Kurzzeit-Hypothermie-Induktion bei Ratten unter Verwendung von Modellen für Studien zur Untersuchung klinischer Relevanz und Mechanismen
Summary
Dieser Artikel beschreibt zwei Methoden der Ganzkörper-Kurzzeit-Hypothermie-Induktion bei Ratten. Die erste, schnelle Induktionsmethode, verwendet eine aktive Kühlung mit Ventilatoren und Ethanolspray für eine schnelle Temperatursenkung. Die zweite Methode ist eine schrittweise Abkühlungsmethode. Dies wird durch die Kombination von Isoflurananästhesie und der Reduzierung der Temperatureinstellungen auf der homöothermischen Wärmematte erreicht. Dies führt zu einer allmählichen Abnahme der Körperkerntemperatur ohne den Einsatz externer Kühlgeräte.
Abstract
Therapeutische Hypothermie (TH) ist eine leistungsstarke neuroprotektive Strategie, die in präklinischen Studien zu neurologischen Erkrankungen robuste Beweise für die Neuroprotektion erbracht hat. Trotz starker präklinischer Evidenz hat TH in klinischen Studien zu den meisten neurologischen Erkrankungen keine Wirksamkeit gezeigt. Die einzigen erfolgreichen Studien mit therapeutischer Hypothermie betrafen Herzstillstand bei Erwachsenen und hypoxische ischämische Verletzungen bei Neugeborenen. Weitere Untersuchungen der Anwendungsparameter und Studiendesignvergleiche zwischen präklinischen und klinischen Studien sind gerechtfertigt. Dieser Artikel zeigt zwei Methoden der kurzzeitigen Hypothermie-Induktion. Die erste Methode ermöglicht eine schnelle Hypothermie-Induktion bei Ratten mit Ethanolspray und Ventilatoren. Diese Methode funktioniert durch Kühlung der Haut, die in klinischen Studien weniger häufig verwendet wurde und unterschiedliche physiologische Wirkungen haben kann. Die Abkühlung ist mit dieser Technik viel schneller, als dies bei menschlichen Patienten aufgrund von Unterschieden im Verhältnis von Oberfläche zu Volumen möglich ist. Darüber hinaus wird eine zweite Methode vorgestellt, die eine klinisch erreichbare Abkühlrate bei kurzzeitiger Hypothermie ermöglicht. Diese Methode ist einfach zu implementieren, reproduzierbar und erfordert keine aktive Hautkühlung.
Introduction
TH ist die Praxis der Kühlung der Körper- oder Gehirntemperatur, um die Lebensfähigkeit und Funktion des Organs / Systems zu erhalten1,2. Die Rolle der Hypothermie bei der Neuroprotektion wurde untersucht und hat Vorteile in einer Reihe von präklinischen Modellen neurologischer Erkrankungen wie Schlaganfall3, Subarachnoidalblutung4und traumatischer Hirnverletzung5gezeigt . In Bezug auf klinische Anwendungen hat TH Wirksamkeit bei Patienten nach Herzstillstand und bei neonatalen hypoxisch-ischämischen Verletzungen gezeigt6.
Die TH-Induktion wird entweder mit oberflächen- oder endovaskulären Kühlmethoden erreicht. Die meisten präklinischen Hypothermiestudien führen eine Oberflächenkühlung durch Auftragen von Wasser oder Ethanol auf das Fell des Tieres oder durch Verwenden einer Kühldecke durch, um die Zieltemperatur zu erreichen1. Beim Menschen wird die systemische Oberflächenkühlung durch den Einsatz von Eisbeuteln und Kühldecken7,8erreicht. Eine schnellere Abkühlung wurde bei Patienten mit endovaskulären Methoden gezeigt, die eine Induktionsinfusion von kalter Kochsalzlösung durch einen intravenösen oder intraarteriellen Katheter mit der Platzierung eines endovaskulären Kühlgeräts in der unteren Hohlvene9,10 koppeln. Beispielsweise kann eine moderate Zieltemperatur von 33 °C in 1,5 h mit endovaskulärer Kühlung erreicht werden, verglichen mit 3-4 h mit Oberflächenkühlung bei Patienten11. Der endovaskuläre Ansatz ist in den letzten Jahren auch populärer geworden, da berichtet wurde, dass er einige der Nebenwirkungen reduziert, die bei der systemischen Oberflächenkühlung beobachtet werden, wie z. B. Zittern12,13. Die europäische multizentrische, randomisierte klinische Phase-III-Studie zur Hypothermie bei ischämischem Schlaganfall (EUROHYP-1) verwendete hauptsächlich Oberflächenkühlung14. Die kürzlich veröffentlichten Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass Zittern eine große Komplikation war und die Fähigkeit, die Zieltemperatur zu erreichen, eingeschränkt haben könnte10. Es ist bekannt, dass die Schüttelreaktion in erster Linie von der Hauttemperatur angetrieben wird. Es wurden einige Anstrengungen unternommen, um eine endovaskuläre Kühlmethode für Nagetiere zu entwickeln15, aber die sehr invasive Natur der Technik im Vergleich zu der beim Menschen verwendeten könnte die Ergebnisse dieses Modells verwirren.
Die Temperatur ist der Schlüsselmodulator biologischer Prozesse im Körper und wird durch die Homöostase streng reguliert. Daher kann jede Manipulation der Körpertemperatur mit Risiken verbunden sein. Die Abkühldauer ist ein Faktor, der den Erfolg klinischer Hypothermie-Studien eingeschränkt haben könnte. Diese Studien verwenden eine Langzeitkühlmethode, wobei viele die Hypothermie von 24-72 h11 aufrechterhalten. Diese verlängerte Dauer stellt ein Infektionsrisiko während des Kühlprotokolls dar. Lungenentzündung ist die häufigste Komplikation durch Hypothermie und betrifft zwischen 40-50% der Patienten, die sich dem Eingriffunterziehen 13. Dies steht im Gegensatz zu dem, was normalerweise in Tierstudien zur Hypothermie beobachtet wird, wo ein Kurzzeitparadigma verwendet wird (1-6 h)3. Der Erfolg dieser präklinischen Tierversuche wird wahrscheinlich zur Anpassung der Kurzzeithypothermie für den Einsatz in klinischen Studien führen. Infolgedessen ist es notwendig, ein Tiermodell für kurzzeitige Hypothermie zu haben, das den Abkühlraten zukünftiger klinischer Studien ähnelt. Weitere Details zu anderen Temperaturparametern und zur Gültigkeit der kurzzeitigen Hypothermie wurden in mehreren Übersichtsartikeln1,16,17,18diskutiert.
Demonstriert wird hier ein allmähliches Modell der Abkühlung, das klinisch besser erreichbar ist als aktuelle experimentelle Hypothermiemodelle. Diese neuartige Methode hat eine viel langsamere Abkühlungsrate und daher liegt die Zeit bis zur Zieltemperatur näher an dem Bereich, der in klinischen Studien mit Hypothermie beobachtet wurde11. Es vermeidet auch die direkte Oberflächenkühlung, die spezifische physiologische Wirkungen hat, und kann daher eher mit der endovaskulären Kühlung vergleichbar sein, die in klinischen Studien die am häufigsten verwendete Kühlmethode war9,12. Dieses Modell ermöglicht es, die Tiere schrittweise über 2 h zu kühlen, gefolgt von einer kurzen Wartungszeit bei Zieltemperatur. Zusätzlich wird die schnell abkühlende Kurzzeit-Hypothermie-Methode19 demonstriert. Die Schnellkühlmethode ermöglicht es, die Zieltemperatur nach Beginn der Hypothermie schnell zu erreichen. Obwohl dieser Ansatz nicht so klinisch relevant ist wie die schrittweise Kühlmethode, ist er nützlich für Studien, die darauf abzielen, die Mechanismen der Hypothermie-Neuroprotektion zu untersuchen, um möglicherweise ihre starken neuroprotektiven Wirkungen pharmakologisch nachzuahmen. Diese Methode hat auch potenzielle Anwendungen außerhalb der Neurowissenschaften und könnte an eine beliebige Anzahl von präklinischen Studien angepasst werden. Ein weiterer Vorteil beider Methoden gegenüber anderen Ansätzen ist, dass sie kostengünstig sind und keine spezielle Ausrüstung erfordern. Schließlich zeigt dieses Protokoll auch die Implantation von Temperaturdatenloggern, da die postoperative Erwärmung und deren Überwachung wichtig sind, um eine versehentliche postoperative Hypothermie mit ihrem Potenzial zu verhindern, die Studienergebnisse zu verwirren20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebenen Verfahren sind einfach zu implementieren, nicht-invasiv und sorgen für eine zuverlässige und reproduzierbare Senkung der Körperkerntemperatur auf eine gewünschte Zieltemperatur.
Es gibt mehrere kritische Schritte in der schnellen Kühlmethode, darunter die folgenden. Übersättigen Sie ethanol spray nicht – es muss darauf geachtet werden, das Tier nicht in Ethanol einzuweichen, da dies die Ergebnisse beeinträchtigt. Überwachen Sie das Tier während der Hypothermie-Induktion – Es muss darauf geachtet werden, die Reaktionen der Tiere auf eine schnelle Hypothermie-Induktion genau zu überwachen. Eine genaue Überwachung der Rektaltemperatur ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Temperatur nicht unter das gewünschte Ziel fällt – in diesem Fall schalten Sie die Ventilatoren aus und lassen Sie die Wärmelampe das Tier sanft wieder auf das gewünschte Ziel zurückerwärmen.
Bei beiden Methoden ist eine physiologische Überwachung wichtig, um eine angemessene Anpassung der Anästhesiedosis zu gewährleisten. Bei längerer Abkühlung kann eine unzureichende Anästhesiedosis die Abkühldauer verlängern. In diesem Fall kann die Isoflurankonzentration erhöht werden, bis eine ausreichende Abkühlrate erreicht ist. Ein weiterer kritischer Schritt ist die Kreuzkalibrierung von Temperaturgeräten. Wenn Sie eine Temperaturfühler-geregelte Wärmematte und einen Datenlogger im selben Experiment verwenden, ist es am besten, den Datenlogger mit der Rektalsonde in vivo zu kalibrieren, da es zu geringfügigen Schwankungen der aufgezeichneten Temperatur der beiden Geräte kommt.
Diese Methoden eignen sich für Studien, die den Einsatz von Hypothermie als mögliche Behandlung neurologischer Erkrankungen untersuchen möchten. Das spezifische Ziel der Studie sollte bestimmen, welche Methode verwendet wird. Beide Methoden können als systemische Oberflächenkühlung eingestuft werden, die zweite Methode erfordert jedoch keine aktive Kühlung. Das oben beschriebene modell der allmählichen Abkühlung hat wichtige potenzielle Anwendungen für den Einsatz von Hypothermie in der ischämischen Schlaganfallbehandlung. Langzeithypothermie und die daraus resultierenden Komplikationen stellen eine Herausforderung für ältere Schlaganfallpatienten dar. Darüber hinaus erschwert die Schüttelreaktion bei einigen Patienten das Erreichen der Zieltemperatur10. Während Anti-Zittern-Medikamente helfen können, die Schüttelreaktion zu reduzieren, könnte eine kurzzeitige allmähliche Kühlung das Problem effektiver lindern. Eine kürzere Abkühlzeit reduziert wahrscheinlich auch die Inzidenz von Lungenentzündungen, die häufig in Studien berichtet werden. Ein weiterer potenzieller Vorteil dieser Kurzzeitmethode besteht darin, dass die Geschwindigkeit der Wiedererwarmung im Vergleich zur Langzeitkühlung möglicherweise nicht so wichtig ist. Sehr frühe klinische Studien zur Langzeitkühlung bei Schlaganfallpatienten mit großen Infarkten ergaben, dass eine schnelle Wiedererwarmung zu großen Erhöhungen des intrakraniellen Drucks (ICP) führte, was das Ergebnis verschlechterte und oft tödlich war. Dies führte zur Entwicklung von paradigmen der allmählichen Wiedererwärmung, die die Gesamtdauer der Abkühlung weiter verlängerten. Die Kurzzeitkühlung hält die Zieltemperatur nur für einen kurzen Zeitraum aufrecht und kann weniger wahrscheinlich zu einem Rückprall-ICP führen. Frühere Arbeiten, die die Hypothermiebehandlung für die ICP-Erhöhung unter Verwendung eines ähnlichen schnellen Kühl- und Wiederwarmungsprotokolls wie die hier beschriebenen untersucht haben, haben nach der Erneuterärmung keine Rebound-ICP-Erhöhung gezeigt23,24.
Klinische Studien zur Hypothermie zur Behandlung ischämischer Schlaganfälle konnten die in experimentellen Studien berichteten Vorteile der Hypothermie nicht übersetzen. Die Diskrepanz in Abkühlraten und -dauer zwischen experimentellen Modellen und Patienten sind wichtige Variablen, die diese Diskrepanz erklären können. Ein experimentelles Modell der Hypothermie, das der klinischen Abkühlungsrate besser ähnelt, ermöglicht eine fundiertere Untersuchung der Vorteile der Hypothermie als Behandlungsmaßnahme für Schlaganfallpatienten.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Projekt wurde von der University of Newcastle, dem Hunter Medical Research Institute (HMRI) Dalara Early Research Career Researcher Fellowship, dem NSW Health Early-Mid Career Research Fellowship und dem National Health and Medical Research Council (NHMRC) Australia finanziert.
Materials
| Absolute ethanol | ThermoFisher Scientific/ Ajax Finechem | AJA214-20LPL | Diluted with deionized water to give 70 % ethanol |
| Antiseptic solution (Chlorhexidine) | David Craig | A2957 | |
| Anaesthetic (Marcain) | Aspen | PS13977 | |
| Brushless fan motor | Sirocco | YX2505 | 2 x 12 V/130 mA |
| Heat lamp | Reptile One | AC220 | 240 V 50/60 Hz |
| Heat pad | FHC, Inc | 40-90-2 | |
| Rectal probe | FHC, Inc | 40-90-5D-02 | |
| Temperature controller | FHC, Inc | 40-90-8D | |
| Temperature Datalogger | Maxim | DS1922L-F5 |
Referências
- Kurisu, K., Yenari, M. A. Therapeutic hypothermia for ischemic stroke; pathophysiology and future promise. Neuropharmacology. 134, 302-309 (2018).
- Polderman, K. H. Induced hypothermia and fever control for prevention and treatment of neurological injuries. Lancet. 371 (9628), 1955-1969 (2008).
- vander Worp, H. B., Sena, E. S., Donnan, G. A., Howells, D. W., Macleod, M. R. Hypothermia in animal models of acute ischaemic stroke: a systematic review and meta-analysis. Brain. 130, 3063-3074 (2007).
- Thomé, C., Schubert, G. A., Schilling, L. Hypothermia as a neuroprotective strategy in subarachnoid hemorrhage: a pathophysiological review focusing on the acute phase. Neurological Research. 27 (3), 229-237 (2005).
- McIntyre, L. A., Fergusson, D. A., Hébert, P. C., Moher, D., Hutchison, J. S. Prolonged therapeutic hypothermia after traumatic brain injury in adults: a systematic review. Journal of the American Medical Association. 289 (22), 2992-2999 (2003).
- Kuczynski, A. M., Demchuk, A. M., Almekhlafi, M. A. Therapeutic hypothermia: Applications in adults with acute ischemic stroke. Brain Circulation. 5 (2), 43-54 (2019).
- Shankaran, S., et al. Whole-body hypothermia for neonates with hypoxic-ischemic encephalopathy. New England Journal of Medicine. 353 (15), 1574-1584 (2005).
- Jacobs, S. E., et al. Whole-body hypothermia for term and near-term newborns with hypoxic-ischemic encephalopathy: a randomized controlled trial. Archives of Pediatrics and Adolescent Medicine. 165 (8), 692-700 (2011).
- Lyden, P., et al. Results of the ICTuS 2 Trial (Intravascular cooling in the treatment of stroke 2). Stroke. 47 (12), 2888-2895 (2016).
- vander Worp, H. B., et al. Therapeutic hypothermia for acute ischaemic stroke. Results of a European multicentre, randomised, phase III clinical trial. European Stroke Journal. 4 (3), 254-262 (2019).
- Wu, T. C., Grotta, J. C. Hypothermia for acute ischaemic stroke. Lancet Neurology. 12 (3), 275-284 (2013).
- Hemmen, T. M., et al. Intravenous thrombolysis plus hypothermia for acute treatment of ischemic stroke (ICTuS-L): final results. Stroke. 41 (10), 2265-2270 (2010).
- Lyden, P., Ernstrom, K., Raman, R. Determinants of pneumonia risk during endovascular hypothermia. Therapeutic Hypothermia and Temperature Management. 3 (1), 24-27 (2013).
- vander Worp, H. B., et al. EuroHYP-1: European multicenter, randomized, phase III clinical trial of therapeutic hypothermia plus best medical treatment vs. best medical treatment alone for acute ischemic stroke. International Journal of Stroke. 9 (5), 642-645 (2014).
- Lamb, J. A., Rajput, P. S., Lyden, P. D. Novel method for inducing rapid, controllable therapeutic hypothermia in rats using a perivascular implanted closed-loop cooling circuit. Journal of Neuroscience Methods. 267, 55-61 (2016).
- Dumitrascu, O. M., Lamb, J., Lyden, P. D. Still cooling after all these years: Meta-analysis od pre-clinical trials of therapeutic hypothermia for acute ischemic stroke. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (7), 1157-1164 (2016).
- Wu, L., et al. Hypothermia neuroprotection against ischemic stroke: The 2019 update. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 40 (3), 461-481 (2020).
- Hemmen, T. M., Lyden, P. D. Hypothermia after acute ischemic stroke. Journal of Neurotrauma. 26 (3), 387-391 (2009).
- Colbourne, F., Sutherland, G. R., Auer, R. N. An automated system for regulating brain temperature in awake and freely moving rodents. Journal of Neuroscience Methods. 67 (2), 185-190 (1996).
- Campbell, K., Meloni, B. P., Zhu, H., Knuckey, N. W. Magnesium treatment and spontaneous mild hypothermia after transient focal cerebral ischemia in the rat. Brain Research Bulletin. 77 (5), 320-322 (2008).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. Journal of Visualized Experiments. (59), e3496 (2012).
- Trotman-Lucas, M., Kelly, M. E., Janus, J., Gibson, C. L. Middle cerebral artery occlusion allowing reperfusion via common carotid artery repair in mice. Journal of Visualized Experiments. (143), e58191 (2019).
- Murtha, L. A., et al. Short-duration hypothermia after ischemic stroke prevents delayed intracranial pressure rise. International Journal of Stroke. 9, 553-559 (2014).
- Murtha, L. A., et al. Intracranial pressure elevation after ischemic stroke in rats: cerebral edema is not the only cause, and short-duration mild hypothermia is a highly effective preventative therapy. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 35 (4), 592-600 (2015).
