צינור הכנה לדוגמה עבור מיקרוקריסטלים בקו הקרן VMXm

1. התקנת ציוד הערה: השיטות המתוארות כאן משתמשות בכלי הקפאה צולל עם זרוע סופגת אחת. מכשירים מסוימים מצוידים בשתי זרועות סופגות ואנו ממליצים למשתמש לבדוק את הוראות היצרנים להתאים את המכשיר כך שרק זרוע סופגת אחת נמצאת בשימוש. ודא כי מיקרוסקופ אור ממוקם ליד מכשיר הקפאת הצלילה, באופן אידיאלי, כך הן המיקרוסקופ ומקפיא לצלול נמצאים בהישג יד של המשתמש. יש להגדיר ולקרר את מקפיא הצלילה האוטומטי בהתאם להוראות היצרנים.הערה: טמפרטורת תא המדגם צריכה להיות מוגדרת לטמפרטורה שבה הגבישים גדלו. אין להניח נייר סופג בתא הדגימה.זהירות: אתאן נוזלי הוא חומר נפץ דליק מאוד ויש להשתמש בו רק באזור מאוורר היטב הרחק ממקורות ניצוץ פוטנציאליים. תוויות של תיבות רשת כראוי ומצננים אותן בנימה קטנה באמצעות חנקן נוזלי. הניחו בזהירות רשתות, צד סרט פחמן למעלה, על נושא מתאים לפירוק זוהר (כגון שקופית מיקרוסקופ זכוכית עטופה בפרפילם). רשתות CryoTEM פריקה זוהרת עבור 25 s ב 0.39 mBar, באמצעות זרם של 15 mA. פריקה זוהרת ממש לפני הרשתות ישמשו. שומרים את הרשתות המשוחררות הזוהרות בצלחת פטרי מכוסה עד שהם מוכנים; אם 30 דקות פג לאחר פריקת זוהר, חזור על זוהר פריקת.הערה: עם מקפיא הצלילה מוכן ורשתות מוכנות, תשומת הלב יכולה לפנות לדגימה. 2. קביעת פרמטרי חבטה ראשוניים הגדר את הלחות היחסית של תא המדגם ל -90% ואת זמן הכתם ל 5 s ולוודא כי מקפיא הצלילה מוגדר לצלול באופן אוטומטי את המדגם לאחר סופג הושלמה.הערה: פרמטרים התחלתיים אלה מתאימים ביותר למקפיא הצלילה של Leica GP, פרמטרים אחרים כגון כוח סופג זמינים ב- FEI Vitrobot. עם זאת, מניסיוננו שלמות הגביש סביר יותר להישמר על ידי שימוש בזרוע סופגת אחת. כדי להיות מסוגל לאטום את מגש ההתגבשות ברגע שהבאר של עניין נפתחת, לחתוך רצועה קטנה של סרט הדבקה לקפל מעל קצה אחד כדי ליצור כרטיסייה כדי להקל על פתיחת החותם ומניחים בזהירות לצד אחד. חותכים את החותם מעל הבאר המתגבשת, כולל המאגר. עבודה מהירה, להחיל 2-5 μL של פתרון מאגר על הגביש המכיל טיפה כדי לשמור על נפח נוזלי בירידה. השתמש בכרטיסייה של סרט הדבקה כדי לאתם מחדש את הבאר ולוודא שטיפה ההתגבשות לא תתייבש. בעוד לרגע מחזיק את הקלטת פתוחה מעל ההתגבשות היטב, להעביר 10 μL של פתרון המאגר לצינור 0.5 מ”ל לשימוש לשלבים מאוחרים יותר. תאחד מחדש את הבאר. מניחים פיסת נייר סופגת חתוכה מראש על זרוע הכתמים של מכשיר ההקפאה. מניחים רשת זוהרת אחת במלקחיים הקפואים של הצלילה ונטענים לתוך המכשיר כך שצד הפחמן פונה הרחק מזרוע הכתם. ודא שהלחות היחסית בתוך תא הכתמים עומדת על 90%. סובבו את המלקחיים כך שצד סרט הפחמן יפונה לזרוע הנפוחה. באמצעות פיפטה 2.5 μL, להחיל 2 μL של פתרון מאגר מצינור 0.5 מ”ל לצד שאינו תמיכה (נחושת מבריקה) של רשת cryoTEM. סובב את הרשת כך שצד התמיכה בפחמן יפנה הרחק מזרוע הכתם וחזור על התהליך, תוך החלה קפדנית של הנוזל על צד התמיכה בסרט הפחמן של הרשת. הימנעו מלגעת בסרט הפחמן עם קצה הפיפטה כדי לא לפגוע בסרט הפחמן. הנוזל צריך להתפשט על פני הרשת בשל החיוב שהופקד במהלך פריקת זוהר. הפעל את תהליך הכתם תוך התבוננות ברשת. טווח צפייה זמין ב- Leica GP2 למטרה זו. שים לב אם הנוזל נמשך מפני השטח הפחמנים של הרשת בתקופה זו, זה מתחיל עם רוב בולוס נוזלי על הרשת משטח החוצה כמו הנוזל הוא מרושע דרך הרשת. כמו הנוזל בכל ריבוע רשת מצטמצם עוד יותר, גל של “popping” על פני השטח של הרשת ניתן לראות. אם אפקט זה נצפה, סופג ניתן לעצור בתוך 2-3 s של סיום אפקט popping. אין צורך לצלול את רשת הבדיקה אשר ניתן להשליך. אם לא נצפה אפקט “popping” כביכול, חזור על שלבים 2.11-2.14, בכל פעם הארכת זמן הכתם ב- 1-2 s עד שאפקט הקפיצה נצפה ממש לפני שזרוע הכתם נסוגה מהרשת. שים לב הפעם לשלב 3.הערה: חשוב כי סופג מפסיק ברגע אפקט פיצוץ זה התרחש כדי להבטיח כי במהלך התהליך, גבישים לא להתייבש מ סופג יתר. השתמש בתמיסת התגבשות מהמאגר לכתם אחורי ודילול המדגם, שכן הוא מבטיח כי הגבישים כפופים לפתרון עקבי, מה שמפחית את הסיכון לערער את הקריסטלים. 3. קצירת גבישים מניחים את לוח ההתגבשות מתחת למיקרוסקופ האור וממקם היטב את המטרה בתוך שדה הראייה. מניחים רשת פריקה רעננה וזוהרת במלקחי המקפיא של הצלילה ומרכיבים את המלקחיים במקפיא הצלילה, כשצד סרט הפחמן פונה הרחק מזרוע הכתם. סובבו את המלקחיים כך שצד סרט הפחמן יפונה לזרוע הנפוחה. באמצעות פיפטה 2.5 μL, להחיל 2 μL של פתרון מאגר מצינור 0.5 מ”ל לצד שאינו תומך של רשת cryoTEM ולסובב את הרשת כך צד התמיכה סרט פחמן פונה היציאה לדוגמה של מקפיא הצלילה. לקלף בחזרה את החותם הזמני עם pipette להגדיר 2 μL, בעדינות לשאוף את טיפת התגבשות שוב ושוב כדי להשעות את microcrystals (חשוב לא להציג בועות אוויר לטיפה).הערה: חשוב להתבונן בתהליך זה תחת מיקרוסקופ האור כדי להבטיח כי גבישים משתחררים מכל עור פני השטח או הבסיס של הבאר. אם הגבישים תקועים ולא נמשכים עם שאיפה, או קצה פיפטה או כלי התגבשות אחרים כגון מחט דיקור סיני, ניתן להשתמש כדי להפיץ בעדינות את הגבישים. בהתאם לגודל הגבישים ועומק השדה של מיקרוסקופ האור, לפעמים ניתן לראות, באמצעות המיקרוסקופ, את הגבישים הנכנסים לקצה הפיפטה. מעבירים 2 מיקרו-אל של תרחיף מיקרוקריסטלי שאפתני למקפיא הצלילה ומחילים את כל הדגימה על צד הפחמן של רשת cryoTEM. כתם לזמן שנקבע בשלב 2 ומיד ליזום צלילה הקפאה. בעת הכתם, התבונן בהתרחשות של אפקט גל פיצוץ על-פני הרשת ושים לב אם זה קרה לחלוטין על-פני הרשת. נוכחות של גבישים יכולה להשפיע על זמן הכתם הראשוני, וייתכן שיהיה צורך להתאים את זה לרשתות הבאות על ידי 1-2 s. עבודה מהירה, להעביר את הרשת מן האתאן הנוזלי לתיבת הרשת שקוע חנקן נוזלי. שאריות אתאן יכול להפוך מוצק לבן אטום על הרשת כאשר הוא נכנס חנקן נוזלי. כדי להפחית זאת, להסיר את הרשת בהתמדה מן האתאן הנוזלי, ולאחר מכן להעביר במהירות למאגר חנקן נוזלי. לאחר 4 רשתות הונחו בתיבת הרשת, לאבטח את המכסה של התיבה עם הבורג ולהעביר אותו או dewar קצף של חנקן נוזלי כדי לאפשר הערכה מדגמית נוספת עם מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM) או dewar אחסון חנקן נוזלי באמצעות מיכל אחסון מתאים. 4. הערכת צפיפות דגימה על ידי מיקרוסקופיה קלה זהירות: שיטה זו הרסנית. אם יש זמינות מוגבלת של מדגם, כגון טיפת התגבשות אחת או שתיים בלבד, מומלץ לדלג על שלב זה. לאחר צלילה הקפאת דגימות (שלב 3.7) ניתן להעריך את התפלגות הגבישים על פני הרשת. הר רשת cryoTEM יבשה בטמפרטורת החדר במלקחיים של מקפיא הצלילה והנח את המלקחיים בצד שלהם על מיקרוסקופ האור, עם הרשת בשדה הראייה. הגדר הגדלה ומיקוד מתאימים כך שניתן יהיה לפתור את כל הרשת ואת ריבועי הרשת הבודדים. בצע את השלבים 3.1-3.7. במקום להעביר את הרשת לתיבת הרשת (שלב 3.8), יש לסגת מהרשת הצוללת מהאתאן הנוזלי על ידי איפוס המקפיא.זהירות: הרשת והדגימה יתחממו לטמפרטורת החדר ולא ניתן יהיה להשתמש בהם לניסויי עקיפה נוספים. הסר את המלקחיים מכלי ההקפאה של הצלילה. תוך החזקת הרשת בתוך המלקחיים, הנח את הרשת מתחת למיקרוסקופ האור – המוקד כבר יוגדר בערך. בצע מיקוד עדין ולהעריך את צפיפות הגבישים על פני הרשת. רשת טובה תכיל כמה גבישים מבודדים הרחק מסורגי הרשת בתוך כל ריבוע רשת וגוש גבישים הוא מינימלי. כאשר צפיפות הגבישים בתוך הרשת גורמת לגוש גבישים עם מעט גבישים מבודדים בלבד, מדללים עוד יותר את שומן הגביש עם תמיסת המאגר וחוזרים על שלב 3. יש לדאוג בעת דילול דגימות, כך דילול לא לגרום לפירוק של הגבישים. לדלל את הגבישים בשלבים באמצעות נפחים קטנים של 0.5-1 μL. 5. הערכה לדוגמה על ידי סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים הערה: הכנה Microcrystal על רשתות cryoTEM מוערך בצורה הטובה ביותר עם מיקרוסקופיה אלקטרונית סריקה (SEM) בתנאים קריוגניים, זה יכול להיות מושגת עם SEM מצויד עם שלב הקפאה. ב- VMXm, נעשה שימוש ב- JEOL JSM-IT100 SEM (מקור טונגסטן) עם מנעל אוויר PP3006 של Quorum והקפאה. כדי להבטיח נזק קרינה מינימלי בעת הצגת דגימות על VMXm28,29, ההגדרות הבאות משמשות: 5 kV האצת מתח; גודל ספוט של 40 (יחידות שרירותיות על JEOL JSM-IT100); מרחק עבודה של 10 מ”מ. תמונות נרשמות באמצעות גלאי האלקטרונים המשני, ליישור מדגם ומיקוד זמן השתהות של 0.8 מיקרו μs משמש בעוד תמונות ברזולוציה גבוהה של גבישים בודדים נלכדים באמצעות זמן התעכבות של 16 μs. חשוב לפני טעינת דגימה לתוך SEM כי המיקרוסקופ מיושר לפי הוראות היצרן. מומלץ כי רק רשת אחת נטענת לתוך SEM בעוד כל הרשתות הנותרות מוכן עם אותם פרמטרים שמורים לניסויי עקיפה רנטגן. הכן את ה- SEM על-ידי קירור שלב ההקפאה לדוגמה ל- -180 °C בהתאם להוראת היצרן. בצע את ההוראות לטעינת רשתות cryoTEM למערכת הספציפית הזמינה. כאשר המדגם נטען ב- SEM, הפעל את קרן האלקטרונים, ישר מדגם והגדר את המוקד באמצעות הגדלה גבוהה (זמן השתהות של 0.8 מיקרו- μs). ראשית, בצע את ההערכה הראשונית עם כל הרשת בתצוגה בהגדלה נמוכה (x45). הקלט תמונה בהגדלה זו. הגדל את ההגדלה כדי לאפשר בדיקה מדוקדקת יותר של ריבועי רשת בודדים, גבישים בודדים צריכים להיות מאוד ברורים לצפייה. נוע סביב הרשת, לכידת תמונות סטילס (16 μs זמן השתהות) של גבישים להבטיח שהם עומדים בדרישות הבאות לפני שתמשיך: ודא שהרשתות שטוחות, וסרט התמיכה בפחמן שלם ברובו. ודא כי ישנם גבישים בודדים רבים עם הילה צרה של נוזל מנווט סביב הגביש. ודא כי החורים בסרט תמיכה בפחמן נראים לעין. ודא כי אין אזורים גדולים של נוזל מנוזל כפי שהוגדר על ידי מראה כהה וחלק. ודא שיש מעט קרח משושה, אם אין, או קרח פני השטח מפוזרים על פני הרשת. ודא כי גבישים מופצים באופן שווה על פני סרט התמיכה ואינם חופפים. בשלב זה, למדוד במדויק את הממדים של מספר גבישים כדי לאפשר מתאם מדויק בגודל קרן רנטגן במהלך ניסויי עקיפה מאוחרים יותר. דגימות שניתן לאחזר באופן אמין מן SEM ולשמור בטמפרטורות קריוגניות ניתן להשתמש מאוחר יותר לניסויי עקיפה רנטגן. אם זה לא אפשרי, להיפטר דגימות אלה.הערה: בעוד הדמיה הן את הרשת כולה והן מיקרו-קריסטלים בודדים (הגדלה של x45 ו- x700 בהתאמה), יש לבצע הערכה אם להמשיך לקו הקורה עם רשתות שהוכנו באמצעות אותם פרמטרים או אם ייתכן שיהיה צורך בהסתגלות במהלך שלב 3. הרשתות צריכות לעמוד במבחנים המתוארים בשלב 5.5. אם הרשתות אינן עומדות בקריטריונים אלה, נדרש מיטוב נוסף במהלך שלב 3 לפני חזרה על שלב 5. 6. הכנת רשת לניסויי עקיפה ב- VMXm קרר את המספר הנדרש של מחזיקי מדגם VMXm (איור 4A)(עד 5) טעון לתוך מחסנית המדגם (עם מכסה) עם מטעין מדגם dewar קצף גדול (איור 4B) באמצעות חנקן נוזלי – זה יכול לדרוש נפח גדול של חנקן נוזלי. רמת החנקן הנוזלי צריכה להיות ממש מעל מיקום המדגם על מטעין המדגם. הכן צירפים וכלים. מקם כלים כולל כלי חיתוך, מלקחיים ומלקחיים מדגם VMXm, לתוך חורים בטוען הדגימה כדי להתקרר. זה יכול להיות שימושי כדי לארגן זרקור מעל dewar. העבר במהירות את תיבת הרשת המכילה את הרשתות הטעונות microcrystal לתיבת הרשת ההפסקה על מטעין המדגם ולפתוח את המכסה כך שהוא רופף וניתן לסיבוב (אל תסיר). תחת חנקן נוזלי להסיר את המכסה מן המחסנית מדגם עם מלקחיים גדולים ומניחים אותו מתחת מטעין המדגם. השתמש במלקחיים מדגם VMXm כדי להרים את מחזיק המדגם על מטעין המדגם, להבטיח כי המחזיק פונה כלפי מעלה, כך שהוא יכול לקבל רשת. כאשר במצב הנכון, סיכה קטנה על מטעין המדגם תיצור אינטראקציה עם החור הקטן באמצע מחזיק המדגם. עם המלקחיים הדקים המקוררים, הרימו בזהירות את הרשת מתיבת הרשת והעבירו קרוב לפתיחת הרשת על מחזיק המדגם. סובב את הרשת כך שהיא תשכב שטוחה (זה לא משנה לאיזה כיוון צד סרט התמיכה פונה). הוריד בעדינות את המלקחיים כך שהרשת תהיה קרובה ככל האפשר מעל פתח הרשת (היזהר לא לכופף את הרשת) ולשחרר את הרשת לתוך הפתח. אם הרשת אינה יושבת כראוי, השתמש בזהירות במלקחיים העדינים כדי לדחוף את הרשת למיקום או להקיש בעדינות על מחזיק הדגימה עם המלקחיים הגדולים יותר. הנח במהירות את כלי הצירליפ מקורר מראש על הרשת בפתיחת הרשת והשב את הצירק על-ידי לחיצה על הכפתור. זה יכול להיות מועיל ליישם 2 שקעים של הכפתור כדי להבטיח את circlip יושב כראוי. למעלה את החנקן הנוזלי כך שהרמה היא ~ 1.5 ס”מ מעל מחזיק המדגם. באמצעות מלקחיים מדגם VMXm, הרם בזהירות את מחזיק המדגם הטעון למעלה ומעל הסיכה הקטנה על מטעין המדגם ובחזרה למחסנית הדגימה. שים לב למספר המיקום של בעל המדגם במחסנית לדוגמה. המשך לטעון רשתות למחזיקי הדגימה עד שכל הדגימות ייטענו. החזר את תיבות הרשת לפירוק גודל האחסון אם הדגימות נשארות בפנים והסר את מטעין הדגימה מההפיכת ההקלה כדי ליצור שטח נוסף. החלף את מכסה המחסנית על המחסנית, והבטח שהסיכה בחלק העליון של המחסנית תתנגש עם החור במכסה. מצננים וממלאים את מנעל האוויר VMXm עם חנקן נוזלי ומניחים ליד קצף dewar המכיל את מחסנית מדגם טעון. באמצעות כלי מחסנית VMXm, בזהירות לעסוק בכלי ברכסים בצד של המחסנית במהירות להרים את המחסנית לתוך dewar מנעל האוויר. ודא כי רמת החנקן הנוזלי מכסה את המחסנית. הנח את המכסה על dewar מנעל האוויר והמשיך לתחנת הקצה VMXm עם מחסנית הדגימה שנטענה.הערה: טעינת מחסנית הדגימה לתחנת הקצה VMXm תבוצע על-ידי צוות קו הקרן.