3次元オルガノイドおよびスフェロイドモデルの染色および高解像度イメージング

注:以下の手順の試薬交換と洗浄を含むステップでは、3D構造の初期数の≤25%の損失が予想されます。定性的および定量的な画像分析を実行するために、テストされた条件ごとに、100〜500μmの範囲のサイズの少なくとも10個の3D構造の最終的な数を使用することを計画します。必要に応じて、より大きな構造の場合は、構造が壊れないように1 mLピペットチップの端を切断します。すべてのステップで、3D構造の沈降が長すぎる場合は、室温(RT)で5分間、50 × g で細胞を穏やかに回転させることができます。調査する問題に応じて、遠心分離は3D構造の形状を損なう可能性があるため、このようなスピニングステップの利点/欠点を考慮する必要があります。>100 × gでの回転は避けてください。 1. 3次元細胞培養モデルの収集と固定 注意: チューブの壁に緩く取り付けられるだけの3D構造を吸引しないように注意してください。 マトリックスに埋め込まれた3D細胞培養モデルの収集注:このセクションでは、マウスエンゲルブレス-ホルム-スウォーム肉腫(BME)からの基底膜抽出物の滴で成長した3D構造の回復について説明しますが、他のマトリックスに適合させることができます。ECMに関する重要なポイントについては、ディスカッションを参照してください。3Dマトリックスを乱すことなく、ウェルから培地を除去します。1 mLピペットチップの内側と外側をタンパク質(以下、 プレコート 1 mLチップと呼びます)の0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)にリン酸緩衝生理食塩水(以下、 PBS-BSA0.1% 溶液と呼びます)に浸し、この溶液1 mLを上下に2回ピペッティングします。注意: このプレコーティングは、細胞が先端に付着するのを防ぎ、損失を最小限に抑えます。 PBS-BSA 0.1%溶液を充填し、チューブを空にすることで、遠心分離機(15 mL)チューブ(以下、プレコート遠心チューブと呼びます)の内部にタンパク質を プレコート します。注意: これにより、細胞がチューブに付着するのを防ぎ、損失を最小限に抑えます。 プレコートされた1 mLチップを使用して、1 mLの氷冷1x PBSを使用してウェルの3D構造を注意深く再懸濁し、3D構造を含む懸濁液をプレコート遠沈管に静かに移します。 氷冷した1x PBS13 mLを穏やかに加え、3D構造を氷上に少なくとも10分間沈降させます。注:必要に応じて、4°Cで50 × g で5分間回転します。 >100 × gの回転は、3D構造の形状を損なうため、避けてください。 上清を取り除きます。プレコートされた1 mLチップを使用して、3D構造を1 mLの氷冷1x PBSに静かに再懸濁します。手順1.1.4〜1.1.5を繰り返して、3Dマトリックス残渣のない均質なペレットを取得します。注:効率的なマトリックス除去は、マトリックスの種類、3D構造の数、サイズに影響され、さまざまな培養条件に合わせて最適化する必要があります。BMEで成長した3D構造の場合、マトリックス除去からの回復には通常45〜60分かかります。 プレコートされた1 mLチップを使用して、3D構造を含む1 mL 1x PBS懸濁液をプレコートされた1.5 mL遠沈管に移し、セクション1.3に進みます。 フローティング3D細胞培養モデルの収集プレコートされた1 mLチップを使用して、3D構造を注意深く収集し、プレコートされた1.5 mL遠沈管に移します。3D構造を沈降させるか、RTで50 × g で5分間回転させます。 上清を取り除きます。プレコートされた1 mLチップを使用して、1 mLの1x PBSで3D構造を再懸濁します。セクション1.3に進みます。 3D細胞培養モデルの固定3D構造物を堆積させます。上清を慎重に取り除きます。ドラフトフードの下で、プレコートされた1 mLチップを使用して、3D構造を1 mLのホルマリンに静かに再懸濁します。注:ホルマリンには危険なホルムアルデヒドが含まれています。化学フードで化学物質を操作します。ゴム手袋と安全アイゴーグルを着用してください。 3D構造をRTで30分間インキュベートします。注:ホルマリンによる30分の固定ステップは、広範囲の3D構造(サイズ、形状、および起源が異なる)の免疫染色に必要です。ただし、一般に、より長い固定時間(>3時間)は、レポータータンパク質の蛍光を保存するのに適しています。 3D構造を沈降させるか、RTで50 × g で5分間回転させます。 ホルマリンを静かに除去し、1 mLの1x PBSと交換します。この洗浄ステップを1x PBSで2回繰り返します。サンプルを4°Cで保存し、セクション2またはセクション3に進みます。注:プロトコルはここで一時停止することができ、細胞は長期保存(>1年)のために4°Cに維持することができます。 2.3D 3D細胞培養モデルのホールマウント染色、イメージング、解析 注:オルガノイドはチューブ壁に緩く付着しているため、試薬の変更後にサンプルが失われる可能性があるため、オルガノイドは穏やかに取り扱ってください。開始する前に、染色のための正しいコントロールが利用可能であることを確認してください。ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールは、目的のタンパク質がそれぞれ過剰発現または存在しないことが知られている細胞であり得る。一次抗体を含まないサンプルをインキュベートして、観察されたシグナルが二次抗体の非特異的結合によるものであるかどうかを判断します。一部の細胞は高レベルの自己蛍光を示す傾向があるため、二次抗体を含まないコントロールを使用して、観察された蛍光がバックグラウンドの自家蛍光に由来するかどうかを判断します。免疫標識と蛍光レポーターの可視化を組み合わせることができます。 3Dホールマウント染色1x PBSに0.1%〜1%の非イオン性界面活性剤( 材料の表を参照)、1%ジメチルスルホキシド、1%BSA、および1%のロバ血清(または二次抗体を産生させた動物から)を補充することにより、透過処理遮断(PB)溶液を調製します。注:ターゲットの局在に応じて、非イオン性界面活性剤の濃度を慎重に最適化します:膜(0-0.5%)、細胞質(0.5-1%)、および核(1%)。この溶液は、4°Cで最大1ヶ月間保存できます。BSAは通常、ブロッキングステップに適していますが、バックグラウンドノイズが高い場合は、経験的テストを実行して、抗体の特定の組み合わせに対して可能な限り最良の結果を取得します。 プレコートされた1 mLチップを使用して、オルガノイドを1.5 mL遠沈管から0.5 mLチューブに移します。オルガノイドを沈降させ、1x PBSを静かに除去し、0.5 mLのPB溶液と交換します。オルガノイドを穏やかな水平攪拌(30〜50 rpm)でRTで1時間インキュベートします。 オルガノイドを沈降させ、PB溶液を穏やかに除去し、1 mL PBS-BSA 0.1%で3分間2回洗浄します。注意: 3分間待つと、構造がチューブの底に沈殿する可能性があります。 PBS-BSAを0.1%穏やかに除去し、適切な濃度に希釈した一次抗体250 μLをPB:1x PBS(1:10)溶液に加えます。10 mL の PB:1x PBS (1:10) 溶液を調製するには、1 mL の PB 溶液を 9 mL の 1x PBS で希釈します。4°Cで穏やかな水平攪拌(30〜50 rpm)で2〜3日間インキュベートします。注:3D構造は大きなサイズに達することがあるため、適切な抗体のインキュベーション時間は適切な抗体の浸透に不可欠です。 オルガノイドを沈降させ、一次抗体溶液を穏やかに除去します。PBS-BSA 0.1%で5回洗浄し、1回の洗浄で3分間洗浄し、次に1 mL PBS-BSAで2回、洗浄ごとに15分間、穏やかな水平攪拌を行います。 PB:1x PBS(1:10)溶液中で1:250で希釈した二次抗体250 μLを追加します。穏やかな水平攪拌(30-50 rpm)で4°Cで24時間インキュベートします。このステップでは、サンプルを光から保護します。 PB:1x PBS(1:10)溶液で1:1000に希釈した250 μLのHoechst 33342(20 μMストック溶液)を加え、穏やかな水平攪拌(30-50 rpm)で4°Cでさらに2時間インキュベートします。 オルガノイドを沈降させ、二次抗体+ Hoechst 33342を含む溶液を静かに除去します。オルガノイドを1 mLの1 mLの1x PBSで3分間洗浄し、次に1 mLの1x PBSで2回、1回の洗浄で15分間、穏やかな水平攪拌(30〜50 rpm)で洗浄します。注意: バックグラウンドノイズや信号の損失を避けるために、サンプルを広範囲に洗浄することが重要です。 画像取得までサンプルを4°CでPBSに保存します。セクション2.2に進みます。注:プロトコルはここで一時停止することができ、サンプルは光から保護されて4°Cで数ヶ月間保存することができます。 共焦点イメージングのためのサンプル調製プレコートされた1 mLチップを使用して、96ウェルの黒色ポリスチレンマイクロプレートでウェルあたり50 μLの1x PBSにオルガノイドを注意深く移します。手順 2.2.3 またはセクション 2.3 に進みます。注:この段階では、サンプルを光から保護し、4°Cで数週間保存できます。 消去注:透明化ステップはオプションであり、オルガノイドの免疫標識または内因性蛍光の検出に使用できます。クリアリングは3D構造の収縮を引き起こす可能性がありますが、大きなルーメンを持つ球状の単層オルガノイドを除いて、一般的な形態は変化しません4。これらの嚢胞性オルガノイドについては、透明化工程をスキップし、深部組織イメージングを行う6。50%v/vグリセロール、11%v/vの蒸留水、および45%w/vフルクトースを含む2.5Mグリセロール-フルクトース透明溶液を、溶液が完全に可溶化して均質になるまで少なくとも一晩マグネチックスターラーで混合することにより調製します。暗所で4°Cで最大1か月間保管します。 オルガノイドに触れずに、できるだけ多くの1x PBSを除去します。末端を取り除いた後、1 mLのピペットチップを使用して200 μLの透明化溶液を加え、気泡の形成を防ぐために穏やかに再懸濁します。RTで少なくとも12時間インキュベートし、セクション3に進みます。注:清澄液は粘性があるため、少量を扱うのは困難です。取り扱いを容易にするために、溶液がRTにあることを確認し、ゆっくりとピペットで動かします。最適な透明化のために、イメージングの前に、サンプルを透明化溶液に少なくとも24時間沈降させます。取得時に3D構造が浮いている場合は、RTで<100 × g で10分間オプションのスピンを実行するか、さらに時間(1〜数日)待って堆積させます。プロトコルは、光から保護され、4°C(数週間)または-20°C(数ヶ月間)で保存されている場合、イメージングに進む前にこのステップで一時停止できます。 画像の取得と解析注:3D構造を画像化するには、画像セクショニング技術が必要になります。共焦点顕微鏡を使用し、空気と比較して開口数(NA)の高い液浸対物レンズを優先します。3D構造のサイズ、画像再構成(スティッチング)、および分析に使用するソリューションに応じて、倍率対物レンズ(10倍、20倍、40倍)を選択します。 取得モードを選択するときは、Zスタッキングのステップを定義するために使用される対物レンズの焦点深度を考慮してください。最適な3Dレンダリングを可能にします。注:画像解析ソリューションはさまざまであり、使用するソフトウェアに合わせて解析を調整する必要があります。たとえば、この分析プロトコルは、ハイコンテント分析ソフトウェア(詳細については、 材料の表 と 補足図1 を参照)で確立され、3D再構成オブジェクト内のオブジェクトのセグメンテーション、プロパティの計算、および細胞集団の選択に関するデータを提供します。 3. 3D細胞培養モデルの2Dセクショニング、染色、イメージング、解析 注:3D細胞培養モデルのサイズはさまざまです。パラフィンの効率的な包埋のためにセクション3.1または3.2に進みます(図2)。洗浄や試薬交換の前に、3D構造の沈降に十分な時間を取ってください。チューブの底に浮かぶオルガノイドを吸引しないように注意してください。パラフィン包埋については、 図2 を参照してください。 大型(Ø ≥ 400 μm)3D細胞培養モデルのパラフィン包埋包埋の前日に、パラフィン(パラフィン浴)を満たした2つの150mLフラスコ、サンプルごとに小さな金属包埋型、および細かい鉗子を65°Cに予熱した。 プレコートされた1 mLチップを使用して、1x PBSのオルガノイドを、ポリテトラフルオロエチレンで裏打ちされたボトルキャップ付きの平底ガラスチューブに慎重に移します。オルガノイドを沈降させ、1x PBSを注意深く除去し、70%エタノールと交換します。少なくとも30分間インキュベートします。 オルガノイドを沈降させ、70%エタノールを注意深く除去する。すぐに使用できるエオジンY溶液1mLと交換してください。チューブをフリックし、少なくとも30分間染色します。エオジン溶液を慎重に除去し、1 mLの100%エタノールで3回連続洗浄してオルガノイドをそれぞれ~30分間脱水します。注意: 可燃性で揮発性の液体であるエタノールは、重度の眼および気道の炎症を引き起こします。ヒュームフードで操作し、保護アイゴーグルを着用してください。 100%エタノールを慎重に除去し、ケミカルフードの下で、1 mLのキシレンで3回連続洗浄し、それぞれ~30分間オルガノイドを除去します。注意: キシレンは有毒な液体可燃性であり、その蒸気は刺激を引き起こす可能性があります。ヒュームフードで操作します。皮膚に直接触れないようにし、ゴム手袋と保護眼鏡を着用してください。 化学フードの下で、カセットのコンパートメントの1つの内側に生検パッド(以前はキシレンに浸していた)を配置して、白いマイクロツイン組織カセットを準備します。プレコートされた2 mLプラスチックパスツールピペットを使用して、3D構造を生検パッドに慎重に移します。オルガノイドが動かないようにキシレンに浸した別の生検パッドでそれらを覆い、カセットを閉じます。 複数のサンプルが処理される場合は、カセットをキシレン浴に入れて、さらなる処理を待ちます。すべてのサンプルをカセットに移したら、カセットを予熱したパラフィンバスに65°Cで30分間入れます。 カセットを新鮮な予熱パラフィンバスに一晩移します。 パラフィン含浸後、予熱した埋め込み型を取り、加熱したパラフィンを加えます。3D構造を含む生検パッドを型に入れ、すべてのオルガノイドが型底に落ちるまでゆっくりと攪拌します。予熱した細かい鉗子を使用して、金型の中央に3D構造を非常に慎重に配置します。セクション3.3に進みます。注意: 鉗子で3D構造を乱さないように注意してください。押しますが、つままないでください。 小型(Ø ≤ 400 μm)3D細胞培養モデルのパラフィン包埋包埋の前日に、パラフィン(パラフィン浴)を満たした2つの150mLフラスコ、サンプルごとに小さな金属包埋型、および細かい鉗子を65°Cに予熱した。 1x PBSをオルガノイド懸濁液から慎重に取り外します。1 mLの1xトリス緩衝生理食塩水(TBS)で3回の洗浄を穏やかに行います。オルガノイドに触れずにできるだけ多くの1x TBSを除去します。注意: サンプルを吸引しないように注意してください。必要に応じて、RTで50 x gで5分間スピンを実行します。 残りの微量のリン酸塩は、次のステップを妨げ、特にゲル重合を妨げます。したがって、処理ステップ中にPBSソリューションを使用しないでください。このステップでは、カセット、試薬#1(透明液)、および試薬#2(着色液)を含む市販のキットを使用して、小さな断片を失うことなくパラフィン包埋手順を容易にしました( 材料の表を参照)。キットの指示に従ってください。カセットは、すでに所定の位置にバッキングペーパーとボードインサートで事前に組み立てられています。 試薬#2を2滴チューブに加え、チューブを軽くたたいて穏やかに混ぜます。試薬#1を2滴加え、軽くたたいてもう一度混ぜてゲルを固めます。細かい鉗子を使用して、チューブからゲルを取り出し、カセットのウェルに入れます。 ヒュームフードの下で、次のようにカセットを連続した浴に入れてサンプルを脱水します(150 mLフラスコを使用し、各浴に新鮮なエタノールまたはキシレンを使用します):エタノール70%、30分;エタノール96%、30分;エタノール100%、3回の洗浄、各30分;キシレン、3回の洗浄、各30分。 カセットを予熱したパラフィン浴に65°Cで30分間入れ、新鮮な予熱したパラフィン浴に一晩移します。パラフィン含浸後、予熱した埋め込み型を取り、加熱したパラフィンを加えます。カセットを開き、細かい鉗子でゲルを慎重に取り除き、3D構造を含むゲルを埋め込み型の中心に置きます。セクション3.3に進みます。 パラフィン包埋の一般的な手順金型を冷たい場所にそっと移して、パラフィンを薄層に固化させ、3D構造を適切な位置に維持します。金型の上にティッシュカセットを追加し、このプラスチックカセットを覆うためにホットパラフィンを追加します。完全に固まったら金型を取り外し、セクション3.4に進みます。注意: パラフィンブロックは室温で何年も保存できます。 図2:大小のin vitro 3D細胞培養モデルのパラフィン包埋手順の概要。(A)パラフィン包埋の標準的な手順。固定および脱水後、3D構造をエオジンで染色して視覚化を容易にします(左上と左下)。3D構造は、2 mLパスツールピペット(中央)を使用して、カセットの生検パッド(青)に注意深く配置されます。パラフィン含浸後、3D構造を鉗子を使用して流動パラフィンに穏やかに滴下し、生検パッド内で穏やかに攪拌します。小さな3D構造は、パッドから解放できないため、このステップで失われます(右下:埋め込みに失敗しました)。大きな3D構造のみが埋め込まれます(右上:埋め込みが成功)。矢印は 3D カルチャを指しています。(B)標準的なパラフィン包埋プロトコルの代替。小さな3D構造を固定した後、市販のキットを使用して細胞をゲルに維持し、パラフィン含浸後の金型への細胞の移動を容易にします(右:埋め込みに成功)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 ブロック切片作成と染色標準的なミクロトームを使用して4 μm切片を切断し、標準的な組織学的および免疫組織化学的手法を実行します。セクション3.5に進みます。注意: セクションの接着性を高めるために、特定のスライド( 材料の表を参照)が使用されました。スライドは室温または4°Cで数年間保存できます。 画像の取得と解析デジタルスライドスキャナーまたは正立顕微鏡を使用してイメージングを実行し、3D構造セクション全体にわたって細胞ごとに形態学的および多重化された発現データを報告する高速デジタル定量分析のためのプラットフォームを使用してデータを解析します(詳細については 補足図2 を参照)。注:20倍の対物レンズは、このグループによって日常的に使用されています。