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Biologia

Metodi di coltura per studiare interazioni apicali-specifiche utilizzando modelli organoidi intestinali

Published: March 23, 2021
doi:
10.3791/62330
, , , , , , ,
1STEMCELL Technologies Ltd., 2STEMCELL Technologies Inc., 3Terry Fox Laboratory, BC Cancer

Summary

Qui presentiamo due protocolli che consentono la modellazione di interazioni intestinali apicali-specifiche. I monostrati intestinali di derivazione organoide e le colture Air-Liquid Interface (ALI) facilitano la generazione di epitelia ben differenziate accessibili sia dal lato luminare che basolaterale, mentre gli organoidi intestinali invertiti dalla polarità espongono il loro lato apicale e sono suscettibili a test ad alta produttività.

Abstract

Il rivestimento dell’epitelio intestinale è costituito da un semplice strato di cellule epiteliali specializzate che espongono il loro lato apicale al lume e rispondono a segnali esterni. La recente ottimizzazione delle condizioni di coltura in vitro consente la ri-creazione della nicchia delle cellule staminali intestinali e lo sviluppo di sistemi di coltura tridimensionali (3D) avanzati che riasfaltano la composizione cellulare e l’organizzazione dell’epitelio. Gli organoidi intestinali incorporati in una matrice extracellulare (ECM) possono essere mantenuti a lungo termine e auto-organizzarsi per generare un epitelio polarizzato ben definito che comprende un lume interno e un lato basale esterno esposto. Questa natura restrittiva degli organoidi intestinali presenta sfide nell’accesso alla superficie apicale dell’epitelio in vitro e limita lo studio di meccanismi biologici quali l’assorbimento dei nutrienti e le interazioni ospite-microbiota/agente patogeno ospite. Qui descriviamo due metodi che facilitano l’accesso al lato apicale dell’epitelio organoide e supportano la differenziazione di specifici tipi di cellule intestinali. In primo luogo, mostriamo come la rimozione dell’ECM induce un’inversione della polarità cellulare epiteliale e consente la generazione di organoidi 3D apicali. In secondo luogo, descriviamo come generare monostrati bidimensionali (2D) da sospensioni a singola cellula derivate da organoidi intestinali, costituiti da tipi di cellule mature e differenziate. Queste tecniche forniscono nuovi strumenti per studiare interazioni apicali-specifiche dell’epitelio con spunti esterni in vitro e promuovere l’uso di organoidi come piattaforma per facilitare la medicina di precisione.

Introduction

L’epitelio intestinale è il secondo epitelio più grande del corpo umano ed è costituito da uno strato cellulare polarizzato che facilita l’assorbimento dei nutrienti e funge da barriera contro gli insulti ambientali1. Questa distinzione tra i lati apicale e basolaterale consente alle cellule dell’epitelio di svolgere le loro diverse funzioni. Il compartimento apicale è esposto al lume e media le interazioni epiteliali con stimoli e microrganismi ambientali, facilitando al contempo l’assorbimento dei nutrienti. La superficie basolaterale ospita giunzioni intercellulari e aderenze a matrice cellulare, interfacciandosi con le cellule del sistema immunitario e altri tessuti2. Queste giunzioni generano un monostrato impermeabile attaccato alla membrana basale, che funge da barriera e fornisce i nutrienti assorbiti al tessuto corporeo circostante.

L’istituzione di sistemi di coltura in grado di ricapitolare queste funzioni intestinali in vitro è stataimpegnativa 3. I modelli convenzionali in vitro utilizzano linee cellulari di cancro colorettale umano trasformate, come Caco-2, per generare colture monostrato 2D. Pur essendo in grado di modellare molteplici funzioni del compartimento assorbitivo, questi modelli non possono ricapitolare completamente la composizione e la funzione dell’epitelio intestinale, che limitano le caratteristiche funzionalichiave e le applicazioni 4,5.

L’emergere degli organoidi come sistema avanzato di coltura 3D generato da cellule staminali in grado di auto-organizzarsi e differenziarsi dai tipi di cellule specifiche degli organi, è stata una svolta nello studio in vitro dell’epitelio intestinale6. Gli organoidi intestinali sono incorporati in una matrice extracellulare (ECM) che assomiglia alla lamina basale e formano giunzioni a matrice cellulare che permettono a queste colture di mantenere la polarità apicobasale dell’epitelio. Gli organoidi mostrano un’architettura chiusa in cui il lato apicale è esposto al compartimento luminare, imitando così la struttura dell’intestino. Sebbene questa organizzazione chiusa offra l’opportunità di studiare funzioni specifiche per l’orientamento, limita le indagini che richiedono l’accesso al lato apicale dell’epitelio. Sono stati adottati diversi approcci per superare questi limiti sia in 2D che in 3D, tra cui la frammentazione organoide, la microiniezione organoide e la generazione di colturemonostrato 7. La frammentazione organoide causa la perdita dell’organizzazione strutturale e la distruzione delle giunzioni cellulari, che consente l’esposizione della superficie apicale dell’epitelio al mezzo. Questa tecnica sfrutta la capacità rigenerativa dei frammenti di riformare gli organoidi quando sono seminati in una matrice extracellulare ed è stata utilizzata per modellare le malattie infettive e le interazioni ospite-patogeno8,9. Tuttavia, l’accesso simultaneo sia alla superficie apicale che basale può anche suscitare risposte non specifiche all’infezione.

Un approccio alternativo che consente l’accesso alla superficie apicale e preserva sia l’architettura strutturale che le giunzioni cellulari è rappresentato dalla microiniezione di fattori nel lume degli organoidi. Questo metodo è stato ampiamente utilizzato per studiare le interazioni ospite-patogeno e modellare gli effetti del Cryptosporidium10, H. pylori11e C. difficile12 sull’epitelio gastrointestinale in vitro. Utilizzando tecniche simili, è stato determinato il potenziale mutageno dei pks+ ceppo di E. coli sull’epitelio intestinale13. Sebbene efficace, la microiniezione organoide è un compito laborioso e inefficiente considerando l’alto numero di organoidi che devono essere iniettati per ottenere effetti misurabili e quindi limita la sua applicazione per test ad alta produttività.

Recenti progressi con gli organoidi intestinali hanno anche fornito metodi per la creazione di colture organoidi monostrato 2D, esponendo così la loro superficieapicica14,15,16,17. Questi monostrati derivati da organoidi ricapitolano le proprietà chiave in vivo dell’epitelio intestinale. Presentano una composizione cellulare fisiologicamente rilevante, contenente popolazioni di cellule staminali e differenziate e modellano la diversità attraverso l’asse cripto-villus. Man mano che viene mantenuta la polarità apicobasale, le proprietà intrinseche del monostrato consentono un facile accesso sia dei lati apicali che basolaterali e gli scambi di media possono imitare il flusso intestinale e la rimozione dei rifiuti consentendo una coltura a lungo termine. Queste caratteristiche rendono i monostrati derivati da organoidi disponibili per studi incentrati sulle interazioni luminali e forniscono un modello superiore per l’integrità della barriera epiteliale e lapermeabilità 18,19.

Studi hanno dimostrato che la polarità cellulare epiteliale è strettamente regolata dalle proteine ECM negli sferoidi MDCK20,21 e recentemente negli organoidi intestinali umani22. La rimozione dei componenti ECM o l’inibizione del recettore dell’integrina che media le giunzioni a matrice cellulare provoca un’inversione di polarità degli organoidi intestinali e l’esposizione del lato apicale dell’epitelio almezzo 22. Questo approccio ha attirato l’interesse dei ricercatori che lavorano sulle malattie infettive in quanto consente un facile accesso al lato apicali in 3D e lo rende suscettibile a test ad alta produttività. Qui descriviamo un protocollo modificato basato sul recente lavoro del laboratorio Amieva22, che facilita la generazione di organoidi intestinali 3D che espongono prontamente il loro lato apicico. Delineamo anche un protocollo in grado di generare in modo efficiente e riproducibile monostrati 2D intestinali derivati da organoidi intestinali.

Protocol

La derivazione delle colture organoidi intestinali umane è stata eseguita come descritto altrove23. Gli organoidi sono stati mantenuti in coltura come descritto dalla scheda informativa del prodotto (PIS) per il mezzo di espansione organoide intestinale (fare riferimento alla tabella dei materiali). 1. Inversione della polarità organoide intestinale NOTA: Questa sezione illustrerà il protocollo per invertire la polarità degli organoidi intestinali 3D. Questo protocollo prevede una procedura dettagliata per la creazione di organoidi polarizzati con una superficie apicale esposta in sospensione in una piastra di coltura. Questo protocollo è inteso come un saggio del punto finale, anche se gli organoidi potrebbero essere mantenuti in questa conformazione per oltre 2 settimane e mantenere una piccola popolazione di cellule staminali che consente loro di ristabilire organoidi apicale al passaggio. Coltura di rivestimento e tubi con soluzione antiaderenteNOTA: Per massimizzare il numero di organoidi intestinali apicicali e prevenire l’attaccamento indesiderato alle cultureware, è generalmente necessario il prerivestimento delle cultureware. La sezione qui sotto descritta descrive il rivestimento di coltura e stoviglie con soluzione anti-aderenti. Piastre di coltura del mantello da utilizzare nella parte sospensione del protocollo come segue. Aggiungere 0,5 mL di soluzione antiaderente ad ogni pozzo di una piastra di coltura tissutale da 24 po ‘. Ruotare la piastra per stendere la soluzione uniformemente sulla superficie e sulle pareti dei pozzi. Centrifugare la piastra a 1.300 x g per 10 min. Rimuovere la soluzione antiaderente da ogni pozzo utilizzando un aspiratore o una pipetta da 1 mL. Lavare i pozzi con 1 mL di DMEM/F-12 con HEPES da 15mM (DMEM/F12). Riempire ciascuno lavato bene con 0,5 mL di DMEM/F-12 e conservare la piastra a 37 °C e 5% co2 fino all’uso.NOTA: Se non utilizzate immediatamente, le piastre rivestite possono essere conservate nell’incubatrice per almeno 1 settimana. Cappotto 15 mL tubi conici utilizzati in questo protocollo come segue. Aggiungere 4 ml di soluzione antiaderente al tubo conico da 15 ml. Ruotare il tubo per diffondere la soluzione uniformemente sulla superficie delle pareti. Centrifugare il tubo a 1.300 x g per 10 min. Rimuovere la soluzione antiaderente dal tubo. Lavare il tubo 1x con 5 mL di DMEM/F-12 e aspirare il DMEM/F-12. I tubi sono ora pronti per l’uso.NOTA: Se non viene utilizzato immediatamente, aggiungere 5 ml di DMEM/F12 e conservare a 4 °C. I tubi rivestiti possono essere mantenuti a 4 °C per almeno una settimana. Inversione di polarità degli organoidi intestinali per coltura di sospensioneNOTA: I passaggi seguenti delineano l’inversione degli organoidi intestinali precedentemente coltivati in condizioni standard della cupola ECM. Le procedure descritte qui sono per un pozzo di una piastra da 24 po ‘. Se si utilizzano altri cultureware, regolare i volumi di conseguenza. Rimuovere e scartare con cura il mezzo da ogni organoidi ben contenente senza interrompere la cupola a matrice extracellulare della membrana basale. Assicurarsi che la dimensione degli organoidi sia di 150-250 μm di diametro (tipicamente al giorno 3-5) prima di iniziare il protocollo di inversione. Aggiungere 1 mL di soluzione di dissociazione ghiaccio-freddo in ogni pozzo. Incubare a temperatura ambiente (15-25 °C) per 1 min. Aggiungere almeno 2 ml di soluzione antiaderente a un tubo da 15 ml da utilizzare per il rivestimento di punte in plastica. Aggiungere almeno 2 ml di DMEM/F-12 a un tubo da 15 ml da utilizzare per il lavaggio di punte in plastica risciacquate con soluzione antiaderente. Rivestire una punta di pipetta da 1 ml con soluzione antiaderente, pipettando 1 ml di soluzione tre volte nel tubo con soluzione antiaderente dal passo 1.2.4. Lavare la punta in DMEM/F-12 freddo, tubazione di 1 ml di soluzione tre volte nel tubo con DMEM/F-12 dal passo 1.2.5. Utilizzando la punta rivestita, rimuovere con cura le cupole tubazionando lentamente. Fare attenzione a non interrompere o frammentare gli organoidi. Trasferire la sospensione organoide su una piastra trattata con soluzione antiaderente (dal passaggio 1.1.1). Posizionare la piastra su uno shaker a 4 °C per 30 minuti. Uno shaker giroscopio può essere utilizzato a 70 giri/min.NOTA: Evitare scosse dure, come vortice del campione, in quanto possono causare frammentazione organoide. La formazione di bolle e schiuma può indicare dure scosse. Dopo 30 minuti, rimuovere la piastra. Utilizzando una punta di pipetta da 1 mL rivestita con soluzione antiaderente, pipettare delicatamente la soluzione su e giù. Posizionare la piastra su uno shaker a 4 °C per 15 minuti. Uno shaker giroscopio può essere utilizzato a 70 giri/min. Rimuovere la piastra e lasciare che gli organoidi si sistemino per gravità (1-2 minuti a temperatura ambiente). Osservare la piastra al microscopio per verificare la sedimentazione organoide.NOTA: Evitare un’ampia agitazione della piastra in quanto può causare la sospensione degli organoidi stabilizzati. Dopo che gli organoidi si depositano, rimuovere la maggior parte possibile della soluzione di dissociazione e lavare aggiungendo 1,5 mL di DMEM/F-12. Lasciare sedimentare gli organoidi e rimuovere il più possibile il supernatante. Ripetere ancora una volta il passaggio di lavaggio.NOTA: Osservare la piastra al microscopio per verificare la sedimentazione organoide prima di eseguire qualsiasi fase di lavaggio. Rimuovere il più possibile il DMEM/F-12 e aggiungere 0,5 mL di mezzo di espansione organoide intestinale. Incubare a 37 °C e al 5% di CO2. Il giorno seguente, eseguire un cambio medio parziale inclinando la piastra su un angolo da 25 a 30 gradi e rimuovendo il mezzo lungo la parete del pozzo. Rimuovere 0,4 mL di mezzo facendo attenzione a non rimuovere gli organoidi sospesi. Aggiungere un mezzo di espansione organoide intestinale da 0,4 mL. Incubare a 37 °C e 5% CO2 per 3 giorni.NOTA: Dopo 3 giorni, la maggior parte degli organoidi dovrebbe avere una polarità apicicale, ma potrebbero essersi formati grandi aggregati. Se si sono formati aggregati, utilizzare una pipetta da 1 mL con una punta rivestita con soluzione antiaderente (come descritto nei passaggi 1.2.6 e 1.2.7) per tagliare gli aggregati tubazioni su e giù 20 volte mentre si preme l’estremità della punta nella parte inferiore della piastra. Posizionare la piastra a 37 °C e al 5% di CO2 ed eseguire un cambio medio completo il giorno successivo con il mezzo di espansione organoide intestinale (come descritto nella sezione 1.2.17). Dopo 2 giorni (giorno 5 in sospensione), gli organoidi intestinali apicicali possono essere utilizzati nei saggi a valle. 2. Creazione di colture di monostrato 2D a cellule intestinali e di interfaccia aria-liquido (ALI) derivate da organoidi intestinali 3D NOTA: Questa sezione illustrerà il protocollo per la generazione di colture monostrato 2D da organoidi intestinali. Questa tecnica offre il vantaggio di stabilire una coltura monostrato confluente e polarizzata con una superficie apicale esposta in una piastra di coltura tissutale contenente inserto di membrana di coltura cellulare. Sebbene il monostrato inizierà a differenziarsi nel formato sommerso monostrato, un’ulteriore differenziazione del monostrato può essere ottenuta passando a una coltura ALI dopo aver raggiunto la confluenza. Sia il monostrato che i successivi protocolli ALI sono intesi come test del punto finale e sebbene la coltura monostrato mantenga una piccola popolazione di cellule staminali, nessuno dei due può essere efficacemente diviso e passaggio dopo che è stato stabilito. Preparazione di supporti e piastre per la coltura intestinale monostrato Preparare il mezzo di differenziazione organoide intestinale come delineato dal produttore per la coltura monostrato (vedi Elenco dei materiali). Aggiungere Y-27632 solo a un volume di mezzo che verrà utilizzato entro 1 settimana ad una concentrazione finale di 10 μM. Se non viene utilizzato immediatamente, conservare a 4 °C. Edta di tripsidenza pre-calda (0,05%) a 37 °C. Almeno 2 ore prima della semina delle colture monostrato, preparare una soluzione di rivestimento ECM al 2% come segue. Scongelare L’ECM sul ghiaccio e aggiungere 1:50 al PBS sterile e freddo per preparare una soluzione al 2%. Preparare quantità sufficienti per aggiungere 100 μL al pozzo superiore di ogni inserto a membrana di coltura cellulare da 6,5 mm (0,33 cm2). Regolare il volume in modo appropriato per colture più grandi o più piccole. Aggiungere 100 μL ad ogni pozzo e incubare ogni piastra a 37 °C e 5% di CO2 fino a quando necessario (almeno 2 ore prima della semina). Dissociazione degli organoidi intestinali per la generazione e la coltura monostrato Rimuovere un numero appropriato di pozzi di coltura organoide dall’incubatore. Fare riferimento alla tabella 1 per il numero consigliato di pozzi da raccogliere per vari stoviglie. Aspirare tutto il mezzo dalle colture organoidi senza disturbare la cupola ECM. Aggiungere 1 mL di soluzione di dissociazione ad ogni pozzo. Incubare a temperatura ambiente (15-25 °C) per almeno 1 min. Utilizzando una pipetta da 1 mL, pipettare vigorosamente su e giù per interrompere la cupola e rilasciare gli organoidi. Mettere in comune gli organoidi sospesi da ogni pozzo in un tubo conico da 15 ml. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti con agitazione delicata o dondolo. Organoidi per la semina di più pozzi possono essere raggruppati in questo passaggio, fino a 10 mL di volume in ogni tubo. Centrifuga a 200 x g per 5 min a 4 °C. Rimuovere e scartare il supernatante. Aggiungere 5 mL di DMEM/F-12 ghiacciato per riposizioso gli organoidi. Mescolare e centrifugare nuovamente a 200 x g per 5 min a 4 °C. Aspirare il supernatante, rimuovendo il più possibile, facendo attenzione a non disturbare il pellet.NOTA: Alcuni ECM residui possono rimanere nel pellet; tuttavia, ciò non dovrebbe influire significativamente sulla dissociazione degli organoidi. Aggiungere 1 mL di tripside-EDTA (37 °C) prerifampito (0,05%) agli organoidi di sospensione. Mescolare accuratamente per garantire una sospensione uniforme. Aggiungere fino a un ulteriore 1 mL di Tripside-EDTA per un gran numero di cellule o se rimane una quantità significativa di ECM. Incubare a 37 °C per 5-10 minuti. Mescolare accuratamente con una pipetta da 1 mL per interrompere il più possibile gli organoidi. Gli organoidi devono essere completamente dissociati in singole cellule o piccoli frammenti. Se frammenti più grandi o organoidi interi rimangono dopo la pipettazione a fondo, continuare l’incubazione con Tripside-EDTA a 37 °C per altri 3-5 minuti.NOTA: Non incubare con Tripina-EDTA per più di 20 min, in quanto ciò può comportare una maggiore perdita di vitalità cellulare. Una volta che gli organoidi sono sufficientemente dissociati, aggiungere un volume uguale di DMEM/F-12 (ad esempio, 1 mL DMEM/F-12 per mL Trypsin-EDTA) e pipettare su e giù per mescolare accuratamente. Disattivare Trypsin-EDTA aggiungendo il 10% di FBS al DMEM/F-12 in questo passaggio. Centrifugare frammenti a 200 x g per 5 min a 2-8 °C. Se gli organoidi dissociati non riescono a pellet, questo è comune e può essere dovuto ad un accumulo di muco rilasciato dalle cellule dissociate. In questo caso, mescolare accuratamente le cellule tubazioni su e giù e centrifugarle nuovamente a 200 x g per 5 minuti a 2-8 °C. Rimuovere con cura il più possibile il supernatante, lasciando solo il pellet cellulare. Rimorsiva le cellule in 100 μL di mezzo di differenziazione organoide intestinale (con 10 μM Y-27632) per ogni pozzo da seminare. Regolare il volume in modo appropriato per pozzi di dimensioni maggiori o più piccole. Rimuovere le piastre rivestite dall’incubatore (preparate nel passaggio 3.1.4) e rimuovere l’ECM in eccesso da ogni pozzo. Aggiungere 100 μL della sospensione cellulare al pozzo superiore di ogni inserto di coltura cellulare. Aggiungere 500 μL di mezzo di differenziazione organoide intestinale al pozzo inferiore di ogni inserto di coltura cellulare. Incubare a 37 °C e al 5% di CO2. Sostituire il mezzo sia nei pozzi superiore che inferiore ogni 2-3 giorni. Le culture monostrato dovrebbero raggiungere la confluenza entro 7 giorni e spesso raggiungeranno la confluenza entro 2-3 giorni. Creazione di una cultura air-liquid interface (ALI)NOTA: Se lo si desidera, un’ulteriore differenziazione di una coltura di monostrato intestinale sommersa può essere realizzata passando la coltura monostrato sommersa a una cultura ALI. Questo metodo di coltura consentirà un aumento del numero di tipi di cellule differenziate, in particolare cellule della discendenza secretoria, come calici e cellule enteroendocrine. Stabilire una coltura monostrato in un inserto di coltura cellulare come descritto sopra nei passaggi 2.2.1-2.2.23 e mantenere questa coltura al 100% di confluenza per almeno 4 giorni. Per stabilire una coltura ALI, rimuovere il mezzo dai pozzi superiore e inferiore. Aggiungere il mezzo di differenziazione organoide intestinale fresco (con Y-27632) al pozzo inferiore, lasciando il pozzo superiore vuoto. Incubare a 37 °C e al 5% di CO2. Sostituire il mezzo nel pozzo inferiore ogni 2-3 giorni e lasciare che il monostrato distingua per almeno 1 settimana. Risciacquare bene la tomaia con PBS sterile per rimuovere l’accumulo di muco in eccesso, se necessario.In queste condizioni, la cultura ALI può essere mantenuta per almeno 2-3 settimane.

Representative Results

Gli organoidi sono stati generati da campioni di biopsia seguendo il protocollo descritto inprecedenza 23 e nel PIS per il mezzo di espansione organoide intestinale (vedi tabella dei materiali). La figura 1A, Pannello sinistro, mostra il fenotipo degli organoidi intestinali coltivati in una cupola con mezzo di espansione organoide intestinale. In queste condizioni di coltura, gli organoidi mostrano una morfologia cistica definita da un epitelio sottile (10-25 μm) che racchiude un lume(Figura 1A, Pannello destro). In questa fase, il lato apicale dell’epitelio intestinale si affaccia sul lume, mentre il lato basolaterale contatta la matrice extracellulare circostante. Quando la maggior parte degli organoidi raggiunse la dimensione desiderata, la matrice extracellulare fu rimossa, e gli organoidi furono poi coltivati in sospensione. La perdita di legame cellulare alla matrice extracellulare innesca un processo di inversione negli organoidi, con conseguente inversione della polarità dell’epitelio organoide, esponendo il lato apicale dell’epitelio al mezzo di crescita e interiorizzando il lato basolaterale. In alcune culture, organoidi in sospensione si aggregano e fusibili, un effetto più profondo durante i primi 3 giorni(Figura 1B, Pannello sinistro). L’applicazione di una tecnica di taglio consente il distacco degli organoidi e la continuazione delle colture per giorni con una riaggregazioneminima (Figura 1B,Pannello destro). Gli organoidi intestinali coltivati nelle cupole ECM continuano ad espandersi(Figura 1C,Pannello sinistro)e mostrano la formazione spontanea di strutture secondarie in erba, simili a piccole cripte, sul lato basolaterale dell’epitelio che circonda il lume(Figura 1C,Pannello destro). Allo stesso tempo, gli organoidi mantenuti per 5 giorni in assenza di matrice extracellulare continuano a svilupparsi in sospensione (Figura 1D, Pannello sinistro). L’inversione della polarità è caratterizzata dall’ispessimento (30-40 μm) dell’epitelio che circonda il nucleo degli organoidi e dalla comparsa di una varietà di morfologie: allungato(Figura 1D, Pannello destro e Figura complementare 1A),cistico(Figura complementare 1B)e irregolare(Figura supplementare 1C). Questo è spesso combinato con un restringimento dello spazio luminare all’interno dell’organoide, influenzando le loro dimensioni complessive. Un’inversione efficiente può anche essere confermata analizzando l’espressione di marcatori di polarità specifici intestinali. Gli organoidi intestinali apicali mostrano una netta localizzazione dei nuclei verso il lume dell’organoide, come indicato dal segnale 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). L’espressione di marcatori apicali, come VILLIN (Figura 2A) e ZO-1 (Figura 2B), viene rilevata sul lato esterno dell’epitelio esposto al mezzo. Questa localizzazione è in netto contrasto con quella osservata negli organoidi intestinali coltivati in ECM. Gli organoidi incorporati a matrice extracellulare macchiati per nuclei (DAPI), VILLIN (Figura 2C) e ZO-1 (Figura 2D) dimostrano una polarità apicobasale in cui il lato apicale è rivolto verso il lume dell’organoide. La rimozione completa dell’ECM è necessaria per ottenere un’efficace inversione di polarità degli organoidi intestinali. Occasionalmente, una porzione di organoidi presenti nelle colture di sospensione circondati da residui di ECM, mostra una morfologia cistica che suggerisce un fallimento nell’inversione di polarità dell’epitelio (Figura complementare 2A). L’analisi della colorazione immunofluorescente, eseguita su questi organoidi, fornisce la prova della posizione basolaterale dei nuclei (DAPI) lungo l’epitelio e dell’espressione di ZO-1 sul lato apicale che si affaccia sul lume dell’organoide (Figura complementare 2B) confermando che la rimozione incompleta dell’ECM causa la ritenzione della polarità apicobasale in modo simile agli organoidi incorporati nell’ECM. Il protocollo per la creazione di colture monostrato intestinali si traduce in una coltura monostrato confluente entro 7 giorni dalla semina e la coltura raggiungerà spesso la confluenza entro soli 2-3 giorni. Uno dei principali fattori determinanti del successo è il numero e la qualità delle cellule utilizzate per seminare il monostrato. Figura 3A, Pannello sinistro fornisce un esempio di densità di semina ideale di circa 150.000 celle in un inserto di membrana di coltura cellulare da 6,5 mm. Questo numero non è fisso e può essere altamente variabile in base al donatore e alla qualità della coltura organoide di origine; pertanto, il numero di cella dovrebbe essere ottimizzato in base a queste variabili. Se la densità di semina è troppo bassa o di scarsa qualità(Figura 3A, Pannello destro), potrebbero non esserci allegati sufficienti per formare una coltura monostrato confluente. Una volta stabilito il monostrato (Figura 3B), le celle formano giunzioni strette, creando un aspetto di ciottoli (Figura 3B, Pannello sinistro). Se non riescono a formare un monostrato confluente (Figura 3B, Pannello destro), l’aspetto del monostrato sarà spesso “irregolare”, con regioni di attacco cellulare di buona qualità, ma con spazi più ampi tra queste regioni. Queste colture non forniscono una barriera funzionale tra i compartimenti basali e apicali e non sono adatte ai saggi descritti. Un monostrato confluente orienta il bordo del pennello contenente VILLIN verso il lato apicale dell’epitelio, con il suo nucleo posizionato verso il polo basolaterale della cellula (Figura 4B). Tra una cellule e l’altra si formano giunzioni intercellulari costituite da complessi multi-proteici, tracui ZO-1 ( Figura 4B). La loro presenza è fondamentale per fornire la funzione barriera della cultura epiteliale. Una volta confluente, la transizione verso una cultura ALI induce un’ulteriore differenziazione della cultura (Figura 3C). Appaiono piccole cellule rotonde del calice e il monostrato stesso assume un aspetto più piegato. Sebbene le cellule del calice siano presenti all’interno dell’epitelio dellacoltura sommersa ( Figura 4A), sono più prominenti in seguito alla differenziazione ALI. Le cellule di calice presenti all’interno dell’epitelio secernono muco, portando ad un aspetto nebuloso sopra la parte superiore dell’epitelio. Le cellule del calice e il muco secreto possono essere visualizzati mediante colorazione per la proteina mucina secreta MUC2 (Figura 4A, C e D) e l’aumento della popolazione cellulare del calice può essere misurato con un aumento dell’espressione MUC2 (Figura complementare 3A). Non è necessario rimuovere questo strato di muco simile a un gel e si attacca alla superficie dell’epitelio e rimarrà dopo ripetuti lavaggi. Se è necessaria la rimozione, lavare la coltura con un composto mucolitico, come 10 mM N-acetil cisteina o 50 μg/mL DTT rimuove il muco in eccesso. Oltre all’aumento della popolazione cellulare del calice, l’interfaccia ALI aumenta anche la presenza di cellule enteroendocrine (come indicato dall’espressione CHGA) (Figura complementare 3B) e enterociti maturi (come indicato dall’espressione KRT20) (Figura complementare 3C). Figura 1: Fasi della generazione di organoidi intestinali apicicali. (A) Immagini rappresentative di una cupola con organoidi della dimensione desiderata al giorno 4 (Pannello sinistro, barra di scala = 500 μm). Gli organoidi sono sottili murati, con un compartimento luminare aperto (pannello destro, barra di scala = 100 μm). (B) Immagine rappresentativa di un pozzo con ampia aggregazione dopo 3 giorni di sospensione (pannello sinistro, barra di scala = 200 μm). Immagine dei frammenti di ciuffo direttamente dopo la cesoia (Pannello destro, Barra di scala = 200 μm). (C) Immagine rappresentativa degli organoidi intestinali nella cupola al giorno 7. Gli organoidi mostrano un lume espanso con la formazione di piccole gemme sul lato basolaterale dell’epitelio (ingrandimento sinistro 20x, ingrandimento destro 100x della regione marcata, barra di scala = 200 μm). (D) Immagine rappresentativa degli organoidi intestinali dopo la rimozione dell’ECM e la successiva coltura di sospensione per 5 giorni. Gli organoidi ottengono una morfologia densa con un epitelio ispessito ed espongono il loro lato apicale al mezzo. (Ingrandimento 20x sinistro, ingrandimento destro 100x della regione contrassegnata, barra di scala = 200 μm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Colorazione immunofluorescente per marcatori di polarità cellulare negli organoidi intestinali. Gli organoidi intestinali orientatiall’apicali (A,B)e all’apicalità(C,D)erano macchiati con marcatori apicali ZO-1 e VILLIN, e con marcatore epiteliale E-CADHERIN (rosso). Dapi (blu) è stato usato per visualizzare i nuclei. I pannelli di sinistra visualizzano immagini scattate con ingrandimento 25x e i pannelli destro visualizzano immagini di diversi organoidi con ingrandimento 63x (solo il pannello C visualizza un ingrandimento 25x e 63x dello stesso organoide). (A) Gli organoidi intestinali apicicali macchiati di VILLIN (verde) ed E-CADHERIN (rosso) indicano l’esposizione del lato apicico al mezzo. (B) Gli organoidi intestinali apicali macchiati di ZO-1 (verde) ed E-CADHERIN (rosso) mostrano la presenza di giunzioni strette e la reversione della polarità apicobasale. (C) Organoide intestinale incorporato nel matrigel macchiato di VILLIN (verde) ed E-CADHERIN (rosso) che mostra il lato apicico rivolto verso il lume organoide. (D) Organoidi intestinali incorporati in Matrigel macchiati di ZO-1 (verde) ed E-CADHERIN (rosso) che indicano la presenza di giunzioni apicali strette rivolte verso il lume dell’organoide. (Barra di scala = 100 μm). Gli organoidi sono stati macchiati dall’immunofluorescenza e sono stati coniati utilizzando protocolliprecedentemente pubblicati 24,25. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Creazione di colture monostrato intestinali. (A) Immagine rappresentativa degli organoidi 3D dopo il trattamento con 0,05% Tripina-EDTA. Gli organoidi sono dissociati a singole cellule o piccoli grumi cellulari in preparazione alla semina di colture monostrato. Pannello sinistro: esempio di densità di semina ottimale per una coltura monostrato, circa 150.000 cellule per 100 μL su un inserto di membrana di coltura cellulare da 6,5 mm. Pannello destro: esempio di densità di semina non ottimale a <50.000 cellule per 100 μL su un inserto di membrana di coltura cellulare da 6,5 mm. (B) Immagine rappresentativa a campo luminoso di una coltura monostrato sommersa. Pannello sinistro: strato confluente al 100% con il caratteristico aspetto acciottollante. Pannello destro: circa il 50% monostrato confluente. Gli spazi vuoti osservati nel monostrato (indicati dalla linea tratteggiata) si chiudono nel tempo a causa della continua proliferazione delle cellule staminali intestinali. (C) Immagine rappresentativa di una cultura ALI differenziata a 7 giorni. (Barra di scala = 200 μm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Colorazione immunofluorescente per marcatori cellulari differenziati in colture monostrato. (A) Immagine z-stack della colorazione immunofluorescente di una coltura monostrato sommersa per la proteina mucina MUC2, che indica la presenza di cellule di calice all’interno della coltura monostrato (verde = MUC2, blu = DAPI). (B) Immagine z-stack della colorazione immunofluorescente di un monostrato sommerso. La colorazione VILLIN (verde) lungo l’estremità apicale dell’epitelio indica la presenza di un bordo pennello e la colorazione ZO-1 (rosso) indica la presenza di giunzioni strette tra le cellule (blu = DAPI). (C) Immagine z-stack della colorazione immunofluorescente di una coltura monostrato differenziata ALI per la proteina mucina MUC2, che indica la presenza di un numero significativamente maggiore di cellule calici all’interno della coltura monostrato ALI (verde = MUC2, blu = DAPI). (D) Criosezione della coltura monostrato differenziata ALI, macchiata per la presenza di MUC2 (verde) ed E-CADHERIN (rosso) che indica la presenza di cellule di calice nell’epitelio e la secrezione di muco lungo il lato apicale della coltura monostrato. (Barra di scala = 200 μm). Le colture monostrato sono state macchiate dall’immunofluorescenza e immagini utilizzando protocolliprecedentemente pubblicati 26,27. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura complementare 1: Spettro dei fenotipi di organoide intestinale apicale nella sospensione della coltura. (A,B,C) Ulteriori immagini rappresentative delle morfologie organoidi intestinali mantenute in sospensione 5 giorni dopo la rimozione dell’ECM. La polarità organoide si è invertita. Gli organoidi sono diventati più densi con un epitelio ispessito e il lato apicale degli organoidi è rivolto verso l’esterno. Gli organoidi possono mostrare una varietà di morfologie: allungato (A), cistico (B) e irregolare (C). (Barra di scala = 100 μm). Clicca qui per scaricare questo file. Figura complementare 2: Gli organoidi intestinali non riescono a invertire la polarità in presenza di mezzo matrice di membrana basale residuo nelle colture di sospensione. (A) Immagine rappresentativa della rimozione incompleta dell’ECM e della mancata inversione della polarità degli organoidi. I resti di Matrigel sono presenti intorno agli organoidi e contribuiscono a mantenere la polarità dell’epitelio orientata all’apicalità. Gli organoidi mostrano una morfologia cistica con un epitelio sottile che circonda il lume (barra di scala = 200 μm). (B) Immagine rappresentativa di un organoide non invertito presente in condizioni di coltura delle sospensioni. I nuclei (blu = DAPI) e E-CADHERIN (rosso) sono posizionati sul lato basolaterale, ZO-1 (verde) è espresso sul lato apicali che si affaccia sul lume dell’organoide. (Barra di scala = 100 μm). Clicca qui per scaricare questo file. Figura complementare 3: Espressione genica dei marcatori cellulari differenziati nelle colture monostrato. (A,B,C) Espressione di MUC2, CHGAe KRT20 in coltura monostrato sommersa e differenziata ALI generata nel Mezzo di Differenziazione Organoide Intestinale rispetto a una coltura organoide 3D coltivata con Medium di Espansione Organoide Intestinale stabilito tramite qPCR. La creazione di una coltura monostrato sommersa aumenta l’espressione di ogni marcatore cellulare differenziato; tuttavia, la differenziazione come cultura ALI aumenta esponenzialmente l’espressione di ogni marcatore. Barre di errore = +/- SEM. Fare clic qui per scaricare questo file. CULTUREWARE MONOSTRATO NUMERO DI POZZI DI ORGANOIDI INTESTINALI DA RACCOGLIERE (da 50 μL cupola/per pozzo da seminare) Inserto Transwell da 6,5 mm 1 – 2 pozzi Inserto Transwell da 12 mm 3 – 4 pozzi Piastra a 6 pozzi 6 – 8 pozzi Piastra da 24 pozzi 3 – 4 pozzi Piastra da 96 pozzi 1 – 2 pozzi Tabella 1: Numero di pozzi di organoidi intestinali da raccogliere per vari stoviglie

Discussion

I modelli organoidi epiteliali sono diventati potenti piattaforme che possono essere utilizzate per modellare l’organizzazione dei tessuti, la progressione della malattia eidentificare le terapie 23,28,29. La microiniezione organoide ha un valore aggiunto alla capacità degli organoidi di modellare le malattie infettive in quanto consente l’interazione patogena con il lato apicale dell’epitelio ospite. Recenti progressi nelle tecniche di microiniezione hanno ottimizzato la velocità di iniezione negli organoidi e hanno raggiunto una velocità fino a 90 organoidi iniettati all’ora. La funzione barriera negli organoidi iniettati è stata preservata e la bassa concentrazione di ossigeno all’interno del lume ha permesso la sopravvivenza dei batteri iniettati anaerobiciobbligatori 30. Tuttavia, studi hanno notato la presenza di eterogeneità nelle popolazioni organoidi all’interno dello stesso pozzo. Queste differenze sono state osservate nelle dimensioni enella forma 31,livelli di espressione deigeni chiave 32,nonché tassi di proliferazione33. Sono state descritte anche le risposte differenziali all’interno della stessa popolazione organoide a composti come la forskolina e la PGE2, o alla tossina colera28,33. Questi risultati evidenziano la necessità di un elevato numero di organoidi negli studi e limitano l’utilizzo dell’iniezione luminare.

La coltura organoide convenzionale si basa sull’incapsulamento e la propagazione degli organoidi in un idrogel. Tuttavia, gli idrogel possono porre limitazioni alla diffusione e introdurre gradienti di concentrazione, che possono aumentare l’eterogeneità34. Inoltre, è stata documentata un’elevata variabilità, non solo tra culture e donatori, ma anche all’interno di singole condizioni sperimentali. La fonte donatrice, le proprietà biochimiche dell’idrogel e l’eterogeneità intrinseca dell’organoide come sistema di coltura sono fattori importanti che possono aumentare la variabilità sperimentale e limitare la riproducibilità dei risultati ottenuti nelle applicazioni a valle. Entrambi i metodi qui descritti forniscono un semplice mezzo per esporre il lato apicale dell’epitelio, consentendo la modellazione di composti e agenti patogeni di interesse aggiungendoli direttamente al mezzo di coltura. La riduzione dell’utilizzo dell’idrogel può limitare la variabilità sperimentale da fonti tecniche di errore.

Gli organoidi intestinali apicicali mantengono le caratteristiche chiave del sistema di modelli organoidi e la loro scalabilità li rende più suscettibili ai test ad alta produttività, rispetto al monostrato 2D. Tuttavia, poiché gli organoidi mantengono la loro struttura 3D, l’accessibilità del lato basale è limitata e può ostacolare gli studi che richiedono l’accesso simultaneo a entrambi i lati.

Abbiamo dimostrato che l’inversione di polarità degli organoidi intestinali si basa sulla rimozione efficiente e assoluta dell’ECM, preservando al contempo la struttura intatta degli organoidi. Sia l’utilizzo della soluzione di dissociazione per rimuovere ECM che la soluzione antiaderente per prevenire l’aderenza degli organoidi alla plasticologia hanno contribuito a migliorare l’efficienza complessiva del protocollo pubblicato da Co, J. Y. e colleghi22,in particolare per quanto riguarda il numero di organoidi apicalmente prodotti per applicazioni a valle.

Inoltre, abbiamo osservato che il nostro protocollo supporta un’inversione più efficiente di organoidi inferiori a 250 μm e l’uso di organoidi più grandi può comportare una ridotta uscita organoide, a causa della frammentazione causata dalla pipettazione. Le punte a foro largo, come quelle indicate nella tabella dei materiali, possono consentire l’utilizzo di organoidi più grandi. Tuttavia, le punte a foro largo sono meno efficaci nella dissociazione ECM rispetto alle punte standard a causa della minore forza meccanica applicata. Pertanto, possono essere necessari passaggi ripetuti 1.2.9-1.2.11 per un’interruzione sufficiente e la rimozione completa di tutti i resti di ECM quando si lavora con organoidi più grandi.

Gli organoidi in sospensione possono sopravvivere per almeno 2 settimane. Dopo questo periodo di tempo, abbiamo osservato cambiamenti morfologici e un aumento del numero di morte cellulare. La presenza di cellule prolifere negli organoidi apicali22 consente il ripristino di colture organoidi intestinali apicali. Questo può essere ottenuto dissociando gli organoidi apicali a singole cellule e incorporandoli in ECM con il mezzo di espansione organoide intestinale.

Una limitazione frequentemente riscontrata nei protocolli che descrivono l’istituzione di organoidi intestinali nelle colture di sospensione è la generazione di grandi aggregati. Ciò influisce su diverse variabili come l’efficienza, la riproducibilità delle caratteristiche morfologiche, la permeabilità ai composti e la segnalazione paracrina. Simile al protocollo pubblicato da Co, J. Y. e colleghi, qui confermiamo di aver ottenuto l’inversione di polarità di almeno il 97% di tutti gli organoidi sospesi senza tosatura dopo 3 giorni di sospensione. Tuttavia, a differenza della pubblicazione, abbiamo introdotto una fase di dissociazione meccanica al fine di ridurre la formazione di grandi aggregati e aumentare la resa. Poiché questa procedura può danneggiare l’epitelio degli organoidi, abbiamo esteso il periodo di incubazione degli organoidi per altri 2 giorni per consentire il completo recupero dell’epitelio e garantire colture di alta qualità per applicazioni a valle. L’introduzione di agitazione costante con l’uso di uno shaker dell’incubatore o di un pallone spinner potrebbe potenzialmente ridurre gli eventi di fusione, ridurre al minimo la frammentazione e aumentare l’ossigenazione. Questi approcci alternativi possono mantenere le colture per durate più lunghe, ridurre la morte cellulare e consentire un’ulteriore differenziazione degli organoidi intestinali apicale.

La creazione di un monostrato 2D derivato da organoidi offre diversi vantaggi e svantaggi rispetto alle organoidi di polarità invertite. Il protocollo qui descritto consente la rapida creazione di una coltura monostrato confluente, tipicamente, in meno di 7 giorni e la possibilità di migliorare a lungo termine le culture per un lungo periodo di tempo (fino a 10 settimane). Il protocollo e i mezzi qui utilizzati consentono anche l’efficiente differenziazione di un numero significativo di cellule, non sempre presenti in altre colture monostrato derivate da organoidi16. La creazione di un monostrato su una membrana di coltura cellulare consente l’accesso simultaneo sia ai lati apicali che basolaterali dell’epitelio rendendoli ideali per studi sull’integrità della barriera e sul trasporto epiteliale. Questo accesso semplificato li rende anche più suscettibili agli studi sulle infezioni e sul trattamento farmacologico. Inoltre, queste culture mantengono molte delle caratteristiche uniche del donatore, mantenendo la loro rilevanza per studi specifici del paziente. Il metodo di coltura ALI facilita anche la differenziazione di un epitelio più funzionale composto sia da tipi di cellule secretorie che assorbtive, rendendolo più rappresentativo dell’epitelio intestinale umano. La relativa stabilità di queste culture consente anche di mantenere loro per un periodo di tempo prolungato, offrendo la possibilità di studi a lungo termine. Tuttavia, i limiti di questo approccio sono l’elevato numero di cellule necessarie per stabilire un monostrato confluente e la necessità di mantenere la completa confluenza per avere una separazione funzionale tra le camere apicali e basolaterali. La caratteristica architettura della cripta, che può essere modellata nelle culture organoidi 3D, si perde anche quando si stabilisce una cultura monostrato. Tuttavia, il formato sperimentalmente amichevole della cultura e la facilità con cui è possibile accedere ai lati apicali e basolateri dell’epitelio, lo rendono un potente strumento per lo studio della fisiologia intestinale.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questa ricerca è stata finanziata dalla sovvenzione Horizon 2020 OrganoVIR 812673 sul progetto Organoids for Virus Research – Un programma innovativo di formazione-ITN.

Materials

Anti-Adherence Rinsing Solution STEMCELL Technologies Inc. 7010 For coating cultureware. Referred as anti-adherent solution into the main text.
Conical tubes, 15 mL STEMCELL Technologies Inc. 38009
Corning Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), Phenol Red-Free Corning 356231 Extracellular matrix (ECM) for maintenance and establishment of organoid lines.
Costar 6.5 mm or 12 mm Transwell inserts STEMCELL Technologies Inc. 38023/38024 For 2D Monolayer culture.
Costar 24 Well  Flat-Bottom, Tissue culture-treated plate STEMCELL Technologies Inc. 38017 For maintenance and establishment of organoid lines.
D-PBS (Without Ca++ and Mg++) STEMCELL Technologies Inc. 37350 For washing 
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Millipore Sigma D2650 Reconstitution of small molecules
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES STEMCELL Technologies Inc. 36254 For washing
Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR) STEMCELL Technologies Inc. 7174 For Matrigel removal. Referred as dissociation reagent into the main text.
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) STEMCELL Technologies Inc. 6010 For expansion of organoid lines prior to differentiation. Referred as Intestinal Organoid Expansion Medium into the main text.
IntestiCult Organoid Differentiation Medium (Human) STEMCELL Technologies Inc. 100-0214 For establishment of monolayers and 3D differentiation. Referred as Intestinal Organoid Differentiation Medium into the main text.
Trypsin-EDTA (0.05%) STEMCELL Technologies Inc. 7910 For 2D Monolayer establishment.
Y-27632 STEMCELL Technologies Inc. 72302 RHO/ROCK pathway inhibitor, Inhibits ROCK1 and ROCK2. Used for 2D monolayer establishment.
Wide bore tips Corning #TF-1005-WB-R-S Organoids handling
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Stroulios, G., Stahl, M., Elstone, F., Chang, W., Louis, S., Eaves, A., Simmini, S., Conder, R. K. Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models. J. Vis. Exp. (169), e62330, doi:10.3791/62330 (2021).
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