JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Imunologia e Infecção

Gene Knock-in fra CRISPR/Cas9 og cellesortering i makrofag og T-cellelinjer

Published: November 13, 2021
doi:
10.3791/62328
, , , , , , , , ,
1The Laboratory of Genetic Regulators in the Immune System, School of Laboratory Medicine,Xinxiang Medical University, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy,Aix Marseille Université

Summary

Denne protokollen bruker fluorescerende reportere og cellesortering for å forenkle knock-in eksperimenter i makrofag og T-cellelinjer. To plasmider brukes til disse forenklede knock-in-eksperimentene, nemlig en CRISPR /Cas9- og DsRed2-uttrykkende plasmid og en homolog rekombinasjonsdonor plasmid som uttrykker EBFP2, som er permanent integrert ved Rosa26-locus i immunceller.

Abstract

Funksjonelle genomikkstudier av immunsystemet krever genetiske manipulasjoner som innebærer både sletting av målgener og tilsetning av elementer til proteiner av interesse. Identifisering av genfunksjoner i cellelinjemodeller er viktig for genoppdagelse og utforskning av celleintrinsiske mekanismer. Imidlertid er genetiske manipulasjoner av immunceller som T-celler og makrofagcellelinjer ved hjelp av CRISPR / Cas9-mediert knock-in vanskelig på grunn av den lave transfeksjonseffektiviteten til disse cellene, spesielt i en passiv tilstand. For å modifisere gener i immunceller, brukes valg av legemiddelresistens og virale vektorer vanligvis til å berike celler som uttrykker CRIPSR / Cas9-systemet, noe som uunngåelig resulterer i uønsket inngrep av cellene. I en tidligere studie designet vi to fluorescerende reportere koblet til CRISPR/Cas9 som ble midlertidig uttrykt etter elektroporasjon. Denne tekniske løsningen fører til rask gensletting i immunceller; Imidlertid er gen-knock-in i immunceller som T-celler og makrofager uten bruk av valg av legemiddelresistens eller virale vektorer enda mer utfordrende. I denne artikkelen viser vi at ved å bruke cellesortering for å hjelpe til med å velge celler som transient uttrykker CRISPR/Cas9-konstruksjoner rettet mot Rosa26-gresset i kombinasjon med en donorplasmid, kan gen-knock-in oppnås i både T-celler og makrofager uten berikelse av legemiddelresistens. Som et eksempel viser vi hvordan man uttrykker menneskelig ACE2, en reseptor av SARS-Cov-2, som er ansvarlig for den nåværende Covid-19-pandemien, i RAW264.7 makrofager ved å utføre knock-in-eksperimenter. Slike gen knock-in celler kan brukes mye til mekanistiske studier.

Introduction

Immunceller er kritiske for forsvar mot patogener. Både medfødt og adaptiv immunitet er nødvendig for clearance av smittestoffer og vedlikehold av vev homeostase1,2. Cellelinjemodeller er viktige verktøy for å forstå det molekylære grunnleggende i pattedyrets immunsystem; de brukes i in vitro funksjonelle analyser, for eksempel de som modellerer menneskelig T-celleaktivering, og for å bestemme funksjonen til genetiske faktorer i å aktivere eller dempe immunresponser3,4. Det er viktig å merke seg at pattedyrets immunsystem er enormt heterogent og like viktig, et stort antall molekyler kontrollerer differensiering, migrasjon og funksjon av en gitt celletype5,6.

Clustered Regelmessig Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 genomredigeringsverktøy gir mulighet for genetisk manipulering av bestemte celletyper, noe som letter funksjonell merknad av gener på en presis måte7,8. Flere publiserte protokoller har beskrevet levering av CRISPR/Cas9 i form av Cas9-guide RNA-komplekser kjent som ribonukleoproteiner (RNPer) i HEK293-celler, Jurkat-cellelinjer, primære T-celler9,10, makrofager11,12,13, stamceller14og andre15,16. I disse protokollene oppnås genmerking vanligvis ved å fusjonere en fluorescerende tag til endogene proteiner17,18. Det er imidlertid gjort få forsøk på å bruke to fluorescerende reportere, som er kompatible med enkeltcellesortering, for å lette knock-in-eksperimenter19,20, spesielt i immunceller.

Dyptgående mekanistiske analyser som tar sikte på å forstå funksjonene til en ny genetisk faktor i immunceller, krever generelt cellespesifikk sletting av et gen, genetiske redningseksperimenter og ideelt identifisering av interaktivitetene. Selv om metoder for optimalisering av genetisk sletting av gener i immunceller har blitt publisert9,15,21, er det rapportert langt færre metoder for å introdusere knock-in alleler med allsidige funksjoner for å forstå immunresponsen. Derfor, i denne protokollen tar vi sikte på å beskrive i detalj en effektiv og svært reproduserbar protokoll for å uttrykke et protein av interesse (POI) på safe harbor locus Rosa26 i både menneskelige og murine immuncellelinjer. Vi designet et tofarget reportersystem for å berike for celler transfektert med plasmider som uttrykker CRISPR / Cas9 (DsRed2) og en rekombinant DNA-mal (EBFP2), som kan isoleres ved cellesortering. Etter denne protokollen fikk vi flere knock-in linjer av den menneskelige T-cellelinjen Jurkat og murine makrofag RAW264.7 for funksjonelle analyser av dårlig studerte proteiner.

Som et eksempel viser vi i denne protokollen hvordan du får knock-in RAW264.7 makrofager som stabilt uttrykker menneskelig ACE2 (en reseptor av SARS-Cov-2)22. Fordi medfødte immunceller er involvert i patogenesen av Covid-1923,24 og menneskelig ACE2 anses som en stor reseptor som kreves for viral oppføring i celler før replikering, kan makrofager med knock-in av menneskelig ACE2 tjene som et nyttig verktøy for mekanistiske studier av viral multiplikasjon inne i makrofager. Parallelt presenterer vi også et eksempel på knock-in av et gen ved det menneskelige ROSA26-locus for å uttrykke RASGRP1-proteinet, som ble smeltet sammen ved sin amino terminus med en affinitet Twin-Strep-tag (OST). T-celler er viktige målceller i immunterapi, og et økende antall studier har fokusert på manipulering av deres respons på kreft25,26. Siden Rasgrp1 er kjent for å være et viktig signalmolekyl nedstrøms for T-cellereseptoren og dens interagere ikke er godt belyst27, gir OST-RASGRP1 knock-in-modellen grunnlaget for å identifisere interagere som regulerer T-cellenes respons på svulster og infeksjon. Samlet sett kan disse verktøyene brukes til Covid-19-studier og oppdagelsen av nye molekyler som samhandler med Rasgrp1.

Protocol

1. Design og plasmid konstruksjon av sgRNAer rettet mot Rosa26 Locus Designguide RNAer rundt ønsket innsettingssted Forsikre deg om at innsettingsstedet for mus Rosa26 (heretter utpekt som mRosa26) knock-in eksperimenter er plassert i den første intronen av mRosa26; dette nettstedet har blitt brukt i tidligere studier28,29. For knock-in eksperimenter i menneskelige celler,…

Representative Results

Etter protokollen beskrevet ovenfor for å utføre knock-in eksperimenter på mRosa26 locus ved hjelp av murine RAW264.7 makrofager, designet vi en målrettingsvektor for å uttrykke menneskelig ACE2, en reseptor for SARS-Cov-2-viruset (Figur 2A). Ved hjelp av en lignende design genererte vi humane Jurkat T-celler med knock-in av OST-merket RASGRP1 fusjonsprotein (Figur 2C). Etter transfeksjon av tre plasmider, hvorav to ble brukt til uttrykk for CRISPR…

Discussion

I våre eksperimenter demonstrerte vi hvordan man utfører knock-in redigering i immunceller fra konstruksjonsdesign til knock-in cellescreening og validering ved hjelp av menneskelige Jurkat T-celler og murine RAW264.7 makrofager som eksempler. Både T-cellen og makrofagcellelinjene er motstandsdyktige mot transfeksjon36,37; Imidlertid kan problemet med lav effektivitet av CRISPR / Cas9-levering overvinnes ved hjelp av fluorescerende reportere kombinert med cell…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker strømningscytometrikjerneanlegget til Xinxiang Medical University. Utviklingen av slik teknologi har blitt støttet av NSFC-tilskudd 81601360 til LZ, 81471595 og 32070898 til YL. Arbeidet støttes også av Stiftelsen Henan Educational Committee No. 21IRTSTHN030.

Materials

Amersham Imager 600 Ge Healthcare imaging of chemiluminescence
Ampicillin, sodium salt MP Biomedicals 194526
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074 at 1/5000 dilution
Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1 Merck MABS146 1.0 μg/mL of working concentration
AscI New England BioLabs R0558S
β-Actin (D6A8) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 8457 at 1/1000 dilution
BamHI-HF New England BioLabs R3136S
BbsI-HF New England BioLabs R3539S
Cellometer Mini Automated Cell Counter Nexcelom Bioscience
E.coli DH5α Competent Cells Takara 9057
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) MP Biomedicals 196055
DNeasy Blood & Tissue Kits Qiagen 69506 cell culture reagent
DPBS (10X), no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose HyClone SH30022.01
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
FACSAria™ Fusion BD Biosciences equipped with biosafety cabinet
FACS Canto flow cytometer BD Biosciences
Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube BD Biosciences 352003
Fetal bovine serum (FBS) ThermoFisher Scientific 10099141
FlowJo version 10.7 BD Biosciences
GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAb Cell Signaling Technology 5174 at 1/1000 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP ThermoFisher Scientific 31430 at 1/5000 dilution
Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate Millipore WBKLS0500
Immobilon-PSQ PVDF Membrane Millipore ISEQ00010
Jurkat ATCC TIB-152 https://www.atcc.org/
Kanamycin sulfate MP Biomedicals 194531
LB agar powder ThermoFisher Scientific 22700041
Multi-channel Pipette (30-300 μL) Eppendorf, or similar
Neon Transfection System ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System, 10 μL kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339651
OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master Mix New England BioLabs (M0489) for high GC% template
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa ThermoFisher Scientific 26616
Pipette tip 0.1-20µl Eppendorf, or similar 0030 075.005
Pipette tip 2-200µl Eppendorf, or similar 0030 075.021
Pipette tip 50-1000µl Eppendorf, or similar 0030 075.064
Plasmid Maxi Kit Qiagen 12163
pX458-DsRed2 Addgene 112219
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 purify plasmid from restriction digestion
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix New England BioLabs M0494S
RAW264.7 ATCC TIB-71 https://www.atcc.org/
Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)] Abcam ab108252 at 1/1000 dilution
RPMI 1640 Medium HyClone SH30027.01
Strep-Tactin Sepharose beads IBA Lifesciences 2-1201-010
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122
SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation ThermoFisher Scientific S34859
T4 DNA ligase New England BioLabs M0202S
T4 Polynucleotide Kinase New England BioLabs M0201S
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red ThermoFisher Scientific 25200056
ZOE Fluorescent Cell Imager Bio-Rad
1.5 mL microtubes, PCR-clean Eppendorf, or similar 0030 125.215
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3524
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates Corning 3599
96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate Corning 3799
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Cronkite, D. A., Strutt, T. M. The Regulation of Inflammation by Innate and Adaptive Lymphocytes. Journal of Immunology Research. 2018, 1467538 (2018).
  2. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Control of adaptive immunity by the innate immune system. Nature Immunology. 16 (4), 343-353 (2015).
  3. Chicaybam, L., et al. An Efficient Electroporation Protocol for the Genetic Modification of Mammalian Cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2016).
  4. Manguso, R. T., et al. In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target. Nature. 547 (7664), 413-418 (2017).
  5. Siggs, O. M. Dissecting mammalian immunity through mutation. Immunology and Cell Biology. 92 (5), 392-399 (2014).
  6. Satija, R., Shalek, A. K. Heterogeneity in immune responses: from populations to single cells. Trends in Immunology. 35 (5), 219-229 (2014).
  7. Shui, B., Hernandez Matias, L., Guo, Y., Peng, Y. The Rise of CRISPR/Cas for Genome Editing in Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 8140168 (2016).
  8. Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168 (1-2), 20-36 (2017).
  9. Seki, A., Rutz, S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 985-997 (2018).
  10. Oh, S. A., Seki, A., Rutz, S. Ribonucleoprotein Transfection for CRISPR/Cas9-Mediated Gene Knockout in Primary T Cells. Current Protocols in Immunology. 124 (1), 69 (2019).
  11. Lee, Y. W., et al. In Vivo Editing of Macrophages through Systemic Delivery of CRISPR-Cas9-Ribonucleoprotein-Nanoparticle Nanoassemblies. Advances in Therapy (Weinh). 2 (10), (2019).
  12. Freund, E. C., et al. Efficient gene knockout in primary human and murine myeloid cells by non-viral delivery of CRISPR-Cas9. Journal of Experimental Medicine. 217 (7), (2020).
  13. Huang, R., et al. The three members of the Vav family proteins form complexes that concur to foam cell formation and atherosclerosis. Journal of Lipid Research. 60 (12), 2006-2019 (2019).
  14. Scharenberg, S. G., et al. Engineering monocyte/macrophage-specific glucocerebrosidase expression in human hematopoietic stem cells using genome editing. Nature Communications. 11 (1), 3327 (2020).
  15. Jacobi, A. M., et al. Simplified CRISPR tools for efficient genome editing and streamlined protocols for their delivery into mammalian cells and mouse zygotes. Methods. 121-122, 16-28 (2017).
  16. Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).
  17. Haupt, A., Grancharova, T., Arakaki, J., Fuqua, M. A., Roberts, B., Gunawardane, R. N. Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9. Journal of Visualized Experiments. (138), (2018).
  18. Li, S., Xue, H., Long, B., Sun, L., Truong, T., Liu, Y. Efficient generation of hiPSC neural lineage specific knockin reporters using the CRISPR/Cas9 and Cas9 double nickase system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52539 (2015).
  19. Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10437-10442 (2015).
  20. Hamilton, J. R., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 and transgenes enables complex immune cell engineering. Cell Reports. 35 (9), 109207 (2021).
  21. Luo, J., et al. Speed genome editing by transient CRISPR/Cas9 targeting and large DNA fragment deletion. Journal of Biotechnology. 281, 11-20 (2018).
  22. Bourgonje, A. R., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), SARS-CoV-2 and the pathophysiology of coronavirus disease. Journal of Pathology. 251 (3), 228-248 (2020).
  23. Schultze, J. L., Aschenbrenner, A. C. COVID-19 and the human innate immune system. Cell. 184 (7), 1671-1692 (2021).
  24. Taefehshokr, N., Taefehshokr, S., Hemmat, N., Heit, B. Covid-19: Perspectives on Innate Immune Evasion. Frontiers in Immunology. 11 (2549), (2020).
  25. Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice. Nature Reviews: Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).
  26. Chandran, S. S., Klebanoff, C. A. T cell receptor-based cancer immunotherapy: Emerging efficacy and pathways of resistance. Immunological Reviews. 290 (1), 127-147 (2019).
  27. Dower, N. A., et al. RasGRP is essential for mouse thymocyte differentiation and TCR signaling. Nature Immunology. 1 (4), 317-321 (2000).
  28. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).
  29. Chu, V. T., et al. Efficient generation of Rosa26 knock-in mice using CRISPR/Cas9 in C57BL/6 zygotes. BMC Biotechnology. 16, 4 (2016).
  30. Irion, S., Luche, H., Gadue, P., Fehling, H. J., Kennedy, M., Keller, G. Identification and targeting of the ROSA26 locus in human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (12), 1477-1482 (2007).
  31. Concordet, J. -. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  32. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  33. Jang, D. E., et al. Multiple sgRNAs with overlapping sequences enhance CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency. Experimental and Molecular Medicine. 50 (4), 1-9 (2018).
  34. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13 (1), 195-215 (2018).
  35. Paix, A., Rasoloson, D., Folkmann, A., Seydoux, G. Rapid Tagging of Human Proteins with Fluorescent Reporters by Genome Engineering using Double-Stranded DNA Donors. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 102 (2019).
  36. Ebert, O., et al. Lymphocyte apoptosis: induction by gene transfer techniques. Gene Therapy. 4 (4), 296-302 (1997).
  37. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. 531, 123-143 (2009).
  38. Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 12514-12519 (2016).
  39. Banan, M. Recent advances in CRISPR/Cas9-mediated knock-ins in mammalian cells. Journal of Biotechnology. 308, 1-9 (2020).
  40. Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Molecular Biology of the Cell. 28 (21), 2854-2874 (2017).
  41. Bukhari, H., Müller, T. Endogenous Fluorescence Tagging by CRISPR. Trends in Cell Biology. 29 (11), 912-928 (2019).
  42. Koch, B., Nijmeijer, B., Kueblbeck, M., Cai, Y., Walther, N., Ellenberg, J. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
  43. Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (4), 301-308 (2004).
  44. Freen-van Heeren, J. J. -., Popović, B., Guislain, A., Wolkers, M. C. Human T cells employ conserved AU-rich elements to fine-tune IFN-γ production. European Journal of Immunology. 50 (7), 949-958 (2020).
  45. Roncagalli, R., et al. The scaffolding function of the RLTPR protein explains its essential role for CD28 co-stimulation in mouse and human T cells. Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2437-2457 (2016).
  46. He, L., et al. ARHGAP45 controls naïve T- and B-cell entry into lymph nodes and T-cell progenitor thymus seeding. EMBO Reports. 22 (4), 52196 (2021).
  47. Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nature Reviews: Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).
  48. Papapetrou, E. P., Gene Schambach, A. Insertion Into Genomic Safe Harbors for Human Gene Therapy. Molecular Therapy. 24 (4), 678-684 (2016).
  49. Wang, X., et al. A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection, in vivo tracking, and ablation of engineered cells. Blood. 118 (5), 1255-1263 (2011).
  50. Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).

Tags

Keywords: CRISPR/Cas9Gene Knock-inMacrophageT Cell LinesROSA26 LocusSgRNA DesignHomologous RecombinationTargeting VectorFluorescent ReporterCell Sorting
check_url/pt/62328?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Zhang, L., Huang, R., Lu, L., Fu, R., Guo, G., Gu, Y., Liu, Z., He, L., Malissen, M., Liang, Y. Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines. J. Vis. Exp. (177), e62328, doi:10.3791/62328 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image