confluencia dentro de los 7 días y a menudo alcanzarán la confluencia dentro de los 2-3 días. Establecimiento de una cultura de interfaz aire-líquido (ALI)NOTA: Si se desea, se puede lograr una mayor diferenciación de un cultivo de monocapa intestinal sumergida mediante la transición del cultivo de monocapa sumergida a un cultivo de ALI. Este método de cultivo permitirá un aumento en el número de tipos de células diferenciadas, particularmente células del linaje secretor, como las células caliciformes y enteroendocrinas. Establecer un cultivo de monocapa en un inserto de cultivo celular como se describió anteriormente en los pasos 2.2.1-2.2.23 y mantener este cultivo al 100% de confluencia durante al menos 4 días. Para establecer un cultivo de ALI, retire el medio de los pozos superior e inferior. Agregue el medio fresco de diferenciación organoide intestinal (con Y-27632) al pozo inferior, dejando el pozo superior vacío. Incubar a 37 °C y al 5% deCO2. Reemplace el medio en el pozo inferior cada 2-3 días y permita que la monocapa se diferencie durante al menos 1 semana. Enjuague el pozo superior con PBS estéril para eliminar el exceso de acumulación de moco, si es necesario.En estas condiciones, el cultivo ALI se puede mantener durante al menos 2-3 semanas.

Representative Results

Los organoides se generaron a partir de muestras de biopsia siguiendo el protocolo descrito anteriormente23 y en el PIS para el Medio de Expansión Organoide Intestinal (ver la Tabla de Materiales). La Figura 1A,Panel Izquierdo,muestra el fenotipo de los organoides intestinales cultivados en una cúpula con Medio de Expansión Organoide Intestinal. En estas condiciones de cultivo, los organoides exhiben una morfología quística definida por un epitelio delgado (10-25 μm) que encierra un lumen(Figura 1A,Panel Derecho). En esta etapa, el lado apical del epitelio intestinal se enfrenta a la luz, mientras que el lado basolateral entra en contacto con la matriz extracelular circundante. Cuando la mayoría de los organoides alcanzaron el tamaño deseado, la matriz extracelular fue quitada, y los organoids entonces fueron cultivados en la suspensión. La pérdida de unión celular a la matriz extracelular desencadena un proceso de inversión en los organoides, lo que resulta en una inversión de la polaridad del epitelio organoide, exponiendo el lado apical del epitelio al medio de crecimiento e internalizando el lado basolateral. En algunos cultivos, los organoides en suspensión se agregan y se fusionan, un efecto que es más profundo durante los primeros 3 días(Figura 1B,Panel Izquierdo). La aplicación de una técnica de cizallamiento permite el desprendimiento de los organoides y la continuación de los cultivos durante días con una mínima reagregación(Figura 1B,Panel Derecho). Los organoides intestinales cultivados en domos de ECM continúan expandiéndose(Figura 1C,Panel Izquierdo)y exhiben formación espontánea de estructuras secundarias en ciernes, que se asemejan a pequeñas criptas, en el lado basolateral del epitelio que rodea la luz(Figura 1C,Panel Derecho). Al mismo tiempo, los organoides mantenidos durante 5 días en ausencia de matriz extracelular continúan desarrollándose en suspensión(Figura 1D,Panel Izquierdo). La inversión de la polaridad se caracteriza por el engrosamiento (30-40 μm) del epitelio que rodea el núcleo de los organoides y la aparición de una variedad de morfologías: alargadas(Figura 1D,Panel Derecho y Figura Suplementaria 1A),quística(FiguraSuplementaria 1B),e irregulares(FiguraSuplementaria 1C). Esto a menudo se combina con una reducción del espacio luminal dentro del organoide, afectando su tamaño total. La inversión eficiente también se puede confirmar mediante el análisis de la expresión de los marcadores de polaridad intestinal-específicos. Los organoides intestinales apicales muestran una localización distinta de los núcleos hacia la luz del organoide, como lo indica la señal de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). La expresión de marcadores apicales, como VILLIN(Figura 2A)y ZO-1(Figura 2B),se detecta en la cara externa del epitelio que está expuesto al medio. Esta localización está en marcado contraste con ésa observada en los organoides intestinales cultivados en ECM. Los organoides incrustados de matriz extracelular teñidos para núcleos (DAPI), VILLIN(Figura 2C),y ZO-1(Figura 2D)demuestran una polaridad apicobasal donde el lado apical está frente a la luz del organoide. El retiro completo del ECM se requiere para obtener la inversión eficiente de la polaridad de los organoids intestinales. Ocasionalmente, una porción de organoides encontrados en cultivos en suspensión rodeados de residuos de ECM, muestra una morfología quística que sugiere un fallo en la inversión de polaridad del epitelio(Figura Suplementaria 2A). El análisis de la tinción inmunofluorescente, realizado en estos organoides, proporciona evidencia de la posición basolateral de los núcleos (DAPI) a lo largo del epitelio y la expresión de ZO-1 en el lado apical que se enfrenta a la luz del organoide(Figura suplementaria 2B)confirmando que la eliminación incompleta de ECM causa la retención de la polaridad apicobasal de una manera similar a los organoides incrustados en ECM. El protocolo para el establecimiento de cultivos de monocapa intestinal da como resultado un cultivo de monocapa confluente dentro de los 7 días de la siembra y el cultivo a menudo alcanzará la confluencia en tan solo 2-3 días. Uno de los principales determinantes del éxito es el número y la calidad de las células utilizadas para sembrar la monocapa. Figura 3A,Panel izquierdo proporciona un ejemplo de una densidad de siembra ideal de aproximadamente 150.000 células en un inserto de membrana de cultivo celular de 6,5 mm. Este número no es fijo y puede ser muy variable en función del donante y la calidad del cultivo organoide fuente; por lo tanto, el número de celda debe optimizarse en función de estas variables. Si la densidad de siembra es demasiado baja, o de mala calidad (Figura 3A, Panel Derecho), puede no haber suficientes accesorios para formar un cultivo de monocapa confluente. Una vez establecida la monocapa(Figura 3B),las células forman uniones estrechas, creando un aspecto de adoquín(Figura 3B,Panel Izquierdo). Si no logran formar una monocapa confluente(Figura 3B,Panel Derecho),la apariencia de la monocapa a menudo será “irregular”, con regiones de buena calidad de unión celular, pero con mayores brechas entre estas regiones. Estas culturas no proporcionan una barrera funcional entre los compartimientos básicos y apicales y no son convenientes para los análisis descritos. Una monocapa confluente orienta su borde de cepillo que contiene VILLIN hacia el lado apical del epitelio, con su núcleo posicionado hacia el polo basolateral de la célula (Figura 4B). Entre las células, se forman uniones intercelulares que consisten en complejos multiproteicos, incluyendo ZO-1 (Figura 4B). Su presencia es clave para proporcionar la función barrera del cultivo epitelial. Una vez confluente, la transición a un cultivo ALI induce una mayor diferenciación del cultivo (Figura 3C). Aparecen celdas pequeñas y redondas y la monocapa en sí adquiere una apariencia más plegada. Aunque las células caliciformes están presentes dentro del epitelio del cultivo sumergido(Figura 4A),son más prominentes después de la diferenciación de la LPA. Las células caliciformes presentes dentro del epitelio secretan moco, lo que lleva a una apariencia nebulosa en la parte superior del epitelio. Las células caliciformes y el moco secretado se pueden visualizar mediante tinción para la proteína mucina secretada, MUC2(Figura 4A,C y D)y el aumento de la población de células caliciformes se puede medir por un aumento en la expresión de MUC2 (Figura suplementaria 3A). No es necesario eliminar esta capa de moco similar a un gel y se pegará a la superficie del epitelio y permanecerá después de lavados repetidos. Si la eliminación es necesaria, lavar el cultivo con un compuesto mucolítico, como 10 mM de N-acetilcisteína o 50 μg/mL de TDT elimina el exceso de moco. Además del aumento de la población de células caliciformes, la interfaz ALI también aumenta la presencia de células enteroendocrinas (como indica la expresión de CHGA) (Figura suplementaria 3B)y enterocitos maduros (como indica la expresión de KRT20) (Figura suplementaria 3C). Figura 1: Etapas de la generación de organoides intestinales apical-out. (A)Imágenes representativas de una cúpula con organoides del tamaño deseado al día 4 (Panel izquierdo, Barra de escala = 500 μm). Los organoides son de paredes delgadas, con un compartimento luminal abierto (Panel Derecho, Barra de escala = 100 μm). (B)Imagen representativa de un pozo con agregación extensa después de 3 días en suspensión (Panel Izquierdo, Barra de escala = 200 μm). Imagen de fragmentos de agrupamiento directamente después de la cizalladura (Panel Derecho, Barra de escala = 200 μm). (C)Imagen representativa de organoides intestinales en cúpula al día 7. Los organoides muestran una luz expandida con la formación de pequeños brotes en el lado basolateral del epitelio (aumento izquierdo de 20x, aumento derecho de 100x de la región marcada, barra de escala = 200 μm). (D)Imagen representativa de organoides intestinales después de la eliminación de la ECM y el posterior cultivo de suspensión durante 5 días. Los organoides obtienen una morfología densa con un epitelio engrosado y exponen su lado apical al medio. (Aumento de 20x a la izquierda, aumento de 100x a la derecha de la región marcada, barra de escala = 200 μm). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura. Figura 2:Tinción inmunofluorescente para marcadores de polaridad celular en organoides intestinales. Apical-hacia fuera (A, B), y apical-en (C, D) los organoides intestinales orientados fueron manchados con los marcadores apicales ZO-1 y VILLIN, y con el marcador epitelial E-CADHERIN (rojo). Dapi (azul) fue utilizado para visualizar núcleos. Los paneles izquierdos muestran imágenes tomadas con un aumento de 25x y los paneles derechos muestran imágenes de diferentes organoides con un aumento de 63x (solo el panel C muestra un aumento de 25x y 63x del mismo organoide). (A)Los organoides intestinales apicales teñidos con VILLIN (verde) y E-CADHERIN (rojo) indican la exposición del lado apical al medio. (B)Organoides intestinales apical-out teñidos con ZO-1 (verde) y E-CADHERIN (rojo) muestran la presencia de uniones estrechas y la reversión de la polaridad apicobasal. (C)Organoide intestinal incrustado en Matrigel teñido con VILLIN (verde) y E-CADHERIN (rojo) que muestra el lado apical frente a la luz organoide. (D)Organoides intestinales incrustados en Matrigel teñidos con ZO-1 (verde) y E-CADHERIN (rojo) que indican la presencia de uniones apretadas apicales frente a la luz del organoide. (Barra de escala = 100 μm). Los organoides fueron teñidos por inmunofluorescencia e imágenes utilizando protocolos previamente publicados24,25. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura. Figura 3:Establecimiento de cultivos de monocapa intestinal. (A)Imagen representativa de organoides 3D después del tratamiento con Tripsina-EDTA al 0,05%. Los organoides se disocian a células individuales o pequeños grupos celulares en preparación para la siembra de cultivos monocapa. Panel izquierdo: ejemplo de una densidad de siembra óptima para un cultivo monocapa, aproximadamente 150.000 células por cada 100 μL en un inserto de membrana de cultivo celular de 6,5 mm. Panel derecho: ejemplo de densidad de siembra subóptima a <50.000 células por 100 μL en un inserto de membrana de cultivo celular de 6,5 mm. (B) Imagen representativa de un cultivo monocapa sumergido. Panel izquierdo: Capa 100% confluente con el aspecto característico del adoquín. Panel Derecho: aproximadamente 50% monocapa confluente. Las brechas observadas en la monocapa (indicadas por una línea discontinua) se cierran con el tiempo debido a la continua proliferación de las células madre intestinales. (C)Imagen representativa de un cultivo ali diferenciado a los 7 días. (Barra de escala = 200 μm). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura. Figura 4:Tinción inmunofluorescente para marcadores celulares diferenciados en cultivos monocapa. (A)Imagen Z-stack de tinción inmunofluorescente de un cultivo monocapa sumergido para la proteína mucina MUC2, indicando la presencia de células caliciformes dentro del cultivo monocapa (verde = MUC2, azul = DAPI). (B) Imagen de la pila Z de la coloración inmunofluorescente de una monocapa sumergida. La tinción villin (verde) a lo largo del extremo apical del epitelio indica la presencia de un borde de cepillo y la tinción ZO-1 (rojo) indica la presencia de uniones estrechas entre las células (azul = DAPI). (C)Imagen de pila Z de tinción inmunofluorescente de un cultivo de monocapa diferenciado por ALI para la proteína MUC2 de mucina, lo que indica la presencia de un número significativamente mayor de células caliciformes dentro del cultivo de monocapa ALI (verde = MUC2, azul = DAPI). (D)Criosección del cultivo monocapa diferenciado por ALI, teñido para la presencia de MUC2 (verde) y E-CADHERIN (rojo) indicando la presencia de células caliciformes en el epitelio y la secreción de moco a lo largo del lado apical del cultivo monocapa. (Barra de escala = 200 μm). Los cultivos de monocapa se tiñeron por inmunofluorescencia y se realizaron imágenes utilizando protocolos previamente publicados26,27. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura. Figura suplementaria 1: Espectro de fenotipos de organoide intestinal apical-out en suspensión de cultivo. (A,B,C) Imágenes representativas adicionales de las morfologías organoides intestinales mantenidas en suspensión 5 días después del retiro del ECM. La polaridad organoide se ha invertido. Los organoides se han vuelto más densos con un epitelio engrosado y el lado apical de los organoides está orientado hacia afuera. Los organoides pueden mostrar una variedad de morfologías: alargadas(A),quística(B),e irregulares(C). (Barra de escala = 100 μm). Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo. Figura suplementaria 2: Los organoides intestinales no logran invertir la polaridad en presencia de medio de matriz de membrana basal residual en cultivos de suspensión. (A)Imagen representativa de la eliminación incompleta de la ECM y la falta de inversión de la polaridad de los organoides. Los remanentes de Matrigel están presentes alrededor de los organoides y contribuyen a mantener la polaridad del epitelio orientada a la apical-en. Los organoides muestran una morfología quística con un epitelio delgado que rodea la luz (Barra de escala = 200 μm). (B)Imagen representativa de un organoide no invertido que se encuentra en condiciones de cultivo en suspensión. Los núcleos (azul = DAPI) y E-CADHERIN (rojo) se colocan en el lado basolateral, ZO-1 (verde) se expresa en el lado apical que se enfrenta a la luz del organoide. (Barra de escala = 100 μm). Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo. Figura suplementaria 3: Expresión génica de marcadores celulares diferenciados en cultivos monocapa. (A,B,C) Expresión de MUC2, CHGAy KRT20 en cultivo monocapa sumergido y diferenciado por ALI generado en el medio de diferenciación organoide intestinal en relación con un cultivo organoide 3D cultivado con el medio de expansión organoide intestinal establecido a través de qPCR. El establecimiento de un cultivo monocapa sumergido aumenta la expresión de cada marcador celular diferenciado; sin embargo, la diferenciación como un cultivo de ALI aumenta la expresión de cada marcador exponencialmente. Barras de error = +/- SEM. Haga clic aquí para descargar este archivo. SOFTWARE DE CULTIVO MONOCAPA NÚMERO DE POZOS DE ORGANOIDES INTESTINALES A COSECHAR (de 50 μL de domo/por pozo a sembrar) Inserto Transwell de 6,5 mm 1 – 2 pozos Inserto Transwell de 12 mm 3 – 4 pozos Placa de 6 pozos 6 – 8 pozos Placa de 24 pozos 3 – 4 pozos Placa de 96 pozos 1 – 2 pozos Tabla 1: Número de pozos de organoides intestinales a cosechar para diversos artículos de cultivo

Discussion

Los modelos organoides epiteliales se han convertido en poderosas plataformas que se pueden utilizar para modelar la organización tisular, la progresión de la enfermedad e identificar la terapéutica23,28,29. La microinyección organoidea ha agregado valor a la capacidad de los organoides de modelar enfermedades infecciosas, ya que permite la interacción de patógenos con el lado apical del epitelio huésped. Los avances recientes en las técnicas de microinyección han optimizado la velocidad de inyección en organoides y han alcanzado una tasa de hasta 90 organoides inyectados por hora. Se preservó la función de barrera en organoides inyectados, y la baja concentración de oxígeno dentro de la luz permitió la supervivencia de bacterias inyectadas obligatorio-anaeróbicas30. Sin embargo, los estudios han observado la presencia de heterogeneidad en poblaciones organoides dentro del mismo pozo. Estas diferencias se observaron en tamaño y forma31,niveles de expresión de genes clave32,así como tasas de proliferación33. Las respuestas diferenciadas dentro de la misma población organoide a compuestos tales como forskolin y PGE2, o a la toxina del cólera, también se han descrito28,33. Estos resultados destacan la necesidad de un alto número de organoides en los estudios y limitan la utilización de la inyección luminal.

El cultivo organoide convencional se basa en la encapsulación y propagación de organoides en un hidrogel. Sin embargo, los hidrogeles pueden plantear limitaciones en la difusión e introducir gradientes de concentración, lo que puede aumentar la heterogeneidad34. Además, se ha documentado una alta variabilidad, no sólo entre cultivos y donantes, sino también dentro de condiciones experimentales individuales. La fuente donante, las propiedades bioquímicas del hidrogel y la heterogeneidad intrínseca del organoide como sistema de cultivo son factores importantes que pueden aumentar la variabilidad experimental y limitar la reproducibilidad de los resultados obtenidos en aplicaciones posteriores. Ambos métodos descritos aquí proporcionan un medio simple de exponer el lado apical del epitelio, lo que permite el modelado de compuestos y patógenos de interés al agregarlos directamente al medio de cultivo. La reducción en la utilización del hidrogel puede limitar la variabilidad experimental de las fuentes técnicas de error.

Los organoides intestinales apical-out conservan características clave del sistema modelo organoide y su escalabilidad los hace más susceptibles a ensayos de alto rendimiento, en comparación con la monocapa 2D. Sin embargo, como los organoides conservan su estructura 3D, la accesibilidad del lado basal es limitada y puede dificultar los estudios que requieren acceso a ambos lados simultáneamente.

Hemos demostrado que la inversión de polaridad de los organoides intestinales se basa en la eliminación eficiente y absoluta de ecm, mientras que también preserva la estructura intacta de los organoides. Tanto el uso de la solución de disociación para eliminar la ECM como la solución antiaépta para evitar la adhesión de los organoides a los plastificantes contribuyeron a mejorar la eficiencia general del protocolo publicado por Co, J. Y. y sus colegas22,particularmente en lo que respecta al número de organoides apicales producidos para aplicaciones posteriores.

Además, observamos que nuestro protocolo admite una inversión más eficiente de organoides menores de 250 μm y el uso de organoides más grandes puede resultar en una salida organoide reducida, debido a la fragmentación causada por el pipeteo. Las puntas de gran diámetro, como las indicadas en la Tabla de Materiales,pueden permitir la utilización de organoides más grandes. Sin embargo, las puntas de gran diámetro son menos efectivas en la disociación de ECM en comparación con las puntas estándar debido a la menor fuerza mecánica aplicada. Por lo tanto, la repetición de los pasos 1.2.9-1.2.11 puede ser necesaria para una interrupción suficiente y la eliminación completa de todos los restos de ECM cuando se trabaja con organoides más grandes.

Los organoides en suspensión pueden sobrevivir durante al menos 2 semanas. Después de este período de tiempo, observamos cambios en la morfología y un mayor número de muertes celulares. La presencia de células proliferantes en los organoides apical-out22 permite el restablecimiento de cultivos organoides intestinales apical-in. Esto se puede lograr disociando organoides apicales a células individuales e incrustándolos en la ECM con medio de expansión organoide intestinal.

Una limitación encontrada con frecuencia en los protocolos que describen el establecimiento de organoides intestinales en cultivos de suspensión es la generación de grandes agregados. Esto afecta a varias variables como la eficiencia, la reproducibilidad de las características morfológicas, la permeabilidad a los compuestos y la señalización paracrina. Similar al protocolo publicado por Co, J. Y. y colegas, aquí confirmamos haber obtenido la inversión de polaridad de al menos el 97% de todos los organoides suspendidos sin cizallamiento después de 3 días en suspensión. Sin embargo, a diferencia de la publicación, hemos introducido un paso de disociación mecánica con el fin de reducir la formación de grandes agregados y aumentar el rendimiento. Puesto que este procedimiento puede dañar el epitelio de los organoids, extendimos el período de incubación de los organoids por 2 días adicionales para permitir la recuperación completa del epitelio y para asegurar las culturas de alta calidad para los usos rio abajo. La introducción de agitación constante con el uso de una coctelera de incubadora o un matraz giratorio podría potencialmente reducir los eventos de fusión, minimizar la fragmentación y aumentar la oxigenación. Estos acercamientos alternativos pueden mantener las culturas para duraciones más largas, reducir muerte celular, y permitir la diferenciación adicional de los organoids intestinales apical-hacia fuera.

El establecimiento de una monocapa 2D derivada de organoides proporciona varias ventajas y desventajas en comparación con los organoides de polaridad invertida. El protocolo descrito aquí permite el establecimiento rápido de un cultivo de monocapa confluente, típicamente, en menos de 7 días y la opción de mantenimiento a largo plazo de los cultivos durante un período prolongado de tiempo (hasta 10 semanas). El protocolo y los medios utilizados aquí también permiten la diferenciación eficiente de un número significativo de células, no siempre encontradas en otros cultivos monocapa derivados de organoides16. El establecimiento de una monocapa en una membrana de inserción de cultivo celular permite el acceso simultáneo a los lados apical y basolateral del epitelio, lo que los hace ideales para estudios en integridad de barrera y transporte epitelial. Este acceso simplificado también los hace más susceptibles a los estudios de infección y tratamiento de drogas. Además, estos cultivos mantienen muchas de las características únicas del donante, manteniendo su relevancia para los estudios específicos del paciente. El método de cultivo ALI también facilita la diferenciación de un epitelio más funcional compuesto por tipos de células secretoras y absorbtivas, haciéndolo más representativo del epitelio intestinal humano. La estabilidad relativa de estos cultivos también permite que se mantengan durante un período prolongado de tiempo, proporcionando la posibilidad de estudios a largo plazo. Sin embargo, las limitaciones de este enfoque son el alto número de células necesarias para establecer una monocapa confluente y la necesidad de mantener una confluencia completa para tener una separación funcional entre las cámaras apical y basolateral. La arquitectura característica de la cripta, que se puede modelar en los cultivos organoides 3D, también se pierde al establecer un cultivo monocapa. Sin embargo, el formato experimentalmente amigable del cultivo y la facilidad con la que se puede acceder a los lados apical y basolateral del epitelio, lo convierten en una poderosa herramienta para el estudio de la fisiología intestinal.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta investigación fue financiada por la subvención Horizonte 2020 OrganoVIR 812673 en el proyecto Organoids for Virus Research – An innovative training-ITN programme.

Materials

Anti-Adherence Rinsing Solution STEMCELL Technologies Inc. 7010 For coating cultureware. Referred as anti-adherent solution into the main text.
Conical tubes, 15 mL STEMCELL Technologies Inc. 38009
Corning Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), Phenol Red-Free Corning 356231 Extracellular matrix (ECM) for maintenance and establishment of organoid lines.
Costar 6.5 mm or 12 mm Transwell inserts STEMCELL Technologies Inc. 38023/38024 For 2D Monolayer culture.
Costar 24 Well  Flat-Bottom, Tissue culture-treated plate STEMCELL Technologies Inc. 38017 For maintenance and establishment of organoid lines.
D-PBS (Without Ca++ and Mg++) STEMCELL Technologies Inc. 37350 For washing 
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Millipore Sigma D2650 Reconstitution of small molecules
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES STEMCELL Technologies Inc. 36254 For washing
Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR) STEMCELL Technologies Inc. 7174 For Matrigel removal. Referred as dissociation reagent into the main text.
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) STEMCELL Technologies Inc. 6010 For expansion of organoid lines prior to differentiation. Referred as Intestinal Organoid Expansion Medium into the main text.
IntestiCult Organoid Differentiation Medium (Human) STEMCELL Technologies Inc. 100-0214 For establishment of monolayers and 3D differentiation. Referred as Intestinal Organoid Differentiation Medium into the main text.
Trypsin-EDTA (0.05%) STEMCELL Technologies Inc. 7910 For 2D Monolayer establishment.
Y-27632 STEMCELL Technologies Inc. 72302 RHO/ROCK pathway inhibitor, Inhibits ROCK1 and ROCK2. Used for 2D monolayer establishment.
Wide bore tips Corning #TF-1005-WB-R-S Organoids handling
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Referências

  1. Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).
  2. Schneeberger, K., Roth, S., Nieuwenhuis, E. E. S., Middendorp, S. Intestinal epithelial cell polarity defects in disease: lessons from microvillus inclusion disease. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), (2018).
  3. Klunder, L. J., Faber, K. N., Dijkstra, G., Van Ijzendoorn, S. C. D. Mechanisms of cell polarity – Controlled epithelial homeostasis and immunity in the intestine. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (7), 0227888 (2017).
  4. DiMarco, R. L., Hunt, D. R., Dewi, R. E., Heilshorn, S. C. Improvement of paracellular transport in the Caco-2 drug screening model using protein-engineered substrates. Biomaterials. 129, 152-162 (2017).
  5. Sun, H., Chow, E. C., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. The Caco-2 cell monolayer: usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).
  6. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  7. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  8. Zhang, Y. -. G., Wu, S., Xia, Y., Sun, J. Salmonella-infected crypt-derived intestinal organoid culture system for host-bacterial interactions. Physiological Reports. 2 (9), 12147 (2014).
  9. Nigro, G., Rossi, R., Commere, P. -. H., Jay, P., Sansonetti, P. J. The cytosolic bacterial peptidoglycan sensor Nod2 affords stem cell protection and links microbes to gut epithelial regeneration. Cell Host & Microbe. 15 (6), 792-798 (2014).
  10. Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
  11. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  12. Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infection and Immunity. 83 (1), 138-145 (2015).
  13. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Mutational signature in colorectal cancer caused by genotoxic pks(+) E. coli. Nature. 580 (7802), 269-273 (2020).
  14. Fernando, E. H., et al. A simple, cost-effective method for generating murine colonic 3D enteroids and 2D monolayers for studies of primary epithelial cell function. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 313 (5), 467-475 (2017).
  15. Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis. Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).
  16. Wang, Y., et al. Long-term culture captures injury-repair cycles of colonic stem cells. Cell. 179 (5), 1144-1159 (2019).
  17. Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 45270 (2017).
  18. VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
  19. Thorne, C. A., et al. Enteroid monolayers reveal an autonomous WNT and BMP circuit controlling intestinal epithelial growth and organization. Developmental Cell. 44 (5), 624-633 (2018).
  20. Wang, A. Z., Ojakian, G. K., Nelson, W. J. Steps in the morphogenesis of a polarized epithelium: I. Uncoupling the roles of cell-cell and cell-substratum contact in establishing plasma membrane polarity in multicellular epithelial (MDCK) cysts. Journal of Cell Science. 95 (1), 137-151 (1990).
  21. Wang, A. Z., Ojakian, G. K., Nelson, W. J. Steps in the morphogenesis of a polarized epithelium: II. Disassembly and assembly of plasma membrane domains during reversal of epithelial cell polarity in multicellular epithelial (MDCK) cysts. Journal of Cell Science. 95 (1), 153-165 (1990).
  22. Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: a human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
  23. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  24. Dodt, H. -. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
  25. Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
  26. Crowley, S. M., et al. Intestinal restriction of Salmonella Typhimurium requires caspase-1 and caspase-11 epithelial intrinsic inflammasomes. PLoS Pathogens. 16 (4), 1008498 (2020).
  27. Rees, W. D., et al. Enteroids derived from inflammatory bowel disease patients display dysregulated endoplasmic reticulum stress pathways, leading to differential inflammatory responses and dendritic cell maturation. Journal of Crohn’s & Colitis. 14 (7), 948-961 (2020).
  28. Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
  29. Almeqdadi, M., Mana, M. D., Roper, J., Yilmaz, &. #. 2. 1. 4. ;. H. Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).
  30. Williamson, I. A., et al. A high-throughput organoid microinjection platform to study gastrointestinal microbiota and luminal physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
  31. Kassis, T., Hernandez-Gordillo, V., Langer, R., Griffith, L. G. OrgaQuant: human intestinal organoid localization and quantification using deep convolutional neural networks. Scientific Reports. 9 (1), 12479 (2019).
  32. Gracz, A. D., et al. A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis. Nature Cell Biology. 17 (3), 340-349 (2015).
  33. Gunasekara, D. B., et al. Development of arrayed colonic organoids for screening of secretagogues associated with enterotoxins. Analytical Chemistry. 90 (3), 1941-1950 (2018).
  34. Shin, W., et al. Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids. iScience. 23 (8), 101372 (2020).

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Stroulios, G., Stahl, M., Elstone, F., Chang, W., Louis, S., Eaves, A., Simmini, S., Conder, R. K. Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models. J. Vis. Exp. (169), e62330, doi:10.3791/62330 (2021).
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