Immuuncellen zijn van cruciaal belang voor de verdediging tegen ziekteverwekkers. Zowel aangeboren als adaptieve immuniteit zijn vereist voor de klaring van infectanten en het behoud van weefselhomeostase^1,2. Cellijnmodellen zijn essentiële hulpmiddelen voor het begrijpen van de moleculaire fundamenten van het immuunsysteem van zoogdieren; ze worden gebruikt in in vitro functionele assays, zoals die welke menselijke T-celactivatie modelleren, en bij het bepalen van de functie van genetische factoren bij het activeren of dempen van immuunresponsen^3,4. Het is belangrijk op te merken dat het immuunsysteem van zoogdieren enorm heterogeen is en, even belangrijk, een groot aantal moleculen de differentiatie, migratie en functie van een bepaald celtype^{regelen 5,6}.

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 genome editing tools maken genetische manipulatie van specifieke celtypen mogelijk, wat functionele annotatie van genen op een precieze manier^{vergemakkelijkt 7,8}. Verschillende gepubliceerde protocollen hebben de levering van CRISPR / Cas9 beschreven in de vorm van Cas9-gids RNA-complexen die bekend staan als ribonucleoproteïnen (RSP’s) in HEK293-cellen, Jurkat-cellijnen, primaire T-cellen^9,10,macrofagen^11,12,13,stamcellen¹⁴en anderen^15,16. In deze protocollen wordt gentagging meestal bereikt door een fluorescerende tag te fuseren met endogene eiwitten^17,18. Er zijn echter weinig pogingen gedaan om dubbele fluorescerende reporters te gebruiken, die compatibel zijn met het sorteren van eencellige cellen, om knock-in experimenten^19,20, met name in immuuncellen te vergemakkelijken.

Diepgaande mechanistische analyses gericht op het begrijpen van de functies van een nieuwe genetische factor in immuuncellen vereisen over het algemeen celtype specifieke deletie van een gen, genetische reddingsexperimenten en idealiter identificatie van de interactoren. Hoewel methoden voor optimalisatie van genetische deletie van genen in immuuncellen zijn gepubliceerd^9,15,21,zijn er veel minder methoden gemeld voor het introduceren van knock-in allelen met veelzijdige functies om de immuunrespons te begrijpen. Daarom willen we in dit protocol in detail een efficiënt en zeer reproduceerbaar protocol beschrijven om een eiwit van belang (POI) tot expressie te brengen op de veiligehaven locus Rosa26 in zowel menselijke als muriene immuuncellijnen. We hebben een tweekleurig reportersysteem ontworpen om te verrijken voor cellen die zijn getransfecteerd met plasmiden die CRISPR / Cas9 (DsRed2) tot expressie brengen en een recombinant DNA-sjabloon (EBFP2), die kan worden geïsoleerd door celsortering. Volgens dit protocol verkregen we meerdere knock-in lijnen van de menselijke T-cellijn Jurkat en murine macrofaag RAW264.7 voor functionele analyses van slecht bestudeerde eiwitten.

Als voorbeeld laten we in dit protocol zien hoe je knock-in RAW264.7 macrofagen kunt verkrijgen die stabiel menselijke ACE2 (een receptor van SARS-Cov-2) tot expressie brengen²². Omdat aangeboren immuuncellen betrokken zijn bij de pathogenese van Covid-19^23,24 en menselijk ACE2 wordt beschouwd als een belangrijke receptor die nodig is voor virale binnenkomst in cellen vóór replicatie, kunnen macrofagen met knock-in van humaan ACE2 dienen als een nuttig hulpmiddel voor mechanistische studies van virale vermenigvuldiging in macrofagen. Tegelijkertijd presenteren we ook een voorbeeld van knock-in van een gen op de menselijke ROSA26-locus om het RASGRP1-eiwit tot expressie te brengen, dat aan zijn amino-eindpunt was gefuseerd met een affiniteit Twin-Strep-tag (OST). T-cellen zijn belangrijke doelcellen in immuuntherapieën en een toenemend aantal studies heeft zich gericht op manipulatie van hun reactievermogen op kanker^25,26. Aangezien Rasgrp1 bekend staat als een belangrijk signaalmolecuul stroomafwaarts van de T-celreceptor en de interactoren niet goed worden opgehelderd²⁷, biedt het OST-RASGRP1 knock-in model de basis voor het identificeren van interactoren die de reactie van T-cellen op tumoren en infecties reguleren. Samen kunnen deze tools worden gebruikt voor Covid-19-studies en de ontdekking van nieuwe moleculen die interageren met Rasgrp1.